鼓膜上皮细胞和成纤维细胞的培养与鉴定
Isolation of pure tympanic membrane epithelial cells and fibroblasts
TIAN YongSheng1, DENG ZhiHong1, WANG JinLing1, JIN Yan2, LIU Yuan2, ZHAO Yu2, LEI Juan2
1Department of Otorhinolaryngology, Xijing Hospital, 2Department of Pathology, College of Stomatology, Fourth Military Medical University, Xian 710033, China
【Abstract】 AIM: To develop a rapid method for the isolation of pure epithelial cells and fibroblasts from tympanic membrane. METHODS: The epithelial cells and fibroblasts were isolated and purified from tympanic membrane by a new twostep method used in our lab. The cells were identified by cell morphorlogy and immunostaining. RESULTS: Our cultured tympanic membrane epithelial cells were of characteristic cobblestone morphology and showed a positive reaction keratin. The fibroblasts cultured were spindleshaped and showed a positive reaction to antibodies against vimentin. The tympanic membrane epithelial cells and fibroblasts cultures of this processing were free of any contaminants. CONCLUSION: Pure tympanicmembrane epithelial cells and fibroblasts can be easily isolated by our method.
【Keywords】 tissue engineering; tympanic membrane; epithelial cells; fibroblasts
【摘要】 目的: 探讨如何以简便快速的方法获得可以用于组织工程鼓膜构建的高纯度的鼓膜上皮细胞和成纤维细胞. 方法: 分离新生豚鼠的鼓膜组织，利用本实验建立的两步组织块培养法获得纯化的鼓膜上皮细胞和成纤维细胞，倒置显微镜观察细胞生长状态，免疫组织化学染色鉴定细胞来源. 结果: 用该方法可以获得纯化的鼓膜上皮细胞和成纤维细胞，细胞产量大，纯度高，鼓膜上皮细胞细胞具有典型的铺路石样形态，成纤维细胞呈梭形生长. 结论: 本实验所建立的两步组织块培养法可以获得大量高纯度的鼓膜上皮细胞和成纤维细胞以用于组织工程鼓膜的构建.
【关键词】 组织工程;鼓膜;上皮细胞;成纤维细胞
0引言
鼓膜穿孔主要由慢性化脓性中耳炎、耳外伤所引起[1]. 目前临床上常采用鼓室成形术进行治疗. 移植材料多选自自体组织，成功率较高[2]，但仍有一定的局限性[3]. 组织工程的发展为此问题的解决提供了新的途径. 种子细胞是组织工程必须首先解决的问题. 为保证获得足量且纯化的鼓膜上皮细胞与成纤维细胞，必须建立可靠的鼓膜上皮细胞与成纤维细胞体外培养扩增技术. 目前国内外该方面的研究尚少. 本研究的目的是探索鼓膜上皮细胞与成纤维细胞的培养扩增方法，为体外构建组织工程鼓膜奠定基础.
1材料和方法
1.1材料新生豚鼠4只(由第四军医大学实验动物中心提供)，胎牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)，无血清角朊细胞培养液(KerationocyteSFM，Gibco)，DMEM(低糖型，Gibco)，胰酶(Gibco)，兔抗鼠角蛋白mAb、兔抗鼠波形纤维蛋白mAb(Takara)，SABC免疫组化试剂盒(DAKO).
1.2方法
1.2.1细胞培养取新出生1～2 d的豚鼠鼓膜，断颈处死后，无菌条件下解剖显微镜下取双侧完整鼓膜，将其剪碎成2 mm×2 mm大小，接种于6孔板，上皮面朝下，每孔内种4块，间距1 cm，每块组织上滴加4滴无血清角朊细胞培养液，其上覆盖2 cm×2 cm盖玻片，轻轻按压排出气泡，30 min后每孔加入2 mL无血清角朊细胞培养液. 置入37℃, 50 mL/L CO2培养箱内培养，每日更换角朊细胞培养液，以获得鼓膜上皮细胞. 约1 wk后将组织块移入另一孔，将培养液换为含100 mL/L胎牛血清DMEM培养液，持续培养以获得鼓膜成纤维细胞. 原代细胞长满70%～80%时，用2.5 g/L胰酶37℃下静置消化2 min，于倒置显微镜下见细胞收缩变圆后，立即加入含100 mL/L胎牛血清DMEM培养液终止消化，以800 r/min离心6 min后，加入培养液，并以玻璃吸管吹打成细胞悬液，进行传代培养. 用细胞计数法测绘细胞生长曲线，并计算细胞倍增时间.
