猪全层皮肤缺损创面新生上皮下细胞增殖与凋亡的动态变化
摘要： 目的 探讨猪皮肤缺损创面新生上皮下细胞增殖与凋亡的动态变化。方法 在6只小型猪的背部各造成6个直径为4cm的圆形全层皮肤缺损创面。在创面形成后当日及6、12、15、20、25、40天，取创面及创面边缘的组织，采用TUNEL法检测细胞凋亡情况，采用Ki67免疫组化染色观察创面内细胞增殖情况。结果 平均创面愈合时间为(24.5±2.1)天。正常真皮内检测不到细胞凋亡； 伤后第12天，创面边缘新生上皮下的凋亡指数(凋亡细胞数/400×视野)增高至3.11±0.266，伤后第25天开始下降，为1.88±0.337； 创面中心的凋亡指数在伤后第20天才明显增高，为2.30±0.258； 伤后第40天(创面愈合后15天)，新生上皮下检测不到细胞凋亡； 伤后12～20天，创面边缘新生上皮下的凋亡指数和创面中心的凋亡指数有明显统计学意义(P<0.01)。伤后第6天开始，创面中心增殖指数(增殖细胞数/400×视野)增高至142.7±14.18，此后逐渐下降； 创面边缘的增殖指数在伤后第6天轻度增高，此后维持在较低水平； 伤后6～20天创面中心增殖指数明显高于创面边缘(P<0.01)。结论 在猪全层皮肤缺损创面愈合过程中，肉芽组织在被新生上皮覆盖后不久，凋亡指数增高，增殖指数降低； 猪全层皮肤缺损创面新生上皮下细胞成分的减少可能与凋亡指数增高和增殖指数下降有关。
关键词： 创面愈合； 组织重建； 细胞凋亡； 增殖
Mechanism of the regression in cellularity under neoepithelium full thickness dermal wounds
LI Jinqing,FU Xiaobing,DU Yiri,et al.
(Department of Plastics and Burns,Tangdu Hospital,Fourth Military Medical University,Xi'an 710038，China)
Abstract： Objective To investigate the mechanism of the regression in cellularity under neoepithelium in minitype pigs' full thickness dermal wounds. Methods After the establishment of fullthickness dermal wounds with the diameter of 4 cm on the back of 6 minitype pigs,the specimens were collected from wound edge and wound center immediately after injury,6,12,15,20, 25 and 40 days later. The specimens were subjected to TUNEL technique to detect apoptosis,to immunohistochemistry of Ki67 to detect proliferative cells. Results The mean healing time was 24.5±2.1 days(±s). Apoptosis was not detected in normal dermis in this experiment;apoptotic index (the number of apoptotic cells per 400 power field) of the tissue under neoepithelium increased to 3.11±0.266 12 days after injury and decreased till 25 days after injury;that in wound center was less than 0.3 from 6 to 15 days after injury and increased to 2.30±0.258 20 days after injury;from 12 to 20 days after injury,there were significant statistical difference between the apoptotic index of the tissue under neoepithelium and that in wound center(P<0.01). Proliferative index (the number of proliferative cells per 400 power field)in wound center increased to 142.7+14.18 on day 6 after injury,then decreased gradually and was 19.2±11.46 on day 20;that under neoepithelium peaked at 14.5±5.25 on day 12 after injury;from 6 to 20 days after injury,there were significant difference between the proliferative index in wound center and that under neoepithelium(P<0.01). Conclusion Shortly after covered by neoepithelium,the Apoptotic Index of granulation tissue increased and the Proliferative Index decreased;regression in cellularity of the tissue under neoepithelium might be due to the increase of Apoptotic Index and the decrease of Proliferative Index.
