腺苷A1受体激动剂延迟预处理保存大鼠心脏的实验研究
摘 要 目的:探讨腺苷A1受体激动剂延迟预处理对大鼠心脏的保护效果。方法:实验组(P组)以高选择性A1受体激动剂CCPA预处理Wistar 大鼠24 h后处死，分离心脏并置于4 ℃改良St.Thomas液中诱导心脏停搏，然后放入该液中低温保存4 h，再灌注1 h。观察心功能恢复率、心肌ATP、Ckmb释放量。另设单纯改良St.Thomas液保存对照组(C组)。结果：P组左室内压上升与下降最大速率恢复率(±dp/dt max，%)为 62.83±17.27，66.81±18.99， 心肌ATP含量(10-3 μmol/g)3.67±1.42；而C组分别为40.41±18.29,44.70±25.14， 1.46±0.54。P组都明显高于C组，差异均有显著性(P<0.01或P<0.05)。结论：以腺苷A1受体激动剂延迟预处理能改善离体大鼠心脏的保存效果。
关键词 腺苷；预处理；供心保存；大鼠
Improvement of rat donor heart preservation by delayed preconditioning with adenosine A1 receptor agonist
ZHU Shuibo,SUN Zongqiuan,YIN Guilin，ZHANG Xiaoming,PANG Dazhi,WANG Rongping
(1.Department of Cardiovascular Thoracic Surgery,Wuhan General Hospital of PLA,Wuhan,Hubei 430070;2.Huazhong University of Science and Technology)
Abstract Objective：To study the protecting effect of delayed preconditioning with A1selective adenosine receptor agonist in donor heart preservation. Methods：Wistar rats were injected with 2chloroN6cyclopentyladenosine (CCPA). 24 hours later,the hearts were isolated and mounted on a Langendorff apparatus，perfused with filtered modified KrebsHenseleit buffer through aorta. The hearts then were arrested with 4 ℃ modified St.Thomas solution and stored at 4 ℃ for 4 hours ，and reperfused with KH buffer for one hour. Left ventricular function,myocardial CKmb leakage and tissue levels of adenosine triphosphate(ATP) were measured. Results:The maximum recovery rates of increase and decrease in the left ventricular presure(±dp/dt max,%) were 62.83±17.27 and 66.81±18.99 respectively in the preconditioned group, compared to 40.41±18.29 and 44.70±25.14 respectively in the control group. The ATP level (10-3μmol/wet.g) was 3.67±1.42 in the preconditioned group, compared to 1.46±0.54 in the control group.The difference were significant (P<0.05). Conclusion:This study suggests that the transient preconditioning with CCPA may have some beneficial effects on Wistar rat donor heart preservation.
Key words adenosine;preconditioning;donor heart preservation
CLC number R965 Article ID:1006-8783(2003)01-0028-02 Document code:A
在心内直视手术中，心肌缺血再灌注损伤一直是人们关注的问题。虽然目前临床上采用的低温心麻液保护法对较短时间缺血所造成的再灌注损伤有较好的预防作用，但对心脏移植中供心保存的效果较差，以致供心缺血再灌损伤是术后早期心力衰竭的主要原因之一。近年研究表明缺血预处理延迟保护效应持续时间较长,而且某些化学药物能代替缺血预处理调动这一内源性保护机制，减轻心肌缺血再灌损伤。本实验试图探究高选择性腺苷A1受体激动剂预处理延迟效应对离体大鼠心脏的保存效果。
1 材料与方法
1.1 对象与药品
取健康成年雄性Wistar大鼠20只，260~300 g,中南大学提供。高度选择性腺苷A1受体激动剂2氯环戊腺苷(2chloroN6cyclopentyladenosine ，CCPA) 购于Sigma 公司，编号C7938，FW369.8。
1.2 模型及分组
随机分2组(各10只)，即C组为对照组，注射生理盐水;P组腹腔注射CCPA溶液( 75 μg/kg)，24 h后以改良Langendorff装置制成离体灌注心脏，主动脉逆行灌注充氧37 ℃ KrebsHenseleit(KH)液(O2 95%，CO2 5%)，压力10.0 kPa。右室放置起搏导线，接刺激器，240b/min。带囊导管插入左室，调整舒张末压0.27~1.33 kPa。平衡灌注后，用4 ℃心麻液诱导心脏停搏，于该液中浸泡保存，4 ℃环境下缺血240 min，再用充氧37 ℃ KH平衡液复灌60 min，注意左心室减压。
