p16ink4a_

单启动子双表达体pIRESp16ink4ahRb1的构建及其抑制骨肉瘤细胞增

http://www.100md.com 《创伤外科杂志》 2006年第2期

p16ink4a,,；hRb1；内部核糖体插入位点；细胞周期,材料与方法,1主要实验试剂,2质粒、菌种及细胞株

     摘要：目的应用内部核糖体插入位点(IRES)序列构建单启动子

    双表达穿梭载体质粒pIRESp16ink4ahRb1，导入骨肉瘤MG63细胞株后

    ，在基因和蛋白水平鉴定表达，并观察细胞增殖情况。方法利用基因工

    程技术，将p16ink4a与hRb1全长cDNA编码区依次亚克隆至pIRES载体中，质

    粒构建通过PCR、双酶切与测序鉴定；用Metafectene介导转染骨肉瘤细胞

    株MG63，G418筛选获得抗性克隆，通过RTPCR和Western Blot半定量分

    析外源基因表达；四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法与细胞生长曲线观察细胞增

    殖情况。结果成功构建出含p16ink4a与hRb1全长基因片段的单启动子双

    表达穿梭载体pIRESp16ink4a hRb1，RTPCR及Western Blot检测证实

    p16ink4a、hRb1基因在靶细胞基金和蛋白水平分别有独立表达；并且基因

    导入组细胞生长抑制率均显著上升。结论 pIRES p16ink4ahRb1双顺

    反子穿梭载体的构建与真核细胞导入、目的基因表达成功，为进一步研究

    p16ink4a与hRb1相互关系在细胞周期调控中的作用奠定了基础。

    关键词：；hRb1；内部核糖体插入位点；细胞周期

    Construction and expression of the pIRESp16ink4ahRb1

    bicistronic shuttle vector and its effect on osteosarcoma cell

    proliferation

    LIAO Xiang，YANG Shuhua，SHAO Zengwu，et al.

    (Department of Orthopedic，Union Hospital,Tongji Medical

    Collage,Huazhong university of Science and Technology，Wuhan

    430022,China)

    Abstract： Objective To construct the p16ink4a/hRb1

    bicistronic shuttle vector by internal ribosome entry site(IRES)

    sequence and explore the feasibility of it transferred into and ......

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