Key words： wound healing; tissue remodeling; apoptosis; proliferation
在以往的研究中，我们发现在猪全层皮肤缺损创面愈合过程中，新生上皮下存在肉芽组织的改建，表现为细胞成分的减少和胶原纤维的降解和重排[1]。因为病理性瘢痕以组织改建障碍为特点，阐明新生上皮下细胞成分减少的机制，无疑会对病理性瘢痕的治疗提供新的思路[2]。为进一步研究新生上皮下肉芽组织中细胞成分减少的机制，我们设计了此试验，探讨细胞凋亡和细胞增殖在这一过程中的作用。
材料与方法
1 动物模型及取材
6只10～15kg的小型猪，雌雄各半。猪背部剃毛，用碘伏消毒皮肤2次，用直径为4cm的打孔器在猪的背部脊柱两侧各打3个孔。孔中心的间距均为14cm，深及深筋膜浅层。于伤后即刻以及6、12、15、20、25和40天取创面边缘和创面中心的活组织，部分标本10%中性甲醛固定48小时，石蜡包埋； 部分标本-80°C冰箱中保存。6个创面均仅取材1次。
2 实验方法
2.1 原位末端标记法(TUNEL法) 采用原位细胞凋亡检测试剂盒(购自武汉博士德生物工程有限公司，MK1020)，包括标记缓冲液、末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT)、DIGdUTP、封闭液、生物素化抗地高辛抗体、SABC和蛋白酶K。实验步骤按试剂盒说明书进行。细胞核呈棕色者为凋亡细胞。参照Marcus等[2]的方法计算凋亡指数(Apoptotic Index)： 在OLYMPUS BH2型显微镜400倍视野下，对同一标本的8张连续切片的同一位置(新生上皮最前沿后侧1.5mm处新生上皮下的视野)的阳性细胞进行计数，计算平均数，凋亡指数即每400倍视野的平均凋亡细胞数； 创面中心的凋亡指数为同一切片的8个400倍视野内的平均凋亡细胞数。
2.2 增殖指数 参照Marcus等[2]的方法计算增殖指数(Proliferative Index)，具体为： 采用免疫组织化学的方法检测进入细胞增殖周期的细胞，一抗为鼠抗Ki67(北京中山公司)，二抗为HRP标记的羊抗鼠抗体(北京中山公司)，DAB显色，细胞核呈棕黄色者为处于增殖期的细胞； 创面边缘及创面中心增殖细胞的计数方法同凋亡细胞的计数方法，增殖指数即每400倍视野的平均增殖细胞数。
3 统计学方法
采用SPSS11.0统计软件包处理，实验数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验，P值<0.01为有统计学意义。
结果
1 动物模型的建立
创面形成时创面平均面积为： (12.7±1.1)cm2。创面平均愈合时间为： (24.5±2.1)天。肉芽组织于伤后第6～9天长平伤口。
2 凋亡指数
正常皮下组织中及急性创面早期的肉芽组织中，几乎不可见细胞凋亡。伤后第12天，创面边缘新生上皮最前沿后侧约1.5mm视野中的凋亡细胞指数增至3.11±0.266，伤后第25天开始下降。伤后第40天，新生上皮下凋亡指数降至0.05±0.122。伤后第12天，创面中心肉芽组织凋亡细胞开始出现，但数目较少； 伤后第20天增至2.30±0.258。伤后12、15和20天创面边缘的凋亡指数较创面中心高(P<0.01，n=6如图1和图2a、2b所示，见封底)。
3 增殖指数
正常真皮内的增殖细胞数目很少。伤后第6天，创面中心增殖细胞指数迅速升至142.7±14.18，此后逐渐下降，伤后第20天降至19.2±11.46。与创面中心相比，创面边缘的增殖指数于伤后第12天仅轻度增高，为14.5±5.25，此后维持在较低水平。伤后6～25天，创面中心的增殖指数较创面边缘高(P<0.01，n=6如图3和图4a、4b所示，见封底)。
讨论