1.3 观测指标
心功能 Power Lab生理记录仪记录左室压力上升和下降最大速率(±dp/dtmax)、记录冠脉回流量(CF)和主动脉压力(AP)，求冠脉循环阻力(CR= AP/CF)。再以其基础值为100%，计算变化率(%)。全自动生化分析仪(日立7107A)测定冠脉回流液中心肌磷酸肌酸激酶(CKMB)。取左室前壁心肌，以虫荧光素酶法测定心肌三磷酸腺苷(ATP)含量。
1.4 统计学处理
数据以(x±s)表示。组间比较，以SPSS软件作t检验，P<0.05认为差别具有显著性。
2 结果
2.1 心功能恢复率
如表1所示，P组左室压力上升和下降最大速率和左心室收缩峰压恢复率都高于C组；与之相比，差异有显著性(P<0.01)。说明CCPA预处理能改善低温St.Thomas液保存大鼠心脏的效果,促进心功能的恢复。表1 复灌60 min心功能恢复率(略)
2.2 冠脉循环阻力变化(%)
再灌注60 min时C、P两组冠脉循环阻力都有明显上升，分别为基础值143.28±27.37和 195.17±57.45；P组明显低于C组,差异有显著性 (P<0.05)。
2.3 CKMB释放情况(μmol·s-1/L)
P组保存4 h和再灌注1 h后心肌释放的CKMB(1.54±0.58)明显低于C组(2.71±0.87)，差异有显著性 (P<0.01)。说明CCPA能模拟缺血预处理减轻心肌损伤，提高低温St.Thomas液保存供心的效果。
2.4 心肌ATP含量(10-3 μmol/g)
再灌注60 min后， P组心肌ATP含量(3.46±1.42)明显高于C组(146±0.54)，差异有显著性(P<0.05)。
3 讨论
3.1 供心保存方法有待改进
在心外科手术中，选择有效的心肌保护方法至关重要。尤其是心脏移植供心缺血时间较长、再灌注损伤较重，保护效果直接影响到手术成败,目前常用的保存方法仍有待改进。低温St.Thomas液用于一般心脏手术中效果尚可，但对供心保存的效果极不理想。本实验C组结果提示，保存4 h、再灌注1 h后左室压力上升和下降最大速率恢复率仅40%左右， 冠脉循环阻力几乎增加1倍。虽然改变保存液的成分可以提高供心保存效果，但是内源性保护机制的应用则更有利于供心保存。缺血预处理虽能调动这一机制，但其临床上应用有一定的顾虑。太短的缺血刺激不足以诱发这一保护机制，太长时间的预处理缺血本身就可造成心肌损伤[1]。近来研究发现某些药物或化学剂能够模拟缺血预处理的延迟心肌保护效应，维持有效时间长达24 h之久[2]，更适合于供心的保护。
3.2 腺苷A1受体激动剂延迟预处理可提高心脏保存效果
已有研究表明腺苷A1受体激动剂也能诱发延迟预处理。Baxter和Yellon报道以A1受体激动剂预处理兔24~72 h均可产生延迟性抗心肌梗死作用，使之范围降低50%左右[3]。如果每48 h给兔静脉注射1次A1受体激动剂，连续5次，可使其心脏处于长达10 d的被保护状态[4]。另外，CCPA为高度选择性腺苷A1受体激动剂，对A2受体几乎无作用，可避免腺苷扩张血管引起血压下降等副作用。据此，在心脏移植中获取供心前以其作延迟预处理，对减轻供心长时间缺血/再灌注损伤十分有利。但其能否改善St.Thomas液对离体大鼠心脏的保存效果尚未见报道。
本实验结果显示以CCPA激动腺苷A1受体即可触发大鼠心脏产生预处理的延迟效应，并改善St.Thomas液对供心的保存效果。即低温缺血4 h后心脏功能恢复明显优于单纯改良St.Thomas液保存组；表现为冠脉循环阻力变化较小；CKMB漏出量减少；再灌注60 min，心肌ATP恢复较快。
3.3 腺苷A1受体激动剂延迟预处理的机制
关于腺苷激动剂预处理保护心肌缺血/再灌注损伤的机制较为复杂，目前认为A1受体兴奋，激活蛋白激酶C和蛋白质酪氨酸激酶等构成的共同通道，将外来刺激传到胞内。一方面促使ATP敏感性钾通道开放，从而产生预处理的心肌保护效应[5]。有人研究发现以CCPA预处理小鼠24 h后，再在Langdorff灌注装置上作全心缺血30 min、复灌30 min，结果心梗面积明显小于对照组，且左心室功能恢复较快；当阻止心肌线粒体内膜ATP敏感性钾通道开放后，上述保护作用也就随之消失[6]。另一方面继续将信号传至核转录因子，如核因子kB，以此上调心肌保护基因的表达[7]。心肌线粒体锰超氧化物歧化酶(MnSOD)可能是保护性基因表达的主要产物，在CCPA延迟预处理中取决定性作用[8]。然而CCPA延迟预处理中，ATP敏感性钾通道开放后又怎样发挥心肌保护作用等问题尚需进一步研究证实。
参考文献
[1]Lu K,Otani H,Nakao Y,et al. Protein kinase C isoformdependent myocardial protection by ischemic preconditioning and potassium cardiaplegia[J]. J Thorac Cardiovasc Surg,2001,121:137.
[2]Nelson DW,Brown JM,Banerjee A,et al. Pretreatment with a nontoxic derivative of endotoxin induces functional protection against cardiac ischemia/reperfusion injury[J]. Surg,1991，110：365.
[3]Baxter GF,Yellon DM. Time course of delayed myocardial protection after transient adenosine A1receptor activation in the rabbit[J]. J Cardiovasc Pharmacol,1997,29:631.
