对大鼠胸主动脉环舒张机制的研究
[摘 要] 目的：探讨MS23对血管平滑肌的舒张作用及其机制。方法：采用离体血管张力实验方法，观察MS23的舒血管作用。试验共分三组：内皮健在组；去内皮组；L硝基精氨酸(LNAME)组。结果以±s表示。资料分析：组间进行单因素方差分析(F检验)和q检验。统计分析用SPSS 11.5软件。P<0.05为有统计学意义。结果：对同一浓度MS23干预下三组间收缩率无差别(P>0.05)，提示：MS23对大鼠胸主动脉环的舒张作用与内皮功能无关；MS23对大鼠胸主动脉环的舒张作用不受LNAME的影响，即与一氧化氮(NO)无关。结论：MS23对血管环的舒张作用与内皮源性舒张因子(NO)无关；MS23的舒血管作用与内皮细胞的功能无关；MS23可能是一种特异性PDE4抑制剂。
[关键词] MS23；内皮健在；去内皮；L硝基精氨酸；一氧化氮
Effects of MS23 on Isolated Rat Thoracic Aorta
XIANG Xiaojun1， Lü Jiyuan2， ZHANG Mingsheng3，et al
(1.Yuncheng First Aid Center, Yuncheng, Shanxi 044000, China；
2.The First Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan, Shanxi 030001, China；3.Shanxi Medical University, Taiyuan, Shanxi 030001, China)
Abstract:Objective To study the mechanisms of MS23 on vessel smooth muscle cell by means of the observation of MS23 and the combinations of MS23 with endothelium，endotheliumdenuded and NnitroLarginine methylester(LNAME) on high K+contracted the isolated rat thoracic aorta rings and theanalysis of the function of endothelium and NO on this expedment.Methods The effects of the drugs on rat isolated thoracic aortic rings’contraction induced by KCl with different consistencies were observed with MS4000 computer system.The rings were isolated from wistar rats which were 250～280 grams heavy.Results 1.The effect of MS23 on the aortic rings of rats has no business with the function of endothelium.2.LNAME (or NO) does not change the function of MS23 in this experiment.Conclusion The function of endothelium and the role of LNAME or NO do notchange the relaxations of MS23 on the isolated aorticrings from rats.MS23 maybe aspecial PDE4 inhibitor.
Key words：MS23；KCL；Norepinphrine(NE)；Endothelium；Endotheliumdenuded；NnitroLarginine methylester(LNAME)；Nitric oxide(NO)
作为第二信使的环磷酸核苷酸(cAMP和cGMP)在信号传导途径中起着关键的作用。细胞内cAMP和cGMP的水平受腺苷酸环化酶和鸟苷酸环化酶与磷酸二酯酶(phosphodiesterase，PDEs)调节。近年来，PDEs作为新的治疗靶点[1]，研究与开发特异性PDEs抑制剂，引起了众多学者的广泛关注，成为一个新的研究热点。
抑制PDEs的活性可升高平滑肌细胞内cAMP和cGMP的水平，减弱血管的张力，降低血压，增加某一区域的血液供应，改善血液循环。
MS23是美国人工合成的新型的PDEs抑制剂，wang等通过对豚鼠的研究数据显示：MS23能降低血压，改变心脏前负荷。
本试验中，我们通过观察MS23对去内皮或抑制NO合成的血管环作用来探讨这种舒血管作用的机制。
1 材料与方法
1.1 药品与仪器
1.1.1 药品