实验中我们采用Ki 67作为增殖细胞的标记。相对于普遍应用的增殖细胞标记增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)来说，Ki 67在G1、S、G2及M期均高表达，即进入细胞周期的细胞均高表达Ki 67。而PCNA除在上述各期表达外，还在G0期表达。因而就反应增殖细胞的情况来说，Ki 67比PCNA更准确。
Desmouliere等[3](1995年)证实： 在肉芽组织向瘢痕转变的过程中，细胞成分的减少可能与细胞凋亡有关。这一观点得到了很多学者的认同[4]。据此我们推测新生上皮下细胞成分的减少可能也与细胞凋亡有关。实验中我们发现在伤后第12天开始，创面边缘新生上皮最前沿后侧约1.5mm的新生上皮下存在细胞凋亡，每400倍高倍视野内约3个凋亡细胞。而创面中心的凋亡细胞在伤后第20天才明显增多，每400倍高倍视野内约2～3个凋亡细胞。因为在创面边缘，细胞凋亡的增多与细胞成分的减少关系密切，因而我们认为细胞凋亡可能是新生上皮下细胞成分减少的主要原因。
目前，组织重建过程中细胞凋亡的机理尚不清楚。国外已有学者认为肉芽组织重建过程中细胞凋亡可能与细胞外基质的降解有关。如Darby等[5]的研究证明： 在皮瓣诱导肉芽组织细胞成分减少和凋亡细胞增多的同时，存在基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase2，MMP2)和MMP13基因的表达的增高，因而作者认为细胞外基质的过度降解是细胞凋亡的原因之一。另外体内和体外的很多实验证明基质金属蛋白酶活性的升高经常见于细胞凋亡旺盛的部位[6，7]。我们在前期的实验中也观察到新生上皮下细胞成分减少的同时存在细胞外基质的降解和重排[1]。以上证据提示： 新生上皮下的细胞凋亡可能与细胞外基质的降解有关。但是我们应该注意目前已有的证据似乎仅表明基质金属蛋白酶与细胞凋亡的密切关系，细胞外基质的降解与细胞凋亡有无直接关系并无直接证据。即在基质金属蛋白酶是诱导细胞凋亡的因素之一的前提下，它完全有可能通过除降解细胞外基质以外的其他途径来引起细胞凋亡。如Powell等[8]发现，MMP7可以导致细胞表面的可溶性Fas配体(Fas Legend)释放，从而使内皮细胞凋亡增加。
新生上皮下细胞凋亡的增多和增殖细胞数目的减少似乎存在某种关系。它们是由同一诱因导致的两个独立的结果，还是前者引起后者或后者引起前者有待证明。已有证据表明体外培养的细胞缺乏生长因子可以导致增殖细胞数目的减少和细胞凋亡的增多[9-11]。假定新生上皮下细胞凋亡与生长因子的减少有关，那么生长因子减少的机理就很值得探讨。目前很多学者均认为细胞外基质是生长因子储藏库。如转化生长因子β(transforming growth factor,TGFβ)分泌到细胞外后，与TGFβ无活性状态相关肽(latency associated peptide,LAP)和无活性的TGFβ蛋白(latent TGFβbinding proteins,LTBPs)结合形成复合物并锚定到细胞外基质上[12]。细胞外基质的降解可能是这些细胞因子发挥作用所需要的[13]，但过度的降解可能会导致细胞外微环境中细胞因子的降低。因而新生上皮下细胞凋亡的部分机制可能为： 新生上皮或某种未知因素导致其下的MMPs活性增高，引起细胞外基质的降解，随后生长因子含量下降，最终导致增殖指数的降低和凋亡指数的升高。
总之，肉芽组织在被新生上皮覆盖后不久，细胞凋亡的数目增高，而增殖细胞的数目减少； 新生上皮下细胞成分的减少可能与细胞凋亡的增多和增殖细胞的减少有关。现有的证据提示我们新生上皮下细胞凋亡的增多和增殖细胞的减少可能都与基质金属蛋白酶有关，但还需要确切且深入的证据。
参考文献：
[1] 李金清,付小兵, 陈绍宗，等.猪全层皮肤缺损创面愈合过程中新生上皮下肉芽组织的改建[J].中华创伤杂志,2004，20(8):458-462.