[4]Dana A,Baxter GF,Walker GM,et al. Prolonging the delayed phase of myocardial protection: repetive adenosine A1 receptor activation maintains rabbit myocardium in preconditioning state[J]. J Mol Cell Cardiol,1998,31:1142.
[5]Takano H,Bolli R,Black RG,et al. A1 or A3 receptors induce late preconditioning against infarction in the conscious rabbits by different mechanism[J]. Circ Res,2001，88(5):520.
[6]Zhao TC,Hines DS,Kukreja RC. Adenosineinduced late preconditioning in the mouse: role of p38 MAP kinase and mitochondrial KATP channels[J]. Am J Physiol,2001,280(3):H1278.
[7]Xuan YT,Tang XL,Banerjee S,et al. Nuclear factork B plays an essential role in the genesis of the late phase of ischemic preconditioning in the conscious rabbits[J]. Circ Res,1999,84: 1095.
[8]Dana A,Jonassen AK,Yamashita N,et al. Adenosine A1 receptor activation induces delayed preconditioning in rats mediated by manganese superoxide dismutase[J]. Circulation,2000,101:2841.
1.广州军区武汉总医院心胸外科 湖北武汉 430070；
2.华中科技大学协和医院心外科, http://www.100md.com(朱水波 孙宗全 殷桂林 张晓明 庞大志 王荣平)
关键词 腺苷；预处理；供心保存；大鼠
Improvement of rat donor heart preservation by delayed preconditioning with adenosine A1 receptor agonist
ZHU Shuibo,SUN Zongqiuan,YIN Guilin，ZHANG Xiaoming,PANG Dazhi,WANG Rongping
(1.Department of Cardiovascular Thoracic Surgery,Wuhan General Hospital of PLA,Wuhan,Hubei 430070;2.Huazhong University of Science and Technology)
Abstract Objective：To study the protecting effect of delayed preconditioning with A1selective adenosine receptor agonist in donor heart preservation. Methods：Wistar rats were injected with 2chloroN6cyclopentyladenosine (CCPA). 24 hours later,the hearts were isolated and mounted on a Langendorff apparatus，perfused with filtered modified KrebsHenseleit buffer through aorta. The hearts then were arrested with 4 ℃ modified St.Thomas solution and stored at 4 ℃ for 4 hours ，and reperfused with KH buffer for one hour. Left ventricular function,myocardial CKmb leakage and tissue levels of adenosine triphosphate(ATP) were measured. Results:The maximum recovery rates of increase and decrease in the left ventricular presure(±dp/dt max,%) were 62.83±17.27 and 66.81±18.99 respectively in the preconditioned group, compared to 40.41±18.29 and 44.70±25.14 respectively in the control group. The ATP level (10-3μmol/wet.g) was 3.67±1.42 in the preconditioned group, compared to 1.46±0.54 in the control group.The difference were significant (P<0.05). Conclusion:This study suggests that the transient preconditioning with CCPA may have some beneficial effects on Wistar rat donor heart preservation.
