不孕妇女宫颈分泌物解脲支原体检测及临床意义
[关键词] 不孕症；宫颈分泌物；解脲支原体
近年来，支原体感染与不孕症的关系越来越受到人们的重视，其中主要是解脲支原体(ureaplasma urealyticum,UU)。本研究应用荧光定量PCR的方法(FQ-PCR)对320例不孕妇女进行宫颈分泌物解脲支原体DNA检测，了解解脲支原体感染与不孕症的关系，尤其与输卵管因素不孕的关系。现将结果分析报告如下。
1 材料与方法
1.1一般资料
2004年5月～2005年5月到我院生殖医学中心拟接受体外受精-胚胎移植助孕的不孕妇女共320例，其中原发性不孕患者136例，继发性不孕患者184例；输卵管因素不孕患者201例，非输卵管性不孕患者119例；年龄23～41岁，不孕年限2～20年。同时对60例有过正常妊娠分娩史的妇女进行检测，作为正常对照组。
1.2仪器与试剂
美国ABI PRISM 7000 Sequence Detection System 荧光定量PCR仪。解脲支原体DNA荧光定量PCR试剂盒由中山大学达安基因股份有限公司提供。
1.3方法
1.3.1 标本采集：采样时用未蘸消毒液的窥阴器扩张阴道后，先用无菌生理盐水棉球洗去宫颈外分泌物，再用无菌棉拭子插入宫颈管内，停留5 s后旋转棉拭子采集宫颈分泌物，将采集宫颈分泌物的棉拭子放入无菌试管中送检。
1.3.2 解脲支原体DNA检测：将1 ml生理盐水加入标本试管中，充分震荡摇匀，吸取液体转至1.5 ml离心管中，12 000 rpm离心5 min。沉淀加生理盐水1 ml打匀，15 000 rpm离心5 min，再重复洗涤一次。沉淀直接加50 μl DNA提取液充分混匀，10 000 rpm离心5 min，取上清液2 μl做PCR反应。取单管单人份PCR反应管若干管，直接加入处理后样品2 μl(同时设置阴阳性质控标准品)，6 000 rpm离心10 s。将各反应管放入PCR仪，进行扩增。
1.4 结果判断
样本扩增曲线与阈值线交叉点的循环数(Ct值)<30，判断实验结果为阳性。
1.5 统计学处理
采用χ2检验。
2 结果
320例不孕妇女(不孕组)宫颈分泌物解脲支原体DNA检测阳性者145例，阳性率45.31%，60例正常对照组阳性者17例，阳性率28.33%，两组比较，差异有显著性(P<0.05)。201例输卵管因素不孕患者宫颈分泌物解脲支原体DNA检测阳性率为49.8%(100/201)，119例非输卵管因素性不孕患者宫颈分泌物解脲支原体DNA检测阳性率为37.8%(45/119)，两组比较，差异有显著性(P<0.05)。136例原发性不孕患者宫颈分泌物解脲支原体DNA检测阳性率为45.59%(62/136)，184例继发性不孕患者宫颈分泌物解脲支原体DNA检测阳性率为45.11%(83/184)，两组比较无显著性差异(P>0.05)。
3 讨论
支原体是一群大小介于细菌和病毒之间的原核生物,种类繁多,其中解脲支原体(UU)是引起人类泌尿生殖道感染的病原体之一。近年来的研究表明生殖道支原体感染与不孕不育有关[1,2]。女性不孕，尤其输卵管因素不孕与支原体感染关系密切[3]。在本资料中320例不孕妇女(不孕组)宫颈分泌物UU-DNA检出率为45.31%，明显高于正常对照组(28.33%)，且输卵管因素不孕患者宫颈分泌物UU-DNA检出率(49.8%)高于非输卵管因素性不孕患者(37.8%)，说明不孕妇女支原体感染率高，输卵管因素不孕与UU感染有关，与文献报道一致[3，4] 。UU感染引起不孕的机制：一方面，UU可粘附于生殖道粘膜细胞的表面，损害细胞，引起女性宫颈炎、子宫内膜炎和输卵管炎，破坏输卵管粘膜上皮，导致输卵管结构和功能受损而致不孕；另一方面,UU分解尿素产生的NH4破坏作为天然屏障的弱酸性环境,促使其他病原微生物易于定植、感染而不利于精子成活。最近，邓超干等[5]报道UU感染与抗精子抗体(ASAb)的产生有关。当UU感染时,女性生殖道受损,使生殖道内的环境发生改变、生理屏障受到破坏,女性体内独特型抗体和抗独特型抗体的网络功能紊乱,不利于精子成活,死亡精子和抗原释放,使免疫系统受损的女性对丈夫精子过敏产生ASAb，导致免疫性不孕。
由于解脲支原体感染后自觉症状较轻,甚至无自觉症状表现,易被医生和患者所忽视，以致感染反复迁延而呈现进行性和不可逆的病理变化；解脲支原体感染不仅引起不孕，还可引起流产、异位妊娠等不良妊娠结局[6]。这就提醒我们对不孕症患者尤其是输卵管梗阻因素所致的不孕患者,应把解脲支原体检测做为常规检测项目，及早进行检测和治疗,以防止解脲支原体感染迁延引起输卵管完全梗阻和严重盆腔粘连等不可逆变化。
体外受精-胚胎移植是目前最主要的辅助生殖技术，随着该技术的普及,越来越多的不孕患者求助于这项技术,由于他们是支原体感染的高发人群,支原体是否会影响体外受精-胚胎移植的结局也引起了研究者们的重视。故应常规行宫颈分泌物解脲支原体检测，若阳性需治疗转阴性后再行体外受精-胚胎移植助孕治疗，以提高体外受精-胚胎移植助孕的效果,减少早期胚胎停止发育的发生，减少自然流产率。
[参 考 文 献]
[1] 韩 茜,李秀荣,于占林,等.不孕妇女生殖道支原体感染情况及药敏分析[J].中国优生与遗传杂志,2004,12(5):122.