[2] Marcus JR,Tyrone JW,Bonowo S,et al.Cellular mechanisms for diminished scarring with aging[J].Plast Reconstr Surg,2000,105:1591-1598.
[3] Desmouliere A,Redard M,Darby I,et al.Apoptosis mediates the decrease in cellularity during the transition between granulation tissue and scar[J].Am J Pathol，1995,146(1):56-66.
[4] 付小兵，王正国.现代高新技术与创面修复[M].北京：人民军医出版社，2002.239-248.
[5] Darby IA，Bisucci T，Pittet B，et al.Skin flapinduced regression of granulation tissue correlates with reduced growth factor and increased metalloproteinase expression[J].J Pathol，2002，197(1):117-127.
[6] Bayer IM，Adamson SL，Langille BL.Atrophic remodeling of the arterycuffed artery[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，1999，19(6):1499-1505.
[7] Damjanovski S，Ishizuya Oka A，Shi YB.Spatial and temporal regulation of collagenases3,4,and stromelysin3 implicates distinct functions in apoptosis and tissue remodeling during frog metamorphosis[J].Cell Res，1999，9(2):91-105.
[8] Powell WC，Fingleton B,Wilson CL,et al.The metalloproteinase matrilysin proteolytically generates active soluble Fas legend and potentiates epithelial cell apoptosis[J].Curr Biol，1999，9:1441-1447.
[9] Englesbe MJ,Hawkins SM,Hsieh PC,et al.Concomitant blockade of plateletderived growth factor receptors alpha and beta induces intimal atrophy in baboon PTFE grafts[J].J Vasc Surg，2004，39(2):440-446.
[10] 付小兵.软组织创伤修复与再生研究的发展方向[J].创伤外科杂志，2004，6(3):237-239.
[11] 付小兵,杨银辉.两种原癌基因激活对肺内源性bFGF和TGFβ表达的影响以及与肺损伤的关系[J].创伤外科杂志，2000，2(2):89-92.
[12] Taipale J,KeskiOja J.Growth factors in the extracellular matrix[J].FASEB J，1997，11:51-59.
[13] Fowlkes JL,Winkler MK.Exploring the interface between metalloproteinase activity and growth factor and cytokine bioavailability[J].Cytokine Growth Factor Rev，2002，13:277-287.
(本文编辑：章洛秋)
基金项目： 国家重点基础研究规划资助项目(G1999054204)
国家自然科学基金面上项目(30170966)
国家自然科学基金重点项目(30230370)
(第四军医大学唐都医院整形烧伤科，西安 710038；解放军304医院全军创伤修复重点实验室，北京 100037；广州军区总医院整形烧伤科，广州 510010), http://www.100md.com(李金清，付小兵，都义日，孙同柱，程飙)
关键词： 创面愈合； 组织重建； 细胞凋亡； 增殖
Mechanism of the regression in cellularity under neoepithelium full thickness dermal wounds
LI Jinqing,FU Xiaobing,DU Yiri,et al.
(Department of Plastics and Burns,Tangdu Hospital,Fourth Military Medical University,Xi'an 710038，China)
Abstract： Objective To investigate the mechanism of the regression in cellularity under neoepithelium in minitype pigs' full thickness dermal wounds. Methods After the establishment of fullthickness dermal wounds with the diameter of 4 cm on the back of 6 minitype pigs,the specimens were collected from wound edge and wound center immediately after injury,6,12,15,20, 25 and 40 days later. The specimens were subjected to TUNEL technique to detect apoptosis,to immunohistochemistry of Ki67 to detect proliferative cells. Results The mean healing time was 24.5±2.1 days(±s). Apoptosis was not detected in normal dermis in this experiment;apoptotic index (the number of apoptotic cells per 400 power field) of the tissue under neoepithelium increased to 3.11±0.266 12 days after injury and decreased till 25 days after injury;that in wound center was less than 0.3 from 6 to 15 days after injury and increased to 2.30±0.258 20 days after injury;from 12 to 20 days after injury,there were significant statistical difference between the apoptotic index of the tissue under neoepithelium and that in wound center(P<0.01). Proliferative index (the number of proliferative cells per 400 power field)in wound center increased to 142.7+14.18 on day 6 after injury,then decreased gradually and was 19.2±11.46 on day 20;that under neoepithelium peaked at 14.5±5.25 on day 12 after injury;from 6 to 20 days after injury,there were significant difference between the proliferative index in wound center and that under neoepithelium(P<0.01). Conclusion Shortly after covered by neoepithelium,the Apoptotic Index of granulation tissue increased and the Proliferative Index decreased;regression in cellularity of the tissue under neoepithelium might be due to the increase of Apoptotic Index and the decrease of Proliferative Index.