Key words adenosine;preconditioning;donor heart preservation
CLC number R965 Article ID:1006-8783(2003)01-0028-02 Document code:A
在心内直视手术中，心肌缺血再灌注损伤一直是人们关注的问题。虽然目前临床上采用的低温心麻液保护法对较短时间缺血所造成的再灌注损伤有较好的预防作用，但对心脏移植中供心保存的效果较差，以致供心缺血再灌损伤是术后早期心力衰竭的主要原因之一。近年研究表明缺血预处理延迟保护效应持续时间较长,而且某些化学药物能代替缺血预处理调动这一内源性保护机制，减轻心肌缺血再灌损伤。本实验试图探究高选择性腺苷A1受体激动剂预处理延迟效应对离体大鼠心脏的保存效果。
1 材料与方法
1.1 对象与药品
取健康成年雄性Wistar大鼠20只，260~300 g,中南大学提供。高度选择性腺苷A1受体激动剂2氯环戊腺苷(2chloroN6cyclopentyladenosine ，CCPA) 购于Sigma 公司，编号C7938，FW369.8。
1.2 模型及分组
随机分2组(各10只)，即C组为对照组，注射生理盐水;P组腹腔注射CCPA溶液( 75 μg/kg)，24 h后以改良Langendorff装置制成离体灌注心脏，主动脉逆行灌注充氧37 ℃ KrebsHenseleit(KH)液(O2 95%，CO2 5%)，压力10.0 kPa。右室放置起搏导线，接刺激器，240b/min。带囊导管插入左室，调整舒张末压0.27~1.33 kPa。平衡灌注后，用4 ℃心麻液诱导心脏停搏，于该液中浸泡保存，4 ℃环境下缺血240 min，再用充氧37 ℃ KH平衡液复灌60 min，注意左心室减压。
1.3 观测指标
心功能 Power Lab生理记录仪记录左室压力上升和下降最大速率(±dp/dtmax)、记录冠脉回流量(CF)和主动脉压力(AP)，求冠脉循环阻力(CR= AP/CF)。再以其基础值为100%，计算变化率(%)。全自动生化分析仪(日立7107A)测定冠脉回流液中心肌磷酸肌酸激酶(CKMB)。取左室前壁心肌，以虫荧光素酶法测定心肌三磷酸腺苷(ATP)含量。
1.4 统计学处理
数据以(x±s)表示。组间比较，以SPSS软件作t检验，P<0.05认为差别具有显著性。
2 结果
2.1 心功能恢复率
如表1所示，P组左室压力上升和下降最大速率和左心室收缩峰压恢复率都高于C组；与之相比，差异有显著性(P<0.01)。说明CCPA预处理能改善低温St.Thomas液保存大鼠心脏的效果,促进心功能的恢复。表1 复灌60 min心功能恢复率(略)
2.2 冠脉循环阻力变化(%)
再灌注60 min时C、P两组冠脉循环阻力都有明显上升，分别为基础值143.28±27.37和 195.17±57.45；P组明显低于C组,差异有显著性 (P<0.05)。
2.3 CKMB释放情况(μmol·s-1/L)
P组保存4 h和再灌注1 h后心肌释放的CKMB(1.54±0.58)明显低于C组(2.71±0.87)，差异有显著性 (P<0.01)。说明CCPA能模拟缺血预处理减轻心肌损伤，提高低温St.Thomas液保存供心的效果。
2.4 心肌ATP含量(10-3 μmol/g)
再灌注60 min后， P组心肌ATP含量(3.46±1.42)明显高于C组(146±0.54)，差异有显著性(P<0.05)。
3 讨论
3.1 供心保存方法有待改进
在心外科手术中，选择有效的心肌保护方法至关重要。尤其是心脏移植供心缺血时间较长、再灌注损伤较重，保护效果直接影响到手术成败,目前常用的保存方法仍有待改进。低温St.Thomas液用于一般心脏手术中效果尚可，但对供心保存的效果极不理想。本实验C组结果提示，保存4 h、再灌注1 h后左室压力上升和下降最大速率恢复率仅40%左右， 冠脉循环阻力几乎增加1倍。虽然改变保存液的成分可以提高供心保存效果，但是内源性保护机制的应用则更有利于供心保存。缺血预处理虽能调动这一机制，但其临床上应用有一定的顾虑。太短的缺血刺激不足以诱发这一保护机制，太长时间的预处理缺血本身就可造成心肌损伤[1]。近来研究发现某些药物或化学剂能够模拟缺血预处理的延迟心肌保护效应，维持有效时间长达24 h之久[2]，更适合于供心的保护。