1.2.2细胞状态观察与鉴定倒置显微镜下观察细胞形态和生长状态；采用免疫组织化学方法(ABC法)观察上皮细胞中角蛋白的表达以及成纤维细胞中波形丝蛋白的表达，对上皮细胞与成纤维细胞进行鉴定.
主要步骤：取对数生长期细胞，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液. 将细胞接种于预先放置有盖玻片的6孔培养板中. 于CO2孵箱中培养3 d，细胞长成单层后取出盖玻片，浸入PBS(10 mmol/L pH 7.4)中振荡冲洗3次，以 40 mL/L甲醛固定，滴加正常马血清，置湿盒内30 min，37℃. 弃去马血清滴加特异性抗体(1∶50)，置湿盒内4℃下过夜，滴加生物素化抗体(1∶50)置湿盒内30 min，37℃，然后滴加ABC复合剂，置湿盒内37℃，加新鲜配置的底物溶液，室温下，置5 min. PBS洗，终止显色反映. 显微镜下观察，阳性部位呈棕褐色. 以PBS替代一抗及同一组织片作为自身对照.
2结果
2.1细胞培养倒置显微镜下观察，鼓膜上皮细胞与成纤维细胞大约3 d左右从组织块中爬出，每日更换角朊细胞培养液，成纤维细胞逐渐减少，约1 wk后可见大量上皮细胞，呈典型的铺路石样(Fig 1). 经角朊细胞培养液培养，2次传代后，培养板内未见有成纤维细胞. 将组织块移入另一孔，将培养液换为含100 mL/L胎牛血清DMEM后，见少量上皮细胞及大量成纤维细胞于2 d左右从组织块中爬出. 每日更换DMEM后，上皮细胞逐渐死亡，1 wk后成纤维细胞
图1鼓膜上皮细胞呈短圆梭型或多角形，为典型的呈铺路石样，细胞周围特别是近胞核处可见明显光晕，显示细胞状态良好长满70%~80%，为梭型或多突起，边缘光滑(Fig 2)，未见上皮细胞生长. 以上两种细胞都处于良好的生长状态. 成纤维细胞在传代后第25小时开始分裂增值活跃，呈对数生长. 第6~7日细胞分裂达高峰(Fig 3). 倍增时间为18. 6 h; 传代后上皮细胞在第72小时开始快速增殖，4 d细胞进入平台期,细胞倍增时间为31.2 h. 略
图2-图3 (略)
2.2免疫组织化学结果免疫组织化学染色可见鼓膜上皮细胞中角蛋白阳性反应，表现为胞质的棕黄着色(Fig 4)；成纤维细胞中波形丝蛋白阳性反应，表现为胞质的棕黄着色(Fig 5).
3讨论
鼓膜穿孔为慢性化脓性中耳炎、耳外伤的主要临床表现. 临床上常采用鼓室成形术进行修补. 目前的移植材料多选自自体组织，虽然取得了一定的疗效，但仍存在以下问题：①与鼓膜组织结构存在差异，远期疗效较差；②增加了新的缺损和创伤，增加了患者的痛苦；③自体组织供区有限，不可重复取材[4-6]. 组织工程的发展为此问题的解决提供了新的途径.
图4-图5 (略)
组织工程鼓膜首先应解决种子细胞来源. 为保证获得足量且纯化的鼓膜上皮细胞与成纤维细胞，必须建立可靠的鼓膜上皮细胞与成纤维细胞培养扩增技术. 鼓膜体积小，菲薄，质脆，不易在活体中完整取出[1]，给细胞培养带来一定难度. 组织块法和消化法是两种常用的原代细胞培养方法. 组织块法原理简单，易操作，成功率高，尤其适用于小块组织的培养.而消化法技术难度较高，消化液昂贵，对组织量要求大. 因此在本实验中我们选择了组织块培养法. 同时我们根据鼓膜组织的特点，设计了两步组织块培养法，只需一次原代取材，就可以同时获得纯化的鼓膜上皮细胞和成纤维细胞. 具体方法如下：采用组织块法，在上皮细胞培养液(KerationocyteSFM)环境下培养鼓膜上皮细胞，该细胞大约在3 d左右从组织块爬出，1 wk后待大量上皮细胞爬出后，将组织块移出，加入上皮细胞培养液(KerationocyteSFM)持续培养即可获得纯化的鼓膜上皮细胞；将移出的组织块接种到新的培养板中，更换培养液为含100 mL/L胎牛血清的DMEM，大约2 d后可见少量上皮细胞及大量成纤维细胞爬出，由于含100 mL/L血清的DMEM不适合上皮细胞的生长，上皮细胞逐渐死亡，而成纤维细胞生长良好，最终可获得纯化的成纤维细胞.
