荧光检测异丙酚血药浓度
Fluorescence detection of propofol drug concentration in plasma
LU LiHua1，ZHANG Hui2，GAO Rong1，WEI LinLin1，WU Hong1, LI XiaoYe1
1Department of Chemistry, School of Pharmacy, 2Department of Anesthesiology, Stomatological Hospital, Fourth Military Medical University, Xian 710033, China
【Abstract】 AIM: To study the use of fluorescence detection in determining the propofol drug concentration in plasma. METHODS: Buffer solution of phosphoric acid and cyclohexanetertbutanol were added to plasma samples with different propofol concentration. After being vibrated, the samples were centrifugated. The upperclear solution was taken to determine the fluorescence intensity. The fluorescence detective excitation waves and emission waves were 265 nm and 310 nm respectively. RESULTS: Between the propofol concentrations and the fluorescence intensities, there was a good linear relationship in the range of 0.1-15.0 mg/L (r=0.9997). The average recovery was more than 95%. The relative standard deviation (RSD) of intraday and interday assays were all less than 3%. CONCLUSION: The method is sample, accurate and sensitive for determining drug concentration of propofol in plasma.
【Keywords】 propofol; drug concentration in plasma; fluorescence detection; pharmacokinetics
【摘要】 目的：探讨异丙酚血药浓度测定的荧光检测方法. 方法：在含异丙酚的人体血浆样品中加入磷酸缓冲液及环己烷/正丁醇，振摇、离心,取上清液测荧光强度(激发波长λex=265 nm，发射波长λem=310 nm). 结果：异丙酚标准液在浓度为0.1～15.0 mg/L的范围内，其荧光强度与质量浓度间具有线性关系(r=0.9997). 异丙酚的平均加样回收率大于95%，日内和日间RSD均小于3%. 结论：该方法简便、准确、灵敏度高，可用于临床异丙酚血药浓度检测.
【关键词】 异丙酚；血药浓度；荧光法；药代动力学
0引言
异丙酚是一种新型短效静脉麻醉药. 具有起效快、作用时间短等优点[1]，是临床应用较为广泛的麻醉药之一[2]. 杜文力等[3]报道多用高氯酸沉降法和甲醇沉降血清蛋白提取法测定异丙酚浓度，但回收率均偏低(低于86%). 而国外采用衍生化法提高回收率，但步骤繁琐[4]. 该药具有π共轭结构，具有较强的荧光特性. 为了满足药代动力学研究的需要，我们以环己烷、正丁醇作为提取液，研究并建立了一种简便、灵敏的荧光法来测定异丙酚的血药浓度，回收率可达95%以上.
1材料和方法
1.1材料选择男性健康志愿者8名，平均年龄(20.9±0.79)岁，平均体质量(60.2±3.76)kg，受试前接受健康检查均正常. 异丙酚通过TCI靶控系统进行静脉输注，靶控效应室浓度分别设定为1.5, 2.5和3.0 mg/L，当到达每个设定的浓度后，稳定10 min后，每隔3 min采血1次，每次3 mL，共5次. 抽取的血标本在4℃冰箱保存(肝素抗凝，实验在1 wk内完成). 异丙酚标准液1 g(mL)，纯度99.99%，捷利康中国有限公司提供)；磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，环己烷，正丁醇(分析纯，天津试剂二厂20041023). 用1 g异丙酚标准液配制成浓度分别为0.1, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0和10.0 mg/L的标准水溶液，用磷酸二氢钠、磷酸氢二钠配成pH=6.8的缓冲液，环己烷、正丁醇体积比按95∶5配制提取液. TCI 靶控泵(Alaris medical systems)，970CRT荧光分光光度计(上海三科仪器有限公司)，精密移液器(瑞士Socorex公司)，800型离心机(上海手术器械十厂)，XW80A振摇机(江苏海门市麒麟医用仪器厂).