L硝基精氨酸(NwNitroLarginine methyl ester hydrochloride，LNAME)，美国Sigma公司制造，由北京舒伯韦化工仪器有限责任公司提供，货号N5751。
PSS营养液成分如下(mmol/L)：NaCl 154.7；KCl 5.4；Glucose 11.0；CaCl22.5；Triss 6.0，用HCl调pH至7.4。
1.1.2 仪器
血管平滑肌浴管实验系统、张力换能器(JH2,10 g)、超级恒温浴器(上海市器械厂)、MS4000计算机生物信号采集分析系统。
1.2 实验动物
3个月龄雄性Wistar大鼠，体重250 g～280 g，由山西医科大学试验动物中心提供。
1.3 实验方法
1.3.1 动脉环制备
取Wistar大鼠，断头后立即取胸主动脉置于O2饱和的4 ℃ PSS营养液中。剔除结缔组织，剪成4 mm的血管环。悬挂于浴管内，下方固定，上方以一细钢丝连于张力换能器。经计算机生物信号采集分析系统记录血管的舒缩变化。浴管内为37 ℃、通以100%O2的PSS液10 ml。血管环挂入后，给予2.0 g的前负荷，温浴90 min～120 min。不断调整张力，使之稳定，每20 min换一次营养液。用60 mmol/L KCl多次刺激动脉环，当连续2次引起的收缩幅度差别<10%时，开始试验。
1.3.2 内皮功能对MS23舒血管作用的影响
各组均以对照时70 mmol/L的KCl引起的血管环张力变化值为100%，其他值均与其相比，取百分比值。
1.3.2.1 MS23对内皮健在大鼠胸主动脉环的舒张作用
加入70 mmol/L的KCl，记录并计算出血管环的最大张力变化值，作为对照。洗脱药物，加入某一浓度的MS23(1×107 mmol/L、3×107 mmol/L、1×106 mmol/L、3×106 mmol/L、1×105 mmol/L、3×105 mmol/L、1×104 mmol/L)，孵浴15 min，加入70 mmol/L的KCl，记录并计算出血管环最大的张力变化值，与对照组相比，观察MS23对内皮健在血管环的舒作用。
1.3.2.2 MS23对去内皮大鼠胸主动脉环的舒张作用
取大鼠胸主动脉，用直径与血管内腔相仿的棉棒在血管内穿行2次～3次，去除内皮，切成血管环，稳定后，在加入60 mmol/L的KCl刺激收缩达平台期，加入105 mmol/L的乙酰胆碱，若血管没有舒张，表示血管内皮已完全去除，否则弃之。冲去乙酰胆碱，稳定后，加入70 mmol/L的KCl，记录并计算出血管环最大张力变化值，作为对照。洗脱药物后，加入某一浓度的MS23(1×107 mmol/L、3×107 mmol/L、1×106 mmol/L、3×106 mmol/L、1×105 mmol/L、3×105 mmol/L、1×104 mmol/L)，孵浴15 min，加入70 mmol/L的KCl，记录并计算出血管环最大张力变化值。与对照组相比，观察MS23对去内皮血管环的舒张作用。
1.3.2.3 MS23与L
NAME合用内皮健在大鼠胸主动脉环的舒张作用 血管环稳定后，加入3×105 mmol/L的NO合成酶抑制剂LNAME，孵育15 min，加入70 mmol/L的KCl，记录血并计算出管环最大张力变化值，作为对照。洗脱药物后，加入3×105 mmol/L的LNAME和同一浓度的MS23，孵浴15 min，加入70 mmol/L的KCl，记录并计算出血管环最大张力变化值。与对照组相比，观察MS23与LNAME合用对血管环的舒张影响。
1.4 统计分析
结果均以±s表示。组间对同一浓度的MS23干预下最大收缩率进行单因素方差分析(F检验)和q检验。统计分析用SPSS 11.5。P<0.05为有统计学意义。
2 结果
由表1所示：各组70 mmol/L的KCl对血管环的最大收缩率均随MS23浓度增大而减小。同一浓度MS23时，各组70 mmol/L的KCl对血管环的最大收缩率经单因素方差分析显示：三组间均无统计学意义(P均>0.05)。表1 三组中最大舒张作用时的最高收缩率MS23(略) 注：组间单因素方差分析：P均>0.05。
3 讨论
研究发现，PDEs家族至少包括11种成员，PDE3、4型特异地分解cAMP[2]，主要分布在心肌、血管平滑肌内。PDE4不受cGMP的抑制。PDE3则受cGMP抑制。PDE3、4被抑制时，平滑肌细胞内cAMP增加，促进肌浆网重吸收钙离子(Ca2+)。使细胞内Ca2+浓度下降，平滑肌张力降低，扩张血管[3]。同时，cAMP激活蛋白激酶A，后者抑制肌凝蛋白轻链激酶(MLCK)的激活，抑制平滑肌收缩[4～6]，降低血管阻力，减少回心血量，减轻心脏前、后负荷，改善心功能。
内皮细胞内NO合成酶(NOS)作用于L精氨酸的胍基氮末端产生NO，由于其亲脂性，可透过细胞膜迅速扩散至邻近的血管平滑肌细胞内，作用于鸟苷酸环化酶(GC)，与其亚铁血红素分子中的铁离子结合，形成NOGC复合物，导致构型的改变而激活GC，大量产生cGMP，使平滑肌舒张，故NO的舒血管作用通过升高细胞内cGMP来完成[7，8]。详细机制见图1。