本实验通过两步组织块培养法，采用同一块组织利用一次原代培养，培养出了高纯度的鼓膜上皮细胞和成纤维细胞，细胞状态良好. 建立了一套高效率的鼓膜上皮细胞与成纤维细胞的培养体系. 鼓膜上皮细胞和成纤维细胞的培养成功，同时也为构建组织工程鼓膜奠定了良好的基础.
【参考文献】
[1] Laidlaw DW, Costantino PD, Govindaraj S, et al. Tympanic membrane repair with a dermal allograft[J]. Laryngoscope, 2001;111(4 Pt 1):702-707.
[2] Perkins R, Bui HT. Tympanic membrane reconstruction using formaldehydeformed autogenous temporalis fascia: Twenty years experience[J]. Otolaryngol Head Neck Surg, 1996;114(3):366-379.
[3] Ringenberg JC. Closure of tympanic membrane perforations by the use of fat[J]. Laryngoscope, 1978; 88(6):982-993.
[4] Downey TJ, Champeaux AL, Silva AB. AlloDerm tympanoplasty of tympanic membrane perforations[J]. Am J Otolaryngol, 2003; 24(1):6-13.
[5] BenEcke JE Jr. Tympanic membrane grafting with alloderm[J]. Laryngoscope, 2001;111(9):1525-1527.
[6] England RJ, Strachan DR, Buckley JG, et al. Temporalis fascia grafts shrink[J]. J Laryngol Otol, 1997;111(8):707-708.
第四军医大学:1西京医院耳鼻咽喉科,2口腔医学院病理科,陕西 西安 710033
基金项目：国家自然科学基金(30371527)
编辑何扬举, http://www.100md.com(田永胜 邓志宏 王锦玲 金岩 刘源 赵宇 雷娟)
TIAN YongSheng1, DENG ZhiHong1, WANG JinLing1, JIN Yan2, LIU Yuan2, ZHAO Yu2, LEI Juan2
1Department of Otorhinolaryngology, Xijing Hospital, 2Department of Pathology, College of Stomatology, Fourth Military Medical University, Xian 710033, China
【Abstract】 AIM: To develop a rapid method for the isolation of pure epithelial cells and fibroblasts from tympanic membrane. METHODS: The epithelial cells and fibroblasts were isolated and purified from tympanic membrane by a new twostep method used in our lab. The cells were identified by cell morphorlogy and immunostaining. RESULTS: Our cultured tympanic membrane epithelial cells were of characteristic cobblestone morphology and showed a positive reaction keratin. The fibroblasts cultured were spindleshaped and showed a positive reaction to antibodies against vimentin. The tympanic membrane epithelial cells and fibroblasts cultures of this processing were free of any contaminants. CONCLUSION: Pure tympanicmembrane epithelial cells and fibroblasts can be easily isolated by our method.
【Keywords】 tissue engineering; tympanic membrane; epithelial cells; fibroblasts
【摘要】 目的: 探讨如何以简便快速的方法获得可以用于组织工程鼓膜构建的高纯度的鼓膜上皮细胞和成纤维细胞. 方法: 分离新生豚鼠的鼓膜组织，利用本实验建立的两步组织块培养法获得纯化的鼓膜上皮细胞和成纤维细胞，倒置显微镜观察细胞生长状态，免疫组织化学染色鉴定细胞来源. 结果: 用该方法可以获得纯化的鼓膜上皮细胞和成纤维细胞，细胞产量大，纯度高，鼓膜上皮细胞细胞具有典型的铺路石样形态，成纤维细胞呈梭形生长. 结论: 本实验所建立的两步组织块培养法可以获得大量高纯度的鼓膜上皮细胞和成纤维细胞以用于组织工程鼓膜的构建.
