电针对脑缺血再灌注损伤的治疗作用
摘要：目的 探讨电针对脑缺血再灌注损伤的治疗作用。方法 用改良的血管内栓线技术制造大鼠局灶性脑缺血与再灌注模型，应用免疫组织化学技术检测脑组织中的nNOS阳性神经元的表达。电针穴位选择“水沟”“承浆”穴。结果 ①脑缺血再灌注组nNOS阳性神经元在大脑皮层和海马CA1区、CA3区大量表达，与正常对照组相同脑区比较有显著性差异(P<0.05)；②电针能显著减少脑缺血再灌注损伤中nNOS阳性神经元在大脑皮层和海马CA1区、CA3区的表达，与缺血再灌注组相同脑区比较有显著性差异(P<0.05)。结论 电针能显著减少脑缺血再灌注损伤中神经元的丢失。
关键词：电针;缺血再灌注;一氧化氮合酶;大鼠
The Effect of Electroacupuncture on Cerebral Ischemiareperfusion Injury
CHEN Shixin，LI Jianxiong，HOU Jian
(Department of Biomedical Engineering,Xianning College,Xianning Hubei 437100,China)
ABSTRACT:Objective To study the effect of electroacupuncture on cerebral ischemiareperfusion(IR) injury. Methods Modified intravascular embolism method was employed to make focal brain ischemia in rats.Immunohistochemical method was used to detect the expression of nNOS in brain.The acupuncture point of ‘Shui gou’and‘Chenjiang’ were adopted.Results ①Compared with the normal group,the expression of nNOS could be remarkably enhanced in the cortex of brain and the CA1 and CA3 of hippocampus after cerebral IR(P<0.05). ②Compared with the IR group, the expression of nNOS could be signifcantly reduced after electroacupuncture(P<0.05). Conclusion Electroacupuncture can decrease the lose of neurons in cerebral ischemiareperfusion injury.
KEY WORDS：Electroacupuncture;Injury;Nitric oxide synthase;Rat
随着分子神经生物学的进展,针刺作用的机制已成为众多学者关注的焦点。过去认为脑缺血缺氧仅引起神经元坏死,近年日益增多的证据表明神经元凋亡是缺血引起神经元丢失的一种重要形式[1]。本实验以nNOS为指标，观察经电针治疗脑缺血再灌注损伤后，各脑区nNOS阳性神经元的表达情况。
1 材料和方法
1.1 动物分组
健康成年SD大鼠30只(华中科技大学同济医学院实验动物中心提供)，体重180~250g，雌雄不拘，随机分为正常对照组(N)、脑缺血再灌组(M)、脑缺血再灌加电针组(IA)，每组10只。
1.2 脑缺血模型的制备
大鼠自由饮食、饮水，腹腔注射10%水合氯醛 (3ml/kg) 麻醉,颈部脱毛后仰卧位固定于手术台上。常规消毒后在无菌条件下颈正中切开，分离右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)，电热烧灼器烧断ECA的分支，结扎并游离ECA主干一段，沿ICA向下分离翼颚动脉，穿线沿起点结扎。在ECA游离段上剪开一小口，插入尖端用火烧圆的4.0单尼龙丝线,轻推尾端使之由颈外动脉通过分叉部进入颈内动脉，由入口计算长度约18mm，栓塞右大脑中动脉。栓塞30min后拉出尼龙线至颈外动脉结扎端，恢复大脑中动脉(MCA)血供。缝合切口后,动物保温喂养24h。
1.3 电针方法
选择“水沟”、“承浆”穴，于缺血前30min及再灌开始后30min予以电针，使用TDMA定量针麻治疗仪(北京海淀电子医疗仪器厂制)，选择间断疏密波(频率4~16Hz)，刺激强度从1V起，每10min增加1V，终强度为3V，持续30min。
1.4 免疫组化(SABC)法检测nNOS的表达