Key words： wound healing; tissue remodeling; apoptosis; proliferation
在以往的研究中，我们发现在猪全层皮肤缺损创面愈合过程中，新生上皮下存在肉芽组织的改建，表现为细胞成分的减少和胶原纤维的降解和重排[1]。因为病理性瘢痕以组织改建障碍为特点，阐明新生上皮下细胞成分减少的机制，无疑会对病理性瘢痕的治疗提供新的思路[2]。为进一步研究新生上皮下肉芽组织中细胞成分减少的机制，我们设计了此试验，探讨细胞凋亡和细胞增殖在这一过程中的作用。
材料与方法
1 动物模型及取材
6只10～15kg的小型猪，雌雄各半。猪背部剃毛，用碘伏消毒皮肤2次，用直径为4cm的打孔器在猪的背部脊柱两侧各打3个孔。孔中心的间距均为14cm，深及深筋膜浅层。于伤后即刻以及6、12、15、20、25和40天取创面边缘和创面中心的活组织，部分标本10%中性甲醛固定48小时，石蜡包埋； 部分标本-80°C冰箱中保存。6个创面均仅取材1次。
2 实验方法
2.1 原位末端标记法(TUNEL法) 采用原位细胞凋亡检测试剂盒(购自武汉博士德生物工程有限公司，MK1020)，包括标记缓冲液、末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT)、DIGdUTP、封闭液、生物素化抗地高辛抗体、SABC和蛋白酶K。实验步骤按试剂盒说明书进行。细胞核呈棕色者为凋亡细胞。参照Marcus等[2]的方法计算凋亡指数(Apoptotic Index)： 在OLYMPUS BH2型显微镜400倍视野下，对同一标本的8张连续切片的同一位置(新生上皮最前沿后侧1.5mm处新生上皮下的视野)的阳性细胞进行计数，计算平均数，凋亡指数即每400倍视野的平均凋亡细胞数； 创面中心的凋亡指数为同一切片的8个400倍视野内的平均凋亡细胞数。
2.2 增殖指数 参照Marcus等[2]的方法计算增殖指数(Proliferative Index)，具体为： 采用免疫组织化学的方法检测进入细胞增殖周期的细胞，一抗为鼠抗Ki67(北京中山公司)，二抗为HRP标记的羊抗鼠抗体(北京中山公司)，DAB显色，细胞核呈棕黄色者为处于增殖期的细胞； 创面边缘及创面中心增殖细胞的计数方法同凋亡细胞的计数方法，增殖指数即每400倍视野的平均增殖细胞数。
3 统计学方法
采用SPSS11.0统计软件包处理，实验数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验，P值<0.01为有统计学意义。
结果
1 动物模型的建立
创面形成时创面平均面积为： (12.7±1.1)cm2。创面平均愈合时间为： (24.5±2.1)天。肉芽组织于伤后第6～9天长平伤口。
2 凋亡指数
正常皮下组织中及急性创面早期的肉芽组织中，几乎不可见细胞凋亡。伤后第12天，创面边缘新生上皮最前沿后侧约1.5mm视野中的凋亡细胞指数增至3.11±0.266，伤后第25天开始下降。伤后第40天，新生上皮下凋亡指数降至0.05±0.122。伤后第12天，创面中心肉芽组织凋亡细胞开始出现，但数目较少； 伤后第20天增至2.30±0.258。伤后12、15和20天创面边缘的凋亡指数较创面中心高(P<0.01，n=6如图1和图2a、2b所示，见封底)。
3 增殖指数
正常真皮内的增殖细胞数目很少。伤后第6天，创面中心增殖细胞指数迅速升至142.7±14.18，此后逐渐下降，伤后第20天降至19.2±11.46。与创面中心相比，创面边缘的增殖指数于伤后第12天仅轻度增高，为14.5±5.25，此后维持在较低水平。伤后6～25天，创面中心的增殖指数较创面边缘高(P<0.01，n=6如图3和图4a、4b所示，见封底)。
讨论
实验中我们采用Ki 67作为增殖细胞的标记。相对于普遍应用的增殖细胞标记增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)来说，Ki 67在G1、S、G2及M期均高表达，即进入细胞周期的细胞均高表达Ki 67。而PCNA除在上述各期表达外，还在G0期表达。因而就反应增殖细胞的情况来说，Ki 67比PCNA更准确。
