重组人骨形成蛋白7成熟肽的表达、纯化及活性的研究
Expression, purification and activity of recombinant human bone morphogenetic protein7 mature peptide
LIANG KeMing, ZHU Jing, LI YunFeng, CHEN NanChun, CHEN SuMin
Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Basic Medicine, Fourth Military Medical University, Xian 710033, China
【Abstract】 AIM: To study the expression, purification and activity of the recombinant mature peptide of human bone morphogenetic protein7 (rhBMP7m) consisting of the carboxyl terminal 140 amino residues of hBMP7 for further application. METHODS: hBMP7m cDNA was subcloned into pDH2, a PL containing expression vector. E.coli DH5α was transformed with pDH2B7m and induced by heat. After the washing of the inclusion body, the protein was solubilized in urea and purified efficiently through ionexchange chromatiography. The antigenicity of the expressed protein was confirmed by Western blot. The activity of the expressed protein was confirmed in C2C12K4 cell line, which contained luciferase gene as the reporter special for BMP activity detection. RESULTS: The pDH2B7m plasmid was successfully constructed. The highest expression level of rhBMP7m could be reached after 5h induction at 42℃ and accounted for about 40.3% of the total bacterial proteins. The expressed rhBMP7 was in the inclusion body. After the washing of the inclusion body and sequential ionexchange chromatiography, the purity of rhBMP7m was as least 96.0%. Nonreduced SDSPAGE showed that the renaturation of rhBMP7m after dialysis had rhBMP7m dimer. The activity of the renatured rhBMP7m was detected by the responses of C2C12K4 cell line. CONCLUSION: Highlevel recombinant hBMP7m is successfully expressed in E.coli. The purified and renatured rhBMP7m have good biological activity.
【Keywords】 human bone morphogenetic protein；construction of expression vector； protein purification；analysis of biological activity
【摘要】 目的： 研究重组人骨形成蛋白7(rhBMP7m)羧基端140个氨基酸成熟肽的大肠杆菌表达、纯化及活性，为其实际应用打下基础. 方法: 将编码此成熟肽的cDNA亚克隆入含PL启动子的表达质粒pDH2中,构建表达质粒pDH2B7m，转化大肠杆菌DH5α，温度诱导表达；通过包涵体洗涤、离子交换层析纯化目的蛋白；用Western blot验证透析复性后表达蛋白的抗原性，用含荧光素酶报告基因专门用于检测BMP活性的细胞株C2C12K4检测其活性. 结果：成功构建了PL启动子控制的原核表达载体pDH2B7m；42℃诱导5 h后表达量达到最高水平，约占菌体总蛋白40.3%，表达产物以包涵体形式存在. 包涵体经洗涤、离子交换层析纯化，目的蛋白纯度至少在96.0%以上. Western blot实验证实其抗原性，细胞株C2C12K4反应的检测表明透析复性后的rhBMP7m有较强的活性. 结论：成功地在E.coli中表达了hBMP7m重组蛋白并证明其有较强的生物活性.
【关键词】 人骨形成蛋白；表达载体构建；蛋白质纯化；生物活性分析
0引言
骨形成蛋白7(bone morphogenetic protein7, BMP7)属于TGFβ超家族的成员，最初是作为诱骨活性蛋白被发现的[1]，目前发现它具有多种生物学功能[2-5]. 我室已经成功克隆了人BMP7(hBMP7)成熟肽cDNA[6], 本文在此基础上亚克隆并构建了hBMP7成熟肽的表达载体，利用原核表达系统进行重组人骨形成蛋白7(rhBMP7m)的表达、纯化、复性及活性研究.