①大鼠在脑缺血30min再灌注24h后经水合氯醛腹腔麻醉，开胸经主动脉插管，剪开右心房，以200ml生理盐水经升主动脉快速冲洗。随后灌注冷的(4℃)4%多聚甲醛固定液350ml，开颅取出全脑，保留缺血中心区(前囟后1.8mm)后固定于相同固定液中6h，入25%蔗糖溶液至组织块下沉。AO恒冷箱切片机连续冠状切片，片厚20μm。对脑组织冰冻切片进行nNOS表达的检测，蒸馏水新鲜配置3%H2O2，室温浸泡5~10min以灭活内源性酶，滴加正常山羊血清30 min，不洗，甩去多余液体；滴加兔抗鼠nNOS一抗(1∶400,北京中杉金桥生物技术有限公司)，室温下(25℃)孵育2h，然后在4℃下过夜，PBS洗；滴加生物素化山羊抗兔IgG(北京中山公司二抗试剂盒)室温下30min，PBS洗；滴加试剂SABC，室温下30min，PBS洗10min×3次；DAB显色(北京中杉金桥生物技术有限公司)，室温下15min，双蒸水多次洗涤；脱水、透明，中性树胶封片。上述未作特别说明的洗涤时间均为5min×3次。显微镜下观察，阳性细胞呈棕黄色颗粒。②免疫组化染色对照：同一组片中，分别用正常山羊血清和PBS代替nNOS一抗作孵育，其余步骤同上，用以检查nNOS免疫反应的特异性。
1.5 图像分析和统计处理
每组动物取10张切片，每张切片选取右皮层、右CA1区和右CA3区3个视野，用HPIAS100高清晰度彩色图文分析系统对其免疫反应产物进行吸光度测定。所得实验数据输入计算机用SPAS软件进行统计处理，结果以均数±标准差(±s)表示，并以方差分析，以P<0.05为差异显著性标准。
2 结果
大鼠海马CA1区、CA3区和皮层nNOS吸光度比较见表1。
表1 各组nNOS吸光度比较(略)
与N组比较，*P<0.05;与M组比较，△P<0.05
由表1可见,缺血再灌注组nNOS在CA1区、CA3区、皮层的阳性表达比正常对照组相同脑区明显增加(P<0.05),缺血再灌注加电针组nNOS在CA1区、CA3区和皮层的阳性表达与缺血再灌注组相同脑区比较显著减少(P<0.05)。
3 讨论
一氧化氮(nitric oxide,NO) 是由左旋精氨酸和分子氧在一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)的催化下生成的。目前已有3种特异的NOS被克隆，即神经元型NOS(nNOS)、内皮细胞型NOS(cNOS)和诱导型NOS(iNOS)。NOS是NO合成中的关键调节因素，体内NO的含量及生物学作用完全依赖于NOS的活性。脑缺血再灌注损伤后NOS活性明显增加，加重局灶性脑缺血[2]。机体内过量NO的生成可直接抑制有关酶的活性，与超氧化物歧化物结合导致细胞的损伤[3,4]。本实验的研究结果表明，大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后，大脑皮层和海马CA1区、CA3区nNOS表达上调，脑组织中NO含量显著增加，说明NO参与了脑缺血再灌注损伤的发病机制。NO含量的增加和NOS活性升高的机制可能为：脑缺血后，神经末梢释放大量的谷氨酸，刺激N甲基D天门冬氨酸受体，使细胞内Ca2+浓度升高，激活NOS活性，促进NO的生成；再次，脑缺血后，ATP大量消耗，使能量代谢障碍及cAMP依赖蛋性白激酶活性下降，使NOS脱磷酸化，NOS的活性增强。
脑缺血的临床治疗目的是恢复供血供氧,抑制缺血部位的炎症反应及维持神经元结构和功能的完整性。张春红等[5]以热凝法阻断大鼠大脑中动脉造成局灶性脑缺血模型,用原位末端标记技术观察缺血区脑细胞凋亡的动态变化及针刺的干预作用。结果表明,脑缺血再灌注后1h脑缺血区已出现细胞凋亡,24h达到高峰。凋亡细胞主要局限于梗塞灶中心坏死区域的周边“半影区”。“半影区”的细胞凋亡可能对梗塞灶的扩大起着重要作用。针刺能减轻脑缺血导致的神经缺损行为异常，使缺血区脑细胞凋亡明显减少,从而减少梗塞面积,起到脑保护作用。本实验的研究发现，于缺血前30min及再灌开始后30min予以电针，大脑皮层和海马CA1区、CA3区nNOS表达的异常上调受到逆转，说明电针对脑缺血再灌注损伤后nNOS的过度表达有抑制作用，从而降低脑组织中NO的含量。本实验结果表明针刺能减少脑缺血再灌注损伤中神经元的丢失,达到治疗脑缺血再灌注损伤的目的。
参考文献：
[1]Li Y,Chopp M,Jiang N,et al.Teporal profile of in situ DNA fragmentation after transient middle cerebral after occlusion in the rat[J].J Cereb Blood Flow Metab,1995,15:389
[2]Deng Q,Xu J,Zhu D.Inducible nitric oxide synthase and upper phase of focal verebral ischemia[J].Life Sciences,1999,11(3):102(Chinese)
[3]Backman JS.The Doubleedged Role of Oxide in Brain Function and Superoxidemediated Injury[J].J Dev Physiol,1991,15(1):53
[4]Caldmell M,O Neill M,Earley B,et al.NGNitroLarginine Protects Against Ischemiainduced Increases in Nitric Oxide and Hippocampal Neurodegeneration in the Gerbil[J].J Pharmacol,1994,260(2-3):191