实验结果显示：NO合成酶抑制剂LNAME未能改变MS23对血管环的舒张作用(P>0.05)，说明NO未参与MS23的舒血管作用。提示MS23的舒张血管作用不受NO的影响，即与细胞内cGMP水平的升高无关。在血管平滑肌细胞中有4个PDEs主要成员，包括钙离子/钙调素激活的PDE1、cGMP抑制的PDE3、cAMP特异的PDE4和cGMP特异的PDE5。PDE3和PDE4占VSMC内水解cAMP的PDEs活性的80%以上。以上试验结果提示MS23可能是不受cGMP抑制的PDE4特异性抑制剂。
内皮细胞除分泌舒血管物质外，还分泌缩血管物质如ET1、AngⅡ、TXB2。可见内皮细胞对血管张力的调节具有收缩与舒张的双重作用。
实验中去内皮组和内皮健在组相比，相同浓度的MS23对血管环的舒张作用没有差别(P>0.05)，提示两种可能：去除了内皮细胞的已达平衡的舒张与收缩作用；MS23的舒血管作用不受内皮的影响。
试验结果显示：去内皮组与LNAME组之间也无差别，即单方面抑制内皮细胞的舒血管功能，或完全去除其双向调节作用，MS23减弱血管张力的作用均无改变。提示内皮细胞未参与MS23的舒血管作用。
由此，我们可以得出结论：MS23的舒血管作用主要环节不在于内皮细胞及其所产生的舒血管因子NO，而是通过特异性地抑制血管平滑肌细胞内的磷酸二酯酶4(PDE4)，增加细胞内的cAMP，激活PKA，抑制肌凝蛋白激酶(MLCK)的活化，抑制血管收缩。这种作用机制有别于PDE3抑制剂米力农。然而，MS23对心肌细胞作用如何，对心功能为Ⅳ级病人治疗效果是否优于米力农，尚有待于进一步研究。
4 结论
MS23的舒血管作用与内皮源性舒血管因子NO无关。MS23的舒血管作用与内皮功能无关。MS23可能是一种特异性PDE4抑制剂，通过升高血管平滑肌细胞内cAMP水平来抑制血管收缩。
参考文献：
[1]Palacios JM,Beleta J，Segarra V，et al.Second messenger systems as targets for mew therapeutic agents：focus on selective phosphodiesterase inhibitor[J].Farmaco，1995，150：819827.
[2]Degerman E，Belfrage P，Manganiello VC，et al.Structure，localization and regulation of cGMPinhibited phosphodiesterase(PDE3)[J].JBiol Chem,l997,272：68236826.
[3]Bardou M，Loustalot C，Simon B，et al.Inhibition of uterine contractions human myometrium[J].Therapie，2001，56(3)：21322.
[4]Jenkins IR，Dolman J，O'Connor P，et al.Amrinone versus dobutamine in cardiac surgical patients with severe pulmonary hypertension after cardiopulmonary bypass：A prospective，randomized doubleblinded trial[J].Anaesth Intensive Care，1997，25：245249.
[5]Bardou M，Cortijo J，Loustalot C，et al.Pharmacological and biochemical study on the effects of selective phosphodiesterase inhibitors on human term myometrium[J].Nunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol，1999，360(4)：457463.
[6]Givertz MM，Hare JM，Loh E，et al.Effect of bolus milrinone on hemodynamic variables and pulmonary vascular resistance in patients with severe left ventricular dysfunction：A rapid teSt for reversibility of pulmonary hypertension[J].J Am Coll Cardiol, 1996,28：17751780.
[7]Kharitonov SA，Cailes JB，Black CM,et al.Decreased nitric oxide in the exhaled air of patients with systemic sclerosis with pulmonary hypertension[J].Thorax,1997,52：10511055.