[2] 杨 洁，张 宁，鲁海鸥，等.生殖道支原体、衣原体感染与女性不孕[J].中国优生与遗传杂志, 2003,11(2): 113.
[3] 陈春娟,唐喜玲,付桂英.输卵管梗阻性不孕与解脲支原体宫内感染的关系[J].中国误诊学杂志,2001,1(8): 1 198-1 199.
[4] 张月莲,杨燕生.解脲支原体感染与输卵管性不孕的关系[J].中华妇产科杂志,2000,35(2):110-111.
[5] 邓超干,沈彦珍,林小丹,等.女性不孕与支原体、衣原体感染和抗精子抗体的相关性[J].中国优生与遗传杂志，2005 13(10)：122-123.
[6] 叶玲玲,张碧云,曹文丽.子宫颈支原体感染与胚胎停止发育的关系[J].中华妇产科杂志，2004，39(2):83-85.
(郧阳医学院附属人民医院生殖医学中心，湖北十堰442000), http://www.100md.com(王华,黄晓卉,程萍, 胡玥玥, 罗清炳,罗丽娟)
近年来，支原体感染与不孕症的关系越来越受到人们的重视，其中主要是解脲支原体(ureaplasma urealyticum,UU)。本研究应用荧光定量PCR的方法(FQ-PCR)对320例不孕妇女进行宫颈分泌物解脲支原体DNA检测，了解解脲支原体感染与不孕症的关系，尤其与输卵管因素不孕的关系。现将结果分析报告如下。
1 材料与方法
1.1一般资料
2004年5月～2005年5月到我院生殖医学中心拟接受体外受精-胚胎移植助孕的不孕妇女共320例，其中原发性不孕患者136例，继发性不孕患者184例；输卵管因素不孕患者201例，非输卵管性不孕患者119例；年龄23～41岁，不孕年限2～20年。同时对60例有过正常妊娠分娩史的妇女进行检测，作为正常对照组。
1.2仪器与试剂
美国ABI PRISM 7000 Sequence Detection System 荧光定量PCR仪。解脲支原体DNA荧光定量PCR试剂盒由中山大学达安基因股份有限公司提供。
1.3方法
1.3.1 标本采集：采样时用未蘸消毒液的窥阴器扩张阴道后，先用无菌生理盐水棉球洗去宫颈外分泌物，再用无菌棉拭子插入宫颈管内，停留5 s后旋转棉拭子采集宫颈分泌物，将采集宫颈分泌物的棉拭子放入无菌试管中送检。
1.3.2 解脲支原体DNA检测：将1 ml生理盐水加入标本试管中，充分震荡摇匀，吸取液体转至1.5 ml离心管中，12 000 rpm离心5 min。沉淀加生理盐水1 ml打匀，15 000 rpm离心5 min，再重复洗涤一次。沉淀直接加50 μl DNA提取液充分混匀，10 000 rpm离心5 min，取上清液2 μl做PCR反应。取单管单人份PCR反应管若干管，直接加入处理后样品2 μl(同时设置阴阳性质控标准品)，6 000 rpm离心10 s。将各反应管放入PCR仪，进行扩增。
1.4 结果判断
样本扩增曲线与阈值线交叉点的循环数(Ct值)<30，判断实验结果为阳性。
1.5 统计学处理
采用χ2检验。
2 结果
320例不孕妇女(不孕组)宫颈分泌物解脲支原体DNA检测阳性者145例，阳性率45.31%，60例正常对照组阳性者17例，阳性率28.33%，两组比较，差异有显著性(P<0.05)。201例输卵管因素不孕患者宫颈分泌物解脲支原体DNA检测阳性率为49.8%(100/201)，119例非输卵管因素性不孕患者宫颈分泌物解脲支原体DNA检测阳性率为37.8%(45/119)，两组比较，差异有显著性(P<0.05)。136例原发性不孕患者宫颈分泌物解脲支原体DNA检测阳性率为45.59%(62/136)，184例继发性不孕患者宫颈分泌物解脲支原体DNA检测阳性率为45.11%(83/184)，两组比较无显著性差异(P>0.05)。