【关键词】 组织工程;鼓膜;上皮细胞;成纤维细胞
0引言
鼓膜穿孔主要由慢性化脓性中耳炎、耳外伤所引起[1]. 目前临床上常采用鼓室成形术进行治疗. 移植材料多选自自体组织，成功率较高[2]，但仍有一定的局限性[3]. 组织工程的发展为此问题的解决提供了新的途径. 种子细胞是组织工程必须首先解决的问题. 为保证获得足量且纯化的鼓膜上皮细胞与成纤维细胞，必须建立可靠的鼓膜上皮细胞与成纤维细胞体外培养扩增技术. 目前国内外该方面的研究尚少. 本研究的目的是探索鼓膜上皮细胞与成纤维细胞的培养扩增方法，为体外构建组织工程鼓膜奠定基础.
1材料和方法
1.1材料新生豚鼠4只(由第四军医大学实验动物中心提供)，胎牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)，无血清角朊细胞培养液(KerationocyteSFM，Gibco)，DMEM(低糖型，Gibco)，胰酶(Gibco)，兔抗鼠角蛋白mAb、兔抗鼠波形纤维蛋白mAb(Takara)，SABC免疫组化试剂盒(DAKO).
1.2方法
1.2.1细胞培养取新出生1～2 d的豚鼠鼓膜，断颈处死后，无菌条件下解剖显微镜下取双侧完整鼓膜，将其剪碎成2 mm×2 mm大小，接种于6孔板，上皮面朝下，每孔内种4块，间距1 cm，每块组织上滴加4滴无血清角朊细胞培养液，其上覆盖2 cm×2 cm盖玻片，轻轻按压排出气泡，30 min后每孔加入2 mL无血清角朊细胞培养液. 置入37℃, 50 mL/L CO2培养箱内培养，每日更换角朊细胞培养液，以获得鼓膜上皮细胞. 约1 wk后将组织块移入另一孔，将培养液换为含100 mL/L胎牛血清DMEM培养液，持续培养以获得鼓膜成纤维细胞. 原代细胞长满70%～80%时，用2.5 g/L胰酶37℃下静置消化2 min，于倒置显微镜下见细胞收缩变圆后，立即加入含100 mL/L胎牛血清DMEM培养液终止消化，以800 r/min离心6 min后，加入培养液，并以玻璃吸管吹打成细胞悬液，进行传代培养. 用细胞计数法测绘细胞生长曲线，并计算细胞倍增时间.
1.2.2细胞状态观察与鉴定倒置显微镜下观察细胞形态和生长状态；采用免疫组织化学方法(ABC法)观察上皮细胞中角蛋白的表达以及成纤维细胞中波形丝蛋白的表达，对上皮细胞与成纤维细胞进行鉴定.
主要步骤：取对数生长期细胞，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液. 将细胞接种于预先放置有盖玻片的6孔培养板中. 于CO2孵箱中培养3 d，细胞长成单层后取出盖玻片，浸入PBS(10 mmol/L pH 7.4)中振荡冲洗3次，以 40 mL/L甲醛固定，滴加正常马血清，置湿盒内30 min，37℃. 弃去马血清滴加特异性抗体(1∶50)，置湿盒内4℃下过夜，滴加生物素化抗体(1∶50)置湿盒内30 min，37℃，然后滴加ABC复合剂，置湿盒内37℃，加新鲜配置的底物溶液，室温下，置5 min. PBS洗，终止显色反映. 显微镜下观察，阳性部位呈棕褐色. 以PBS替代一抗及同一组织片作为自身对照.
2结果
2.1细胞培养倒置显微镜下观察，鼓膜上皮细胞与成纤维细胞大约3 d左右从组织块中爬出，每日更换角朊细胞培养液，成纤维细胞逐渐减少，约1 wk后可见大量上皮细胞，呈典型的铺路石样(Fig 1). 经角朊细胞培养液培养，2次传代后，培养板内未见有成纤维细胞. 将组织块移入另一孔，将培养液换为含100 mL/L胎牛血清DMEM后，见少量上皮细胞及大量成纤维细胞于2 d左右从组织块中爬出. 每日更换DMEM后，上皮细胞逐渐死亡，1 wk后成纤维细胞
图1鼓膜上皮细胞呈短圆梭型或多角形，为典型的呈铺路石样，细胞周围特别是近胞核处可见明显光晕，显示细胞状态良好长满70%~80%，为梭型或多突起，边缘光滑(Fig 2)，未见上皮细胞生长. 以上两种细胞都处于良好的生长状态. 成纤维细胞在传代后第25小时开始分裂增值活跃，呈对数生长. 第6~7日细胞分裂达高峰(Fig 3). 倍增时间为18. 6 h; 传代后上皮细胞在第72小时开始快速增殖，4 d细胞进入平台期,细胞倍增时间为31.2 h. 略
图2-图3 (略)
2.2免疫组织化学结果免疫组织化学染色可见鼓膜上皮细胞中角蛋白阳性反应，表现为胞质的棕黄着色(Fig 4)；成纤维细胞中波形丝蛋白阳性反应，表现为胞质的棕黄着色(Fig 5).