1材料和方法
1.1材料①质粒与菌株含有hBMP7m cDNA的重组质粒pGEB7由本实验室构建保存. pDH2表达载体由本实验室构建保存[7].②生化试剂蛋白Marker购自BioLads公司(＃P7702S)、华美生物工程公司(MG0041). 各种限制性内切酶、连接酶和Taq酶均为TaKaRa公司的产品. HRP标记羊抗兔的IgG及化学发光底物购自PIERCE公司. 兔抗rhBMP7 多克隆抗体为本课题组制备. TD20/20 Luminometer (化学发光检测仪) 美国TD公司. HiTrap SP和Q HP柱Pharmacia公司产品. PCR扩增引物序列如下：P1：5＇ CGGAATTCATGTCCACGGGGAGCAAAC 3＇; P2：5＇ GCTCTAGATTAGTGGCAGCCACAGG 3＇. ③细胞C2C12K4细胞株本课题组创建并保存, 国家专利号：ZL 01131813.9.
1.2方法
1.2.1hBMP7成熟肽cDNA的扩增以质粒pGEB7为模板， 按文献[6]方法扩增hBMP7成熟肽片断.
1.2.2重组质粒的构建和序列测定经酶切载体pDH2和PCR产物，通过T4连接酶连接，转化感受态细胞DH5α，筛选阳性克隆，由上海生工生物工程公司测序.
1.2.3菌株的诱导表达将含重组质粒pDH2B7m的大肠杆菌DH5α接种于LB培养基中，30℃摇床培养过夜，次日将过夜培养物以2%的比例转接LB培养基中，30℃摇床培养，A600 nm≈0.4时放入42℃水浴诱导5 h,离心收集沉淀.
1.2.4表达产物的纯化以下所加试剂均指每克湿菌用量. 取经STE (蔗糖100 g/L, TrisHCl 10 mmol/L pH 8.0, EDTA 1 mmol/L)洗涤两次的工程菌，加3 mL STE, 3 mg溶菌酶冰浴1.5 h，然后加5 g/L DOC(脱氧胆酸钠) 0.2 mL, 1 mol/L MgCl2 0.02 mL, 5 g/L DNaseI 4 μL , 室温轻微振荡30 min , 4℃离心收取沉淀. 用3 mL洗涤液(Triton X100 5 g/L, TrisHCl 10 mmol/L pH 8.0, EDTA 1 mmol/L)分散沉淀，超声发生器破菌，4℃离心收取沉淀. 如此洗涤共四次，沉淀即为包涵体. 包涵体用溶液A(8 mol/L尿素、20 mmol/L磷酸钠缓冲液 pH 6.5, 1 mL/L β巯基乙醇)溶解，25℃搅拌过夜，供离子交换层析纯化.
1.2.5离子交换层析纯化HiTrap SP HP阳离子层析柱用溶液A平衡，上样后用0～1 mol/L NaCl溶液A线性梯度洗脱，收集各组分；HiTrap Q HP阴离子层析柱用溶液B(8 mol/L尿素、20 mmol/L磷酸钠缓冲液pH 9.0, 1 mL/L β巯基乙醇)平衡，上样后用0～1 mol/L NaCl溶液B线性梯度洗脱，收集各组分.
1.2.6rhBMP7m蛋白的复性将纯化后的目的蛋白收集液分装在透析袋中，按体积1∶500对溶液C (50 mmol/L醋酸钠pH 4.8缓冲液、2.5 mol/L尿素、140 mmol/L NaCl, 5 μmol/L CuSO4)透析，16℃放置72 h，然后换溶液D (10 mmol/L 醋酸钠pH 4.8缓冲液、50 mmol/L NaCl)透析48 h，期间更换透析外液，去除尿素、β巯基乙醇. 收集透析内液，蛋白定量，并分装冷冻干燥.
1.2.7Western blot分析将纯化后的rhBMP7蛋白样品，经SDSPAGE分离后再电转移至硝酸纤维素膜上. 以5 g/L脱脂奶粉封闭2 h，依次滴加兔抗人hBMP7抗血清(室温2 h, PBS洗3次)及羊抗兔IgGHRP(室温反应1 h, PBS洗涤3次)，最后用化学发光试剂盒于暗室条件下X光片感光显影.
1.2.8细胞培养及荧光素酶活性检测C2C12K4细胞培养及荧光素酶活性检测按文献[6]方法. 细胞培养24 h后，加入DMEM溶解稀释的rhBMP7m，终浓度分别为蛋白浓度0.01, 0.1, 1, 10, 100和1000 ng/mL,每组3孔，对照组仅加等量的培养液.