3.2 腺苷A1受体激动剂延迟预处理可提高心脏保存效果
已有研究表明腺苷A1受体激动剂也能诱发延迟预处理。Baxter和Yellon报道以A1受体激动剂预处理兔24~72 h均可产生延迟性抗心肌梗死作用，使之范围降低50%左右[3]。如果每48 h给兔静脉注射1次A1受体激动剂，连续5次，可使其心脏处于长达10 d的被保护状态[4]。另外，CCPA为高度选择性腺苷A1受体激动剂，对A2受体几乎无作用，可避免腺苷扩张血管引起血压下降等副作用。据此，在心脏移植中获取供心前以其作延迟预处理，对减轻供心长时间缺血/再灌注损伤十分有利。但其能否改善St.Thomas液对离体大鼠心脏的保存效果尚未见报道。
本实验结果显示以CCPA激动腺苷A1受体即可触发大鼠心脏产生预处理的延迟效应，并改善St.Thomas液对供心的保存效果。即低温缺血4 h后心脏功能恢复明显优于单纯改良St.Thomas液保存组；表现为冠脉循环阻力变化较小；CKMB漏出量减少；再灌注60 min，心肌ATP恢复较快。
3.3 腺苷A1受体激动剂延迟预处理的机制
关于腺苷激动剂预处理保护心肌缺血/再灌注损伤的机制较为复杂，目前认为A1受体兴奋，激活蛋白激酶C和蛋白质酪氨酸激酶等构成的共同通道，将外来刺激传到胞内。一方面促使ATP敏感性钾通道开放，从而产生预处理的心肌保护效应[5]。有人研究发现以CCPA预处理小鼠24 h后，再在Langdorff灌注装置上作全心缺血30 min、复灌30 min，结果心梗面积明显小于对照组，且左心室功能恢复较快；当阻止心肌线粒体内膜ATP敏感性钾通道开放后，上述保护作用也就随之消失[6]。另一方面继续将信号传至核转录因子，如核因子kB，以此上调心肌保护基因的表达[7]。心肌线粒体锰超氧化物歧化酶(MnSOD)可能是保护性基因表达的主要产物，在CCPA延迟预处理中取决定性作用[8]。然而CCPA延迟预处理中，ATP敏感性钾通道开放后又怎样发挥心肌保护作用等问题尚需进一步研究证实。
参考文献
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[5]Takano H,Bolli R,Black RG,et al. A1 or A3 receptors induce late preconditioning against infarction in the conscious rabbits by different mechanism[J]. Circ Res,2001，88(5):520.
[6]Zhao TC,Hines DS,Kukreja RC. Adenosineinduced late preconditioning in the mouse: role of p38 MAP kinase and mitochondrial KATP channels[J]. Am J Physiol,2001,280(3):H1278.
[7]Xuan YT,Tang XL,Banerjee S,et al. Nuclear factork B plays an essential role in the genesis of the late phase of ischemic preconditioning in the conscious rabbits[J]. Circ Res,1999,84: 1095.
[8]Dana A,Jonassen AK,Yamashita N,et al. Adenosine A1 receptor activation induces delayed preconditioning in rats mediated by manganese superoxide dismutase[J]. Circulation,2000,101:2841.
1.广州军区武汉总医院心胸外科 湖北武汉 430070；
2.华中科技大学协和医院心外科, http://www.100md.com(朱水波 孙宗全 殷桂林 张晓明 庞大志 王荣平)