3讨论
鼓膜穿孔为慢性化脓性中耳炎、耳外伤的主要临床表现. 临床上常采用鼓室成形术进行修补. 目前的移植材料多选自自体组织，虽然取得了一定的疗效，但仍存在以下问题：①与鼓膜组织结构存在差异，远期疗效较差；②增加了新的缺损和创伤，增加了患者的痛苦；③自体组织供区有限，不可重复取材[4-6]. 组织工程的发展为此问题的解决提供了新的途径.
图4-图5 (略)
组织工程鼓膜首先应解决种子细胞来源. 为保证获得足量且纯化的鼓膜上皮细胞与成纤维细胞，必须建立可靠的鼓膜上皮细胞与成纤维细胞培养扩增技术. 鼓膜体积小，菲薄，质脆，不易在活体中完整取出[1]，给细胞培养带来一定难度. 组织块法和消化法是两种常用的原代细胞培养方法. 组织块法原理简单，易操作，成功率高，尤其适用于小块组织的培养.而消化法技术难度较高，消化液昂贵，对组织量要求大. 因此在本实验中我们选择了组织块培养法. 同时我们根据鼓膜组织的特点，设计了两步组织块培养法，只需一次原代取材，就可以同时获得纯化的鼓膜上皮细胞和成纤维细胞. 具体方法如下：采用组织块法，在上皮细胞培养液(KerationocyteSFM)环境下培养鼓膜上皮细胞，该细胞大约在3 d左右从组织块爬出，1 wk后待大量上皮细胞爬出后，将组织块移出，加入上皮细胞培养液(KerationocyteSFM)持续培养即可获得纯化的鼓膜上皮细胞；将移出的组织块接种到新的培养板中，更换培养液为含100 mL/L胎牛血清的DMEM，大约2 d后可见少量上皮细胞及大量成纤维细胞爬出，由于含100 mL/L血清的DMEM不适合上皮细胞的生长，上皮细胞逐渐死亡，而成纤维细胞生长良好，最终可获得纯化的成纤维细胞.
本实验通过两步组织块培养法，采用同一块组织利用一次原代培养，培养出了高纯度的鼓膜上皮细胞和成纤维细胞，细胞状态良好. 建立了一套高效率的鼓膜上皮细胞与成纤维细胞的培养体系. 鼓膜上皮细胞和成纤维细胞的培养成功，同时也为构建组织工程鼓膜奠定了良好的基础.
【参考文献】
[1] Laidlaw DW, Costantino PD, Govindaraj S, et al. Tympanic membrane repair with a dermal allograft[J]. Laryngoscope, 2001;111(4 Pt 1):702-707.
[2] Perkins R, Bui HT. Tympanic membrane reconstruction using formaldehydeformed autogenous temporalis fascia: Twenty years experience[J]. Otolaryngol Head Neck Surg, 1996;114(3):366-379.
[3] Ringenberg JC. Closure of tympanic membrane perforations by the use of fat[J]. Laryngoscope, 1978; 88(6):982-993.
[4] Downey TJ, Champeaux AL, Silva AB. AlloDerm tympanoplasty of tympanic membrane perforations[J]. Am J Otolaryngol, 2003; 24(1):6-13.
[5] BenEcke JE Jr. Tympanic membrane grafting with alloderm[J]. Laryngoscope, 2001;111(9):1525-1527.
[6] England RJ, Strachan DR, Buckley JG, et al. Temporalis fascia grafts shrink[J]. J Laryngol Otol, 1997;111(8):707-708.
第四军医大学:1西京医院耳鼻咽喉科,2口腔医学院病理科,陕西 西安 710033
基金项目：国家自然科学基金(30371527)
编辑何扬举, http://www.100md.com(田永胜 邓志宏 王锦玲 金岩 刘源 赵宇 雷娟)