2结果
2.1hBMP7成熟肽基因的扩增以质粒pGEB7为模板，经两段反应共35个循环，用15 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，获得约420 bp的特异条带，与预期的大小相一致.
图1表达载体pDH2B7m的构建 (略)
2.2重组质粒的构建如Fig 1所示，构建表达载体pDH2B7m. 载体与片段的连接及转化参照《分子克隆》. 酶切分析表明得到阳性克隆. 测序显示扩增的hBMP7成熟肽cDNA序列与预期设计完全一致，EcoRⅠ酶切位点碱基的连接符合设计要求.
2.3目的蛋白的诱导表达携带pDH2B7m重组质粒的E.coli DH5α,温度诱导表达后作SDSPAGE，与对照菌株(未诱导的pDH2B7m/DH5α及诱导的pDH2/DH5α)比较，该菌在Mr为15 400处出现一条明显的新生蛋白带Fig 2A~D. D样品电泳薄层扫描显示，新表达蛋白的条带对应的最大主峰，约占菌体总蛋白的40.3%.
图2rhBMP7m诱导表达和洗涤纯化的SDSPAGE (略)
2.4包涵体的洗涤纯化裂菌后的上清和沉淀分别作SDSPAGE，新表达的蛋白全部存在于沉淀中，说明诱导表达的蛋白以包涵体的形式存在. 洗涤、融解包涵体，对经各洗涤纯化包涵体蛋白作SDSPAGE Fig 2 F~H，结果显示经过4次洗涤，目的蛋白占总蛋白70.66%.
2.5离子交换层析纯化变性蛋白经HiTrap SP HP阳离子层析柱纯化，rhBMP7 在0.15 mol/L NaCl时被洗脱；收集洗脱峰做SDSPAGE，呈多条带，仍有一些杂蛋白(Fig 3B)；通过透析将洗脱液的pH值提高到9.0，进一步通过HiTrap Q HP阴离子层析柱纯化蛋白，收集洗脱峰做SDSPAGE，杂带明显减少(Fig 3A)，纯度大于96%.
2.6rhBMP7m的复性透析除去尿素、β巯基乙醇和盐的过程中，透析内液无沉淀出现，用BCA方法蛋白定量，测蛋白浓度为0.46 mg/mL，冷冻干燥得到白色粉末状蛋白，可溶于生理盐水.
图3重组人骨形成蛋白7单体的表达纯化 (略)
2.7Western blot鉴定以兔抗人BMP7血清进行Western blot，在Mr为30 800处出现1条特异的蛋白带(Fig 4).
2.8rhBMP7的活性检测用不同剂量rhBMP7刺激C2C12K4单克隆细胞，通过测定荧光素酶(Luciferase)活性增加的值发现，Fig 5显示随rhBMP7m剂量的增加，荧光强度增加，100 ng/mL达到最高，较空白对照增加约8倍.
3讨论
BMP7在骨骼的发育和再生修复中发挥关键作用，具有广阔的应用前景. 从骨组织提取BMP材料来源困难、收获量低、纯度不好、重复性差. 所以用基因工程生产BMP成为其临床应用的必然途径. 国外多用CHO, COS等真核细胞表达BMP，其活性虽好，但成本高、产量低[8]. 用大肠杆菌系统去表达、制备BMP是一种比较理想的表达方法，适合工业化生产.
图5rhBMP7m作用C2C12 K4细胞后Luciferase活性测定 (略)
我们选择了pDH2非融合表达载体,它由本课题组陈南春构建[7]，具有一个很强的原核启动子(PR PL),该启动子是指导转录起始的一段DNA序列,受控于温度敏感阻抑物(CI857),后者可在低温下阻抑PL启动子的转录,即该载体表达蛋白质受温度的调控[9].我们将目的基因片段克隆入表达载体pDH2中,温度诱导表达Mr为15 400的rhBMP7m,表达产物占菌体蛋白的40.3%. 本实验选用HiTrap SP和Q HP柱层析纯化rhBMP7m单体. 该技术广泛应用于蛋白质、酶、核酸等的分离纯化并取得较理想效果. 在实验中pH 6.5时用SP柱纯化，蛋白损失少，大部分存在于洗脱峰中. 调整pH至9.0后，通过Q柱层析进一步纯化目的蛋白，目的蛋白纯度达到96.0%，为复性研究提供了基础.