[8]Steudel W，Ichinose F，Huang PL，et al.Pulmonary vasoconstriction and hypertension in mice with targeted disruption of the endothelial nitric oxide synthase(NOS 3)gene[J].Circ Res，l997，81：3441.
1.运城市急救中心，山西 运城 044000；
2.山西医科大学第一医院，山西 太原 030001；
3.山西医科大学，山西 太原 030001, 百拇医药(相晓军，吕吉元，张明升，贾永平)
[关键词] MS23；内皮健在；去内皮；L硝基精氨酸；一氧化氮
Effects of MS23 on Isolated Rat Thoracic Aorta
XIANG Xiaojun1， Lü Jiyuan2， ZHANG Mingsheng3，et al
(1.Yuncheng First Aid Center, Yuncheng, Shanxi 044000, China；
2.The First Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan, Shanxi 030001, China；3.Shanxi Medical University, Taiyuan, Shanxi 030001, China)
Abstract:Objective To study the mechanisms of MS23 on vessel smooth muscle cell by means of the observation of MS23 and the combinations of MS23 with endothelium，endotheliumdenuded and NnitroLarginine methylester(LNAME) on high K+contracted the isolated rat thoracic aorta rings and theanalysis of the function of endothelium and NO on this expedment.Methods The effects of the drugs on rat isolated thoracic aortic rings’contraction induced by KCl with different consistencies were observed with MS4000 computer system.The rings were isolated from wistar rats which were 250～280 grams heavy.Results 1.The effect of MS23 on the aortic rings of rats has no business with the function of endothelium.2.LNAME (or NO) does not change the function of MS23 in this experiment.Conclusion The function of endothelium and the role of LNAME or NO do notchange the relaxations of MS23 on the isolated aorticrings from rats.MS23 maybe aspecial PDE4 inhibitor.
Key words：MS23；KCL；Norepinphrine(NE)；Endothelium；Endotheliumdenuded；NnitroLarginine methylester(LNAME)；Nitric oxide(NO)
作为第二信使的环磷酸核苷酸(cAMP和cGMP)在信号传导途径中起着关键的作用。细胞内cAMP和cGMP的水平受腺苷酸环化酶和鸟苷酸环化酶与磷酸二酯酶(phosphodiesterase，PDEs)调节。近年来，PDEs作为新的治疗靶点[1]，研究与开发特异性PDEs抑制剂，引起了众多学者的广泛关注，成为一个新的研究热点。
抑制PDEs的活性可升高平滑肌细胞内cAMP和cGMP的水平，减弱血管的张力，降低血压，增加某一区域的血液供应，改善血液循环。
MS23是美国人工合成的新型的PDEs抑制剂，wang等通过对豚鼠的研究数据显示：MS23能降低血压，改变心脏前负荷。
本试验中，我们通过观察MS23对去内皮或抑制NO合成的血管环作用来探讨这种舒血管作用的机制。
1 材料与方法
1.1 药品与仪器
1.1.1 药品
L硝基精氨酸(NwNitroLarginine methyl ester hydrochloride，LNAME)，美国Sigma公司制造，由北京舒伯韦化工仪器有限责任公司提供，货号N5751。
PSS营养液成分如下(mmol/L)：NaCl 154.7；KCl 5.4；Glucose 11.0；CaCl22.5；Triss 6.0，用HCl调pH至7.4。