Desmouliere等[3](1995年)证实： 在肉芽组织向瘢痕转变的过程中，细胞成分的减少可能与细胞凋亡有关。这一观点得到了很多学者的认同[4]。据此我们推测新生上皮下细胞成分的减少可能也与细胞凋亡有关。实验中我们发现在伤后第12天开始，创面边缘新生上皮最前沿后侧约1.5mm的新生上皮下存在细胞凋亡，每400倍高倍视野内约3个凋亡细胞。而创面中心的凋亡细胞在伤后第20天才明显增多，每400倍高倍视野内约2～3个凋亡细胞。因为在创面边缘，细胞凋亡的增多与细胞成分的减少关系密切，因而我们认为细胞凋亡可能是新生上皮下细胞成分减少的主要原因。
目前，组织重建过程中细胞凋亡的机理尚不清楚。国外已有学者认为肉芽组织重建过程中细胞凋亡可能与细胞外基质的降解有关。如Darby等[5]的研究证明： 在皮瓣诱导肉芽组织细胞成分减少和凋亡细胞增多的同时，存在基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase2，MMP2)和MMP13基因的表达的增高，因而作者认为细胞外基质的过度降解是细胞凋亡的原因之一。另外体内和体外的很多实验证明基质金属蛋白酶活性的升高经常见于细胞凋亡旺盛的部位[6，7]。我们在前期的实验中也观察到新生上皮下细胞成分减少的同时存在细胞外基质的降解和重排[1]。以上证据提示： 新生上皮下的细胞凋亡可能与细胞外基质的降解有关。但是我们应该注意目前已有的证据似乎仅表明基质金属蛋白酶与细胞凋亡的密切关系，细胞外基质的降解与细胞凋亡有无直接关系并无直接证据。即在基质金属蛋白酶是诱导细胞凋亡的因素之一的前提下，它完全有可能通过除降解细胞外基质以外的其他途径来引起细胞凋亡。如Powell等[8]发现，MMP7可以导致细胞表面的可溶性Fas配体(Fas Legend)释放，从而使内皮细胞凋亡增加。
新生上皮下细胞凋亡的增多和增殖细胞数目的减少似乎存在某种关系。它们是由同一诱因导致的两个独立的结果，还是前者引起后者或后者引起前者有待证明。已有证据表明体外培养的细胞缺乏生长因子可以导致增殖细胞数目的减少和细胞凋亡的增多[9-11]。假定新生上皮下细胞凋亡与生长因子的减少有关，那么生长因子减少的机理就很值得探讨。目前很多学者均认为细胞外基质是生长因子储藏库。如转化生长因子β(transforming growth factor,TGFβ)分泌到细胞外后，与TGFβ无活性状态相关肽(latency associated peptide,LAP)和无活性的TGFβ蛋白(latent TGFβbinding proteins,LTBPs)结合形成复合物并锚定到细胞外基质上[12]。细胞外基质的降解可能是这些细胞因子发挥作用所需要的[13]，但过度的降解可能会导致细胞外微环境中细胞因子的降低。因而新生上皮下细胞凋亡的部分机制可能为： 新生上皮或某种未知因素导致其下的MMPs活性增高，引起细胞外基质的降解，随后生长因子含量下降，最终导致增殖指数的降低和凋亡指数的升高。
总之，肉芽组织在被新生上皮覆盖后不久，细胞凋亡的数目增高，而增殖细胞的数目减少； 新生上皮下细胞成分的减少可能与细胞凋亡的增多和增殖细胞的减少有关。现有的证据提示我们新生上皮下细胞凋亡的增多和增殖细胞的减少可能都与基质金属蛋白酶有关，但还需要确切且深入的证据。
参考文献：
[1] 李金清,付小兵, 陈绍宗，等.猪全层皮肤缺损创面愈合过程中新生上皮下肉芽组织的改建[J].中华创伤杂志,2004，20(8):458-462.
[2] Marcus JR,Tyrone JW,Bonowo S,et al.Cellular mechanisms for diminished scarring with aging[J].Plast Reconstr Surg,2000,105:1591-1598.