目前国内外对BMP的活性测定基本上还是沿用经典的体内植入法,该方法能从整体观察BMP的真实活性,但实验周期长、不能定量，且结果受多种因素影响. 近年来又发展了一些体外测活方法[10]，但均无突破性进展. 用本课题组建立并获得专利的C2C12K4细胞测定rhBMP7m的活性, 其基本原理是：本课题组所建立的C2C12K4细胞，细胞膜表面有BMP受体，细胞基因组内整合有接受BMP受体传递的信息而表达的luciferase报告基因. 当加入有生物学活性的BMP时，BMP与细胞膜表面的BMP受体相互作用而向细胞发出信号，经信号传导，使荧光素酶表达，能够分解酶的底物发出荧光，荧光的强弱可以反映BMP的生物活性[11]. 用透析复性后的rhBMP7m蛋白进行试验，结果rhBMP7m蛋白浓度在纳克水平(ng/mL)就显示出很明显的活性. 蛋白浓度在100 ng/mL时，荧光强度达到最高，再增加蛋白浓度荧光强度并没有提高，可能是rhBMP7m与细胞膜表面BMP受体结合达到饱和.
【参考文献】
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[6] 王琦，柴玉波，李毅，等. 人骨形成蛋白7成熟肽cDNA的克隆和序列测定 [J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2000;16(3):213-214.Wang Q, Chai YB, Li Y, et al. Cloning and sequencing study of human bone morphogenetic protein7 mature peptide [J]. J Cell Mol Immunol, 2000; 16(3): 213-214.
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[8] Wang EA, Rosen V, DAlessandro JS, et al. Recombinant human bone morphogenetic protein induces bone formation [J]. Proc Natl Sci Acad USA, 1990;87(6):2220-2224.
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[11] 朱帮福,陈苏民,陈南春,等. 部分骨钙素启动子控制荧光素酶基因真核载体的构建及表达 [J]. 第四军医大学学报, 2002；23(22)：2032-2035.Zhu BF, Chen SM, Chen NC, et al. Construction and expression of a eukaryotic plasmid containing luciferase gene regulated by partial promoter of osteocalcin [J]. J Fourth Mil Med Univ, 2002；23(22)：2032-2035.
第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室，陕西 西安 710033
编辑许昌泰, http://www.100md.com(梁克明 朱婧 李云峰 陈南春 陈苏民)
LIANG KeMing, ZHU Jing, LI YunFeng, CHEN NanChun, CHEN SuMin
Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Basic Medicine, Fourth Military Medical University, Xian 710033, China
【Abstract】 AIM: To study the expression, purification and activity of the recombinant mature peptide of human bone morphogenetic protein7 (rhBMP7m) consisting of the carboxyl terminal 140 amino residues of hBMP7 for further application. METHODS: hBMP7m cDNA was subcloned into pDH2, a PL containing expression vector. E.coli DH5α was transformed with pDH2B7m and induced by heat. After the washing of the inclusion body, the protein was solubilized in urea and purified efficiently through ionexchange chromatiography. The antigenicity of the expressed protein was confirmed by Western blot. The activity of the expressed protein was confirmed in C2C12K4 cell line, which contained luciferase gene as the reporter special for BMP activity detection. RESULTS: The pDH2B7m plasmid was successfully constructed. The highest expression level of rhBMP7m could be reached after 5h induction at 42℃ and accounted for about 40.3% of the total bacterial proteins. The expressed rhBMP7 was in the inclusion body. After the washing of the inclusion body and sequential ionexchange chromatiography, the purity of rhBMP7m was as least 96.0%. Nonreduced SDSPAGE showed that the renaturation of rhBMP7m after dialysis had rhBMP7m dimer. The activity of the renatured rhBMP7m was detected by the responses of C2C12K4 cell line. CONCLUSION: Highlevel recombinant hBMP7m is successfully expressed in E.coli. The purified and renatured rhBMP7m have good biological activity.