1.1.2 仪器
血管平滑肌浴管实验系统、张力换能器(JH2,10 g)、超级恒温浴器(上海市器械厂)、MS4000计算机生物信号采集分析系统。
1.2 实验动物
3个月龄雄性Wistar大鼠，体重250 g～280 g，由山西医科大学试验动物中心提供。
1.3 实验方法
1.3.1 动脉环制备
取Wistar大鼠，断头后立即取胸主动脉置于O2饱和的4 ℃ PSS营养液中。剔除结缔组织，剪成4 mm的血管环。悬挂于浴管内，下方固定，上方以一细钢丝连于张力换能器。经计算机生物信号采集分析系统记录血管的舒缩变化。浴管内为37 ℃、通以100%O2的PSS液10 ml。血管环挂入后，给予2.0 g的前负荷，温浴90 min～120 min。不断调整张力，使之稳定，每20 min换一次营养液。用60 mmol/L KCl多次刺激动脉环，当连续2次引起的收缩幅度差别<10%时，开始试验。
1.3.2 内皮功能对MS23舒血管作用的影响
各组均以对照时70 mmol/L的KCl引起的血管环张力变化值为100%，其他值均与其相比，取百分比值。
1.3.2.1 MS23对内皮健在大鼠胸主动脉环的舒张作用
加入70 mmol/L的KCl，记录并计算出血管环的最大张力变化值，作为对照。洗脱药物，加入某一浓度的MS23(1×107 mmol/L、3×107 mmol/L、1×106 mmol/L、3×106 mmol/L、1×105 mmol/L、3×105 mmol/L、1×104 mmol/L)，孵浴15 min，加入70 mmol/L的KCl，记录并计算出血管环最大的张力变化值，与对照组相比，观察MS23对内皮健在血管环的舒作用。
1.3.2.2 MS23对去内皮大鼠胸主动脉环的舒张作用
取大鼠胸主动脉，用直径与血管内腔相仿的棉棒在血管内穿行2次～3次，去除内皮，切成血管环，稳定后，在加入60 mmol/L的KCl刺激收缩达平台期，加入105 mmol/L的乙酰胆碱，若血管没有舒张，表示血管内皮已完全去除，否则弃之。冲去乙酰胆碱，稳定后，加入70 mmol/L的KCl，记录并计算出血管环最大张力变化值，作为对照。洗脱药物后，加入某一浓度的MS23(1×107 mmol/L、3×107 mmol/L、1×106 mmol/L、3×106 mmol/L、1×105 mmol/L、3×105 mmol/L、1×104 mmol/L)，孵浴15 min，加入70 mmol/L的KCl，记录并计算出血管环最大张力变化值。与对照组相比，观察MS23对去内皮血管环的舒张作用。
1.3.2.3 MS23与L
NAME合用内皮健在大鼠胸主动脉环的舒张作用 血管环稳定后，加入3×105 mmol/L的NO合成酶抑制剂LNAME，孵育15 min，加入70 mmol/L的KCl，记录血并计算出管环最大张力变化值，作为对照。洗脱药物后，加入3×105 mmol/L的LNAME和同一浓度的MS23，孵浴15 min，加入70 mmol/L的KCl，记录并计算出血管环最大张力变化值。与对照组相比，观察MS23与LNAME合用对血管环的舒张影响。
1.4 统计分析
结果均以±s表示。组间对同一浓度的MS23干预下最大收缩率进行单因素方差分析(F检验)和q检验。统计分析用SPSS 11.5。P<0.05为有统计学意义。
2 结果
由表1所示：各组70 mmol/L的KCl对血管环的最大收缩率均随MS23浓度增大而减小。同一浓度MS23时，各组70 mmol/L的KCl对血管环的最大收缩率经单因素方差分析显示：三组间均无统计学意义(P均>0.05)。表1 三组中最大舒张作用时的最高收缩率MS23(略) 注：组间单因素方差分析：P均>0.05。
3 讨论
研究发现，PDEs家族至少包括11种成员，PDE3、4型特异地分解cAMP[2]，主要分布在心肌、血管平滑肌内。PDE4不受cGMP的抑制。PDE3则受cGMP抑制。PDE3、4被抑制时，平滑肌细胞内cAMP增加，促进肌浆网重吸收钙离子(Ca2+)。使细胞内Ca2+浓度下降，平滑肌张力降低，扩张血管[3]。同时，cAMP激活蛋白激酶A，后者抑制肌凝蛋白轻链激酶(MLCK)的激活，抑制平滑肌收缩[4～6]，降低血管阻力，减少回心血量，减轻心脏前、后负荷，改善心功能。
内皮细胞内NO合成酶(NOS)作用于L精氨酸的胍基氮末端产生NO，由于其亲脂性，可透过细胞膜迅速扩散至邻近的血管平滑肌细胞内，作用于鸟苷酸环化酶(GC)，与其亚铁血红素分子中的铁离子结合，形成NOGC复合物，导致构型的改变而激活GC，大量产生cGMP，使平滑肌舒张，故NO的舒血管作用通过升高细胞内cGMP来完成[7，8]。详细机制见图1。
实验结果显示：NO合成酶抑制剂LNAME未能改变MS23对血管环的舒张作用(P>0.05)，说明NO未参与MS23的舒血管作用。提示MS23的舒张血管作用不受NO的影响，即与细胞内cGMP水平的升高无关。在血管平滑肌细胞中有4个PDEs主要成员，包括钙离子/钙调素激活的PDE1、cGMP抑制的PDE3、cAMP特异的PDE4和cGMP特异的PDE5。PDE3和PDE4占VSMC内水解cAMP的PDEs活性的80%以上。以上试验结果提示MS23可能是不受cGMP抑制的PDE4特异性抑制剂。