3 讨论
支原体是一群大小介于细菌和病毒之间的原核生物,种类繁多,其中解脲支原体(UU)是引起人类泌尿生殖道感染的病原体之一。近年来的研究表明生殖道支原体感染与不孕不育有关[1,2]。女性不孕，尤其输卵管因素不孕与支原体感染关系密切[3]。在本资料中320例不孕妇女(不孕组)宫颈分泌物UU-DNA检出率为45.31%，明显高于正常对照组(28.33%)，且输卵管因素不孕患者宫颈分泌物UU-DNA检出率(49.8%)高于非输卵管因素性不孕患者(37.8%)，说明不孕妇女支原体感染率高，输卵管因素不孕与UU感染有关，与文献报道一致[3，4] 。UU感染引起不孕的机制：一方面，UU可粘附于生殖道粘膜细胞的表面，损害细胞，引起女性宫颈炎、子宫内膜炎和输卵管炎，破坏输卵管粘膜上皮，导致输卵管结构和功能受损而致不孕；另一方面,UU分解尿素产生的NH4破坏作为天然屏障的弱酸性环境,促使其他病原微生物易于定植、感染而不利于精子成活。最近，邓超干等[5]报道UU感染与抗精子抗体(ASAb)的产生有关。当UU感染时,女性生殖道受损,使生殖道内的环境发生改变、生理屏障受到破坏,女性体内独特型抗体和抗独特型抗体的网络功能紊乱,不利于精子成活,死亡精子和抗原释放,使免疫系统受损的女性对丈夫精子过敏产生ASAb，导致免疫性不孕。
由于解脲支原体感染后自觉症状较轻,甚至无自觉症状表现,易被医生和患者所忽视，以致感染反复迁延而呈现进行性和不可逆的病理变化；解脲支原体感染不仅引起不孕，还可引起流产、异位妊娠等不良妊娠结局[6]。这就提醒我们对不孕症患者尤其是输卵管梗阻因素所致的不孕患者,应把解脲支原体检测做为常规检测项目，及早进行检测和治疗,以防止解脲支原体感染迁延引起输卵管完全梗阻和严重盆腔粘连等不可逆变化。
体外受精-胚胎移植是目前最主要的辅助生殖技术，随着该技术的普及,越来越多的不孕患者求助于这项技术,由于他们是支原体感染的高发人群,支原体是否会影响体外受精-胚胎移植的结局也引起了研究者们的重视。故应常规行宫颈分泌物解脲支原体检测，若阳性需治疗转阴性后再行体外受精-胚胎移植助孕治疗，以提高体外受精-胚胎移植助孕的效果,减少早期胚胎停止发育的发生，减少自然流产率。
[参 考 文 献]
[1] 韩 茜,李秀荣,于占林,等.不孕妇女生殖道支原体感染情况及药敏分析[J].中国优生与遗传杂志,2004,12(5):122.
[2] 杨 洁，张 宁，鲁海鸥，等.生殖道支原体、衣原体感染与女性不孕[J].中国优生与遗传杂志, 2003,11(2): 113.
[3] 陈春娟,唐喜玲,付桂英.输卵管梗阻性不孕与解脲支原体宫内感染的关系[J].中国误诊学杂志,2001,1(8): 1 198-1 199.
[4] 张月莲,杨燕生.解脲支原体感染与输卵管性不孕的关系[J].中华妇产科杂志,2000,35(2):110-111.
[5] 邓超干,沈彦珍,林小丹,等.女性不孕与支原体、衣原体感染和抗精子抗体的相关性[J].中国优生与遗传杂志，2005 13(10)：122-123.
[6] 叶玲玲,张碧云,曹文丽.子宫颈支原体感染与胚胎停止发育的关系[J].中华妇产科杂志，2004，39(2):83-85.
(郧阳医学院附属人民医院生殖医学中心，湖北十堰442000), http://www.100md.com(王华,黄晓卉,程萍, 胡玥玥, 罗清炳,罗丽娟)