【Keywords】 human bone morphogenetic protein；construction of expression vector； protein purification；analysis of biological activity
【摘要】 目的： 研究重组人骨形成蛋白7(rhBMP7m)羧基端140个氨基酸成熟肽的大肠杆菌表达、纯化及活性，为其实际应用打下基础. 方法: 将编码此成熟肽的cDNA亚克隆入含PL启动子的表达质粒pDH2中,构建表达质粒pDH2B7m，转化大肠杆菌DH5α，温度诱导表达；通过包涵体洗涤、离子交换层析纯化目的蛋白；用Western blot验证透析复性后表达蛋白的抗原性，用含荧光素酶报告基因专门用于检测BMP活性的细胞株C2C12K4检测其活性. 结果：成功构建了PL启动子控制的原核表达载体pDH2B7m；42℃诱导5 h后表达量达到最高水平，约占菌体总蛋白40.3%，表达产物以包涵体形式存在. 包涵体经洗涤、离子交换层析纯化，目的蛋白纯度至少在96.0%以上. Western blot实验证实其抗原性，细胞株C2C12K4反应的检测表明透析复性后的rhBMP7m有较强的活性. 结论：成功地在E.coli中表达了hBMP7m重组蛋白并证明其有较强的生物活性.
【关键词】 人骨形成蛋白；表达载体构建；蛋白质纯化；生物活性分析
0引言
骨形成蛋白7(bone morphogenetic protein7, BMP7)属于TGFβ超家族的成员，最初是作为诱骨活性蛋白被发现的[1]，目前发现它具有多种生物学功能[2-5]. 我室已经成功克隆了人BMP7(hBMP7)成熟肽cDNA[6], 本文在此基础上亚克隆并构建了hBMP7成熟肽的表达载体，利用原核表达系统进行重组人骨形成蛋白7(rhBMP7m)的表达、纯化、复性及活性研究.
1材料和方法
1.1材料①质粒与菌株含有hBMP7m cDNA的重组质粒pGEB7由本实验室构建保存. pDH2表达载体由本实验室构建保存[7].②生化试剂蛋白Marker购自BioLads公司(＃P7702S)、华美生物工程公司(MG0041). 各种限制性内切酶、连接酶和Taq酶均为TaKaRa公司的产品. HRP标记羊抗兔的IgG及化学发光底物购自PIERCE公司. 兔抗rhBMP7 多克隆抗体为本课题组制备. TD20/20 Luminometer (化学发光检测仪) 美国TD公司. HiTrap SP和Q HP柱Pharmacia公司产品. PCR扩增引物序列如下：P1：5＇ CGGAATTCATGTCCACGGGGAGCAAAC 3＇; P2：5＇ GCTCTAGATTAGTGGCAGCCACAGG 3＇. ③细胞C2C12K4细胞株本课题组创建并保存, 国家专利号：ZL 01131813.9.
1.2方法
1.2.1hBMP7成熟肽cDNA的扩增以质粒pGEB7为模板， 按文献[6]方法扩增hBMP7成熟肽片断.
1.2.2重组质粒的构建和序列测定经酶切载体pDH2和PCR产物，通过T4连接酶连接，转化感受态细胞DH5α，筛选阳性克隆，由上海生工生物工程公司测序.
1.2.3菌株的诱导表达将含重组质粒pDH2B7m的大肠杆菌DH5α接种于LB培养基中，30℃摇床培养过夜，次日将过夜培养物以2%的比例转接LB培养基中，30℃摇床培养，A600 nm≈0.4时放入42℃水浴诱导5 h,离心收集沉淀.