内皮细胞除分泌舒血管物质外，还分泌缩血管物质如ET1、AngⅡ、TXB2。可见内皮细胞对血管张力的调节具有收缩与舒张的双重作用。
实验中去内皮组和内皮健在组相比，相同浓度的MS23对血管环的舒张作用没有差别(P>0.05)，提示两种可能：去除了内皮细胞的已达平衡的舒张与收缩作用；MS23的舒血管作用不受内皮的影响。
试验结果显示：去内皮组与LNAME组之间也无差别，即单方面抑制内皮细胞的舒血管功能，或完全去除其双向调节作用，MS23减弱血管张力的作用均无改变。提示内皮细胞未参与MS23的舒血管作用。
由此，我们可以得出结论：MS23的舒血管作用主要环节不在于内皮细胞及其所产生的舒血管因子NO，而是通过特异性地抑制血管平滑肌细胞内的磷酸二酯酶4(PDE4)，增加细胞内的cAMP，激活PKA，抑制肌凝蛋白激酶(MLCK)的活化，抑制血管收缩。这种作用机制有别于PDE3抑制剂米力农。然而，MS23对心肌细胞作用如何，对心功能为Ⅳ级病人治疗效果是否优于米力农，尚有待于进一步研究。
4 结论
MS23的舒血管作用与内皮源性舒血管因子NO无关。MS23的舒血管作用与内皮功能无关。MS23可能是一种特异性PDE4抑制剂，通过升高血管平滑肌细胞内cAMP水平来抑制血管收缩。
参考文献：
[1]Palacios JM,Beleta J，Segarra V，et al.Second messenger systems as targets for mew therapeutic agents：focus on selective phosphodiesterase inhibitor[J].Farmaco，1995，150：819827.
[2]Degerman E，Belfrage P，Manganiello VC，et al.Structure，localization and regulation of cGMPinhibited phosphodiesterase(PDE3)[J].JBiol Chem,l997,272：68236826.
[3]Bardou M，Loustalot C，Simon B，et al.Inhibition of uterine contractions human myometrium[J].Therapie，2001，56(3)：21322.
[4]Jenkins IR，Dolman J，O'Connor P，et al.Amrinone versus dobutamine in cardiac surgical patients with severe pulmonary hypertension after cardiopulmonary bypass：A prospective，randomized doubleblinded trial[J].Anaesth Intensive Care，1997，25：245249.
[5]Bardou M，Cortijo J，Loustalot C，et al.Pharmacological and biochemical study on the effects of selective phosphodiesterase inhibitors on human term myometrium[J].Nunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol，1999，360(4)：457463.
[6]Givertz MM，Hare JM，Loh E，et al.Effect of bolus milrinone on hemodynamic variables and pulmonary vascular resistance in patients with severe left ventricular dysfunction：A rapid teSt for reversibility of pulmonary hypertension[J].J Am Coll Cardiol, 1996,28：17751780.
[7]Kharitonov SA，Cailes JB，Black CM,et al.Decreased nitric oxide in the exhaled air of patients with systemic sclerosis with pulmonary hypertension[J].Thorax,1997,52：10511055.
[8]Steudel W，Ichinose F，Huang PL，et al.Pulmonary vasoconstriction and hypertension in mice with targeted disruption of the endothelial nitric oxide synthase(NOS 3)gene[J].Circ Res，l997，81：3441.
1.运城市急救中心，山西 运城 044000；
2.山西医科大学第一医院，山西 太原 030001；
3.山西医科大学，山西 太原 030001, 百拇医药(相晓军，吕吉元，张明升，贾永平)