[5]张春红,王舒,郑灏泳,等.针刺对局灶性脑缺血大鼠脑细胞凋亡的影响[J].针刺研究,2001,26(2):102
(咸宁学院生物医学工程系，湖北 咸宁 437100), http://www.100md.com(陈世新，李建雄，侯健)
关键词：电针;缺血再灌注;一氧化氮合酶;大鼠
The Effect of Electroacupuncture on Cerebral Ischemiareperfusion Injury
CHEN Shixin，LI Jianxiong，HOU Jian
(Department of Biomedical Engineering,Xianning College,Xianning Hubei 437100,China)
ABSTRACT:Objective To study the effect of electroacupuncture on cerebral ischemiareperfusion(IR) injury. Methods Modified intravascular embolism method was employed to make focal brain ischemia in rats.Immunohistochemical method was used to detect the expression of nNOS in brain.The acupuncture point of ‘Shui gou’and‘Chenjiang’ were adopted.Results ①Compared with the normal group,the expression of nNOS could be remarkably enhanced in the cortex of brain and the CA1 and CA3 of hippocampus after cerebral IR(P<0.05). ②Compared with the IR group, the expression of nNOS could be signifcantly reduced after electroacupuncture(P<0.05). Conclusion Electroacupuncture can decrease the lose of neurons in cerebral ischemiareperfusion injury.
KEY WORDS：Electroacupuncture;Injury;Nitric oxide synthase;Rat
随着分子神经生物学的进展,针刺作用的机制已成为众多学者关注的焦点。过去认为脑缺血缺氧仅引起神经元坏死,近年日益增多的证据表明神经元凋亡是缺血引起神经元丢失的一种重要形式[1]。本实验以nNOS为指标，观察经电针治疗脑缺血再灌注损伤后，各脑区nNOS阳性神经元的表达情况。
1 材料和方法
1.1 动物分组
健康成年SD大鼠30只(华中科技大学同济医学院实验动物中心提供)，体重180~250g，雌雄不拘，随机分为正常对照组(N)、脑缺血再灌组(M)、脑缺血再灌加电针组(IA)，每组10只。
1.2 脑缺血模型的制备
大鼠自由饮食、饮水，腹腔注射10%水合氯醛 (3ml/kg) 麻醉,颈部脱毛后仰卧位固定于手术台上。常规消毒后在无菌条件下颈正中切开，分离右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)，电热烧灼器烧断ECA的分支，结扎并游离ECA主干一段，沿ICA向下分离翼颚动脉，穿线沿起点结扎。在ECA游离段上剪开一小口，插入尖端用火烧圆的4.0单尼龙丝线,轻推尾端使之由颈外动脉通过分叉部进入颈内动脉，由入口计算长度约18mm，栓塞右大脑中动脉。栓塞30min后拉出尼龙线至颈外动脉结扎端，恢复大脑中动脉(MCA)血供。缝合切口后,动物保温喂养24h。
1.3 电针方法
选择“水沟”、“承浆”穴，于缺血前30min及再灌开始后30min予以电针，使用TDMA定量针麻治疗仪(北京海淀电子医疗仪器厂制)，选择间断疏密波(频率4~16Hz)，刺激强度从1V起，每10min增加1V，终强度为3V，持续30min。
1.4 免疫组化(SABC)法检测nNOS的表达
①大鼠在脑缺血30min再灌注24h后经水合氯醛腹腔麻醉，开胸经主动脉插管，剪开右心房，以200ml生理盐水经升主动脉快速冲洗。随后灌注冷的(4℃)4%多聚甲醛固定液350ml，开颅取出全脑，保留缺血中心区(前囟后1.8mm)后固定于相同固定液中6h，入25%蔗糖溶液至组织块下沉。AO恒冷箱切片机连续冠状切片，片厚20μm。对脑组织冰冻切片进行nNOS表达的检测，蒸馏水新鲜配置3%H2O2，室温浸泡5~10min以灭活内源性酶，滴加正常山羊血清30 min，不洗，甩去多余液体；滴加兔抗鼠nNOS一抗(1∶400,北京中杉金桥生物技术有限公司)，室温下(25℃)孵育2h，然后在4℃下过夜，PBS洗；滴加生物素化山羊抗兔IgG(北京中山公司二抗试剂盒)室温下30min，PBS洗；滴加试剂SABC，室温下30min，PBS洗10min×3次；DAB显色(北京中杉金桥生物技术有限公司)，室温下15min，双蒸水多次洗涤；脱水、透明，中性树胶封片。上述未作特别说明的洗涤时间均为5min×3次。显微镜下观察，阳性细胞呈棕黄色颗粒。②免疫组化染色对照：同一组片中，分别用正常山羊血清和PBS代替nNOS一抗作孵育，其余步骤同上，用以检查nNOS免疫反应的特异性。