1.2.4表达产物的纯化以下所加试剂均指每克湿菌用量. 取经STE (蔗糖100 g/L, TrisHCl 10 mmol/L pH 8.0, EDTA 1 mmol/L)洗涤两次的工程菌，加3 mL STE, 3 mg溶菌酶冰浴1.5 h，然后加5 g/L DOC(脱氧胆酸钠) 0.2 mL, 1 mol/L MgCl2 0.02 mL, 5 g/L DNaseI 4 μL , 室温轻微振荡30 min , 4℃离心收取沉淀. 用3 mL洗涤液(Triton X100 5 g/L, TrisHCl 10 mmol/L pH 8.0, EDTA 1 mmol/L)分散沉淀，超声发生器破菌，4℃离心收取沉淀. 如此洗涤共四次，沉淀即为包涵体. 包涵体用溶液A(8 mol/L尿素、20 mmol/L磷酸钠缓冲液 pH 6.5, 1 mL/L β巯基乙醇)溶解，25℃搅拌过夜，供离子交换层析纯化.
1.2.5离子交换层析纯化HiTrap SP HP阳离子层析柱用溶液A平衡，上样后用0～1 mol/L NaCl溶液A线性梯度洗脱，收集各组分；HiTrap Q HP阴离子层析柱用溶液B(8 mol/L尿素、20 mmol/L磷酸钠缓冲液pH 9.0, 1 mL/L β巯基乙醇)平衡，上样后用0～1 mol/L NaCl溶液B线性梯度洗脱，收集各组分.
1.2.6rhBMP7m蛋白的复性将纯化后的目的蛋白收集液分装在透析袋中，按体积1∶500对溶液C (50 mmol/L醋酸钠pH 4.8缓冲液、2.5 mol/L尿素、140 mmol/L NaCl, 5 μmol/L CuSO4)透析，16℃放置72 h，然后换溶液D (10 mmol/L 醋酸钠pH 4.8缓冲液、50 mmol/L NaCl)透析48 h，期间更换透析外液，去除尿素、β巯基乙醇. 收集透析内液，蛋白定量，并分装冷冻干燥.
1.2.7Western blot分析将纯化后的rhBMP7蛋白样品，经SDSPAGE分离后再电转移至硝酸纤维素膜上. 以5 g/L脱脂奶粉封闭2 h，依次滴加兔抗人hBMP7抗血清(室温2 h, PBS洗3次)及羊抗兔IgGHRP(室温反应1 h, PBS洗涤3次)，最后用化学发光试剂盒于暗室条件下X光片感光显影.
1.2.8细胞培养及荧光素酶活性检测C2C12K4细胞培养及荧光素酶活性检测按文献[6]方法. 细胞培养24 h后，加入DMEM溶解稀释的rhBMP7m，终浓度分别为蛋白浓度0.01, 0.1, 1, 10, 100和1000 ng/mL,每组3孔，对照组仅加等量的培养液.
2结果
2.1hBMP7成熟肽基因的扩增以质粒pGEB7为模板，经两段反应共35个循环，用15 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，获得约420 bp的特异条带，与预期的大小相一致.
图1表达载体pDH2B7m的构建 (略)
2.2重组质粒的构建如Fig 1所示，构建表达载体pDH2B7m. 载体与片段的连接及转化参照《分子克隆》. 酶切分析表明得到阳性克隆. 测序显示扩增的hBMP7成熟肽cDNA序列与预期设计完全一致，EcoRⅠ酶切位点碱基的连接符合设计要求.
2.3目的蛋白的诱导表达携带pDH2B7m重组质粒的E.coli DH5α,温度诱导表达后作SDSPAGE，与对照菌株(未诱导的pDH2B7m/DH5α及诱导的pDH2/DH5α)比较，该菌在Mr为15 400处出现一条明显的新生蛋白带Fig 2A~D. D样品电泳薄层扫描显示，新表达蛋白的条带对应的最大主峰，约占菌体总蛋白的40.3%.
图2rhBMP7m诱导表达和洗涤纯化的SDSPAGE (略)
2.4包涵体的洗涤纯化裂菌后的上清和沉淀分别作SDSPAGE，新表达的蛋白全部存在于沉淀中，说明诱导表达的蛋白以包涵体的形式存在. 洗涤、融解包涵体，对经各洗涤纯化包涵体蛋白作SDSPAGE Fig 2 F~H，结果显示经过4次洗涤，目的蛋白占总蛋白70.66%.
