绿色荧光蛋白标记的人血管内皮生长因子165基因重组腺病毒载体的构建

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     目的 构建携带绿色荧光蛋白的高效重组腺病毒载体AdGFP/hVEGF165。方法 应用重组腺病毒构建系统，以细菌内质粒间同源重组法构建复制缺陷型重组腺病毒载体。首先将VEGF165cDNA亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV上，重组穿梭质粒经PmeⅠ酶切线性化后，转入已含有腺病毒骨架载体的BJ5183中。同源重组后，重组的病毒质粒pAdGFP/ hVEGF165经卡那霉素平板筛选获得。经酶切分析鉴定后，重组病毒质粒用PacⅠ酶切线性化，通过脂质体Lipofectamine2000转染人胚肾293细胞。经过包装、扩增和纯化后，测定病毒滴度。结果 重组腺病毒质粒经PacⅠ酶切鉴定，在凝胶电泳中获得诊断性片段，转染的293细胞出现了明显的细胞病变效应。PCR鉴定括增出测定相应的片段。重组腺病毒的滴度为：6×109pfu/m。结论 应用重组腺病毒构建系统，以细菌内质粒间同源重组法可成功地获得重组腺病毒载体AdGFP/hVEGF165，重组腺病毒载体中含有GFP的标记基因可直观检测靶细胞转染和外源基因的表达情况，为今后深入研究VEGF基因治疗奠定实验基础。

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