1.5 图像分析和统计处理
每组动物取10张切片，每张切片选取右皮层、右CA1区和右CA3区3个视野，用HPIAS100高清晰度彩色图文分析系统对其免疫反应产物进行吸光度测定。所得实验数据输入计算机用SPAS软件进行统计处理，结果以均数±标准差(±s)表示，并以方差分析，以P<0.05为差异显著性标准。
2 结果
大鼠海马CA1区、CA3区和皮层nNOS吸光度比较见表1。
表1 各组nNOS吸光度比较(略)
与N组比较，*P<0.05;与M组比较，△P<0.05
由表1可见,缺血再灌注组nNOS在CA1区、CA3区、皮层的阳性表达比正常对照组相同脑区明显增加(P<0.05),缺血再灌注加电针组nNOS在CA1区、CA3区和皮层的阳性表达与缺血再灌注组相同脑区比较显著减少(P<0.05)。
3 讨论
一氧化氮(nitric oxide,NO) 是由左旋精氨酸和分子氧在一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)的催化下生成的。目前已有3种特异的NOS被克隆，即神经元型NOS(nNOS)、内皮细胞型NOS(cNOS)和诱导型NOS(iNOS)。NOS是NO合成中的关键调节因素，体内NO的含量及生物学作用完全依赖于NOS的活性。脑缺血再灌注损伤后NOS活性明显增加，加重局灶性脑缺血[2]。机体内过量NO的生成可直接抑制有关酶的活性，与超氧化物歧化物结合导致细胞的损伤[3,4]。本实验的研究结果表明，大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后，大脑皮层和海马CA1区、CA3区nNOS表达上调，脑组织中NO含量显著增加，说明NO参与了脑缺血再灌注损伤的发病机制。NO含量的增加和NOS活性升高的机制可能为：脑缺血后，神经末梢释放大量的谷氨酸，刺激N甲基D天门冬氨酸受体，使细胞内Ca2+浓度升高，激活NOS活性，促进NO的生成；再次，脑缺血后，ATP大量消耗，使能量代谢障碍及cAMP依赖蛋性白激酶活性下降，使NOS脱磷酸化，NOS的活性增强。
脑缺血的临床治疗目的是恢复供血供氧,抑制缺血部位的炎症反应及维持神经元结构和功能的完整性。张春红等[5]以热凝法阻断大鼠大脑中动脉造成局灶性脑缺血模型,用原位末端标记技术观察缺血区脑细胞凋亡的动态变化及针刺的干预作用。结果表明,脑缺血再灌注后1h脑缺血区已出现细胞凋亡,24h达到高峰。凋亡细胞主要局限于梗塞灶中心坏死区域的周边“半影区”。“半影区”的细胞凋亡可能对梗塞灶的扩大起着重要作用。针刺能减轻脑缺血导致的神经缺损行为异常，使缺血区脑细胞凋亡明显减少,从而减少梗塞面积,起到脑保护作用。本实验的研究发现，于缺血前30min及再灌开始后30min予以电针，大脑皮层和海马CA1区、CA3区nNOS表达的异常上调受到逆转，说明电针对脑缺血再灌注损伤后nNOS的过度表达有抑制作用，从而降低脑组织中NO的含量。本实验结果表明针刺能减少脑缺血再灌注损伤中神经元的丢失,达到治疗脑缺血再灌注损伤的目的。
参考文献：
[1]Li Y,Chopp M,Jiang N,et al.Teporal profile of in situ DNA fragmentation after transient middle cerebral after occlusion in the rat[J].J Cereb Blood Flow Metab,1995,15:389
[2]Deng Q,Xu J,Zhu D.Inducible nitric oxide synthase and upper phase of focal verebral ischemia[J].Life Sciences,1999,11(3):102(Chinese)
[3]Backman JS.The Doubleedged Role of Oxide in Brain Function and Superoxidemediated Injury[J].J Dev Physiol,1991,15(1):53
[4]Caldmell M,O Neill M,Earley B,et al.NGNitroLarginine Protects Against Ischemiainduced Increases in Nitric Oxide and Hippocampal Neurodegeneration in the Gerbil[J].J Pharmacol,1994,260(2-3):191
[5]张春红,王舒,郑灏泳,等.针刺对局灶性脑缺血大鼠脑细胞凋亡的影响[J].针刺研究,2001,26(2):102
(咸宁学院生物医学工程系，湖北 咸宁 437100), http://www.100md.com(陈世新，李建雄，侯健)