2.5离子交换层析纯化变性蛋白经HiTrap SP HP阳离子层析柱纯化，rhBMP7 在0.15 mol/L NaCl时被洗脱；收集洗脱峰做SDSPAGE，呈多条带，仍有一些杂蛋白(Fig 3B)；通过透析将洗脱液的pH值提高到9.0，进一步通过HiTrap Q HP阴离子层析柱纯化蛋白，收集洗脱峰做SDSPAGE，杂带明显减少(Fig 3A)，纯度大于96%.
2.6rhBMP7m的复性透析除去尿素、β巯基乙醇和盐的过程中，透析内液无沉淀出现，用BCA方法蛋白定量，测蛋白浓度为0.46 mg/mL，冷冻干燥得到白色粉末状蛋白，可溶于生理盐水.
图3重组人骨形成蛋白7单体的表达纯化 (略)
2.7Western blot鉴定以兔抗人BMP7血清进行Western blot，在Mr为30 800处出现1条特异的蛋白带(Fig 4).
2.8rhBMP7的活性检测用不同剂量rhBMP7刺激C2C12K4单克隆细胞，通过测定荧光素酶(Luciferase)活性增加的值发现，Fig 5显示随rhBMP7m剂量的增加，荧光强度增加，100 ng/mL达到最高，较空白对照增加约8倍.
3讨论
BMP7在骨骼的发育和再生修复中发挥关键作用，具有广阔的应用前景. 从骨组织提取BMP材料来源困难、收获量低、纯度不好、重复性差. 所以用基因工程生产BMP成为其临床应用的必然途径. 国外多用CHO, COS等真核细胞表达BMP，其活性虽好，但成本高、产量低[8]. 用大肠杆菌系统去表达、制备BMP是一种比较理想的表达方法，适合工业化生产.
图5rhBMP7m作用C2C12 K4细胞后Luciferase活性测定 (略)
我们选择了pDH2非融合表达载体,它由本课题组陈南春构建[7]，具有一个很强的原核启动子(PR PL),该启动子是指导转录起始的一段DNA序列,受控于温度敏感阻抑物(CI857),后者可在低温下阻抑PL启动子的转录,即该载体表达蛋白质受温度的调控[9].我们将目的基因片段克隆入表达载体pDH2中,温度诱导表达Mr为15 400的rhBMP7m,表达产物占菌体蛋白的40.3%. 本实验选用HiTrap SP和Q HP柱层析纯化rhBMP7m单体. 该技术广泛应用于蛋白质、酶、核酸等的分离纯化并取得较理想效果. 在实验中pH 6.5时用SP柱纯化，蛋白损失少，大部分存在于洗脱峰中. 调整pH至9.0后，通过Q柱层析进一步纯化目的蛋白，目的蛋白纯度达到96.0%，为复性研究提供了基础.
目前国内外对BMP的活性测定基本上还是沿用经典的体内植入法,该方法能从整体观察BMP的真实活性,但实验周期长、不能定量，且结果受多种因素影响. 近年来又发展了一些体外测活方法[10]，但均无突破性进展. 用本课题组建立并获得专利的C2C12K4细胞测定rhBMP7m的活性, 其基本原理是：本课题组所建立的C2C12K4细胞，细胞膜表面有BMP受体，细胞基因组内整合有接受BMP受体传递的信息而表达的luciferase报告基因. 当加入有生物学活性的BMP时，BMP与细胞膜表面的BMP受体相互作用而向细胞发出信号，经信号传导，使荧光素酶表达，能够分解酶的底物发出荧光，荧光的强弱可以反映BMP的生物活性[11]. 用透析复性后的rhBMP7m蛋白进行试验，结果rhBMP7m蛋白浓度在纳克水平(ng/mL)就显示出很明显的活性. 蛋白浓度在100 ng/mL时，荧光强度达到最高，再增加蛋白浓度荧光强度并没有提高，可能是rhBMP7m与细胞膜表面BMP受体结合达到饱和.
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