[3] Desmouliere A,Redard M,Darby I,et al.Apoptosis mediates the decrease in cellularity during the transition between granulation tissue and scar[J].Am J Pathol，1995,146(1):56-66.
[4] 付小兵，王正国.现代高新技术与创面修复[M].北京：人民军医出版社，2002.239-248.
[5] Darby IA，Bisucci T，Pittet B，et al.Skin flapinduced regression of granulation tissue correlates with reduced growth factor and increased metalloproteinase expression[J].J Pathol，2002，197(1):117-127.
[6] Bayer IM，Adamson SL，Langille BL.Atrophic remodeling of the arterycuffed artery[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，1999，19(6):1499-1505.
[7] Damjanovski S，Ishizuya Oka A，Shi YB.Spatial and temporal regulation of collagenases3,4,and stromelysin3 implicates distinct functions in apoptosis and tissue remodeling during frog metamorphosis[J].Cell Res，1999，9(2):91-105.
[8] Powell WC，Fingleton B,Wilson CL,et al.The metalloproteinase matrilysin proteolytically generates active soluble Fas legend and potentiates epithelial cell apoptosis[J].Curr Biol，1999，9:1441-1447.
[9] Englesbe MJ,Hawkins SM,Hsieh PC,et al.Concomitant blockade of plateletderived growth factor receptors alpha and beta induces intimal atrophy in baboon PTFE grafts[J].J Vasc Surg，2004，39(2):440-446.
[10] 付小兵.软组织创伤修复与再生研究的发展方向[J].创伤外科杂志，2004，6(3):237-239.
[11] 付小兵,杨银辉.两种原癌基因激活对肺内源性bFGF和TGFβ表达的影响以及与肺损伤的关系[J].创伤外科杂志，2000，2(2):89-92.
[12] Taipale J,KeskiOja J.Growth factors in the extracellular matrix[J].FASEB J，1997，11:51-59.
[13] Fowlkes JL,Winkler MK.Exploring the interface between metalloproteinase activity and growth factor and cytokine bioavailability[J].Cytokine Growth Factor Rev，2002，13:277-287.
(本文编辑：章洛秋)
基金项目： 国家重点基础研究规划资助项目(G1999054204)
国家自然科学基金面上项目(30170966)
国家自然科学基金重点项目(30230370)
(第四军医大学唐都医院整形烧伤科，西安 710038；解放军304医院全军创伤修复重点实验室，北京 100037；广州军区总医院整形烧伤科，广州 510010), http://www.100md.com(李金清，付小兵，都义日，孙同柱，程飙)