1.2方法采用0.1 mg/L异丙酚标准水溶液1 mL，加入磷酸缓冲液4 mL，加环己烷/乙丁醇提取液1 mL，再加血浆1 mL，振摇、离心(3500 r/min)，取上清液. 用不含异丙酚的空白液作对照，在970CRT荧光分光光度计上扫描，(狭缝5 nm/5 nm，OR=4)得到异丙酚的激发光谱和发射光谱图(激发波长λex=265 nm，发射波长λem=310 nm)，以此波作为样本测定的激发波长和发射波长.
2结果
2.1标准曲线的绘制将异丙酚制成浓度为0.1, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0和10 mg/L的标准水溶液，加入磷酸缓冲对4 mL，加环己烷/乙丁醇1 mL，再加血浆1 mL，振荡2 min，离心10 min，取上清液测定荧光强度. 970CRT荧光分光光度计测量系统绘制标准曲线，结果表明异丙酚标准液的质量浓度在0.1～10.0 mg/L的范围内呈线性关系(r=0.9997). 以荧光强度(X)与异丙酚质量浓度(Y)进行线性回归，其回归方程为：Y＝0.426X-6.069.
2.2回收率和精密度取浓度为0.1，1.0和2.5 mg/L的标准样品溶液各5份，按样品测定操作进样，从标准曲线中读出相当于异丙酚的含量，计算回收率(RSD=s/x×100%). 各浓度日内重复测定5次，并连续测定5 d，计算绝对回收率及日内、日间的精密度(Tab 1). 从表中可以看出：异丙酚的平均加样回收率大于95%，日内和日间RSD均小于3%.
表1异丙酚的回收率 略
2.3样品浓度的测定将采集的血样按样品测定操作进样，从标准曲线中读出异丙酚的含量. 1.5, 2.5和3.0 mg/L三种靶控效应室浓度的实际测定结果分别为：(1.51±0.01)，(2.50±0.01)和(3.05±0.04) mg/L.
3讨论
因为大多数药物的效应与其血药浓度呈正相关[5]. 所以，调整血药浓度即可达到调整药物效应目的[6]. 靶控输注法(target controlled infusion，TCI)是指在输注静脉麻醉药时应用药代动力学和药效动力学原理，通过调节目标或靶位(血浆或效应部位)的药物浓度来控制或维持麻醉在适当的深度，并保持在稳定的血药浓度[7,8]. 本研究的目的就是要检测同一靶控效应室浓度下，是否能达到较为稳定的血药浓度. 以往的研究，血标本大多是在临床麻醉下采集的，标本中还有大量的其他的药物，如肌松药、镇痛药、止血药和激素类等药物，这些药物可能会影响到异丙酚血药浓度的测定，本研究使用单一的药物，避免了其他药物的影响. 研究结果表明实测浓度与目标血药浓度基本一致, 即目标浓度不变时实测浓度保持稳定, 这样医生可以根据临床需要成比例地调整目标浓度.
异丙酚为π环共轭不饱和结构，具有发射荧光的特性，用970CRT型荧光分光光度计能准确地检测其血药浓度. 实验结果表明，异丙酚投入量(0.05～15.00 mg/L)与测得的荧光强度间有很好的线性关系，异丙酚在人体代谢过程中符合药代动力学三室开放模型. 该方法灵敏度高，线性范围大，操作简便，可用于临床异丙酚血药浓度的检测.
【参考文献】
[1] Galletly DC，Short TG. Total intravenous anaesthesia using propofol infusion50 consecutive cases[J]. Anaesth Intens Care, 1988;16(2):150.
[2] 柴伟,于代华,高昌俊,等. 靶控输注异丙酚全凭静脉麻醉[J]. 第四军医大学学报, 2002;23(15):1398-1400.Chai W, Yu DH, Gao CJ, et al. Targetcontrolled infusion with propofol for total intravenous anesthesia[J]. J Fourth Mil Med Univ, 2002;23(15):1398-1400.
[3] 杜文力,王明霞,邢玉英,等. 反相高效液相色谱荧光法测定血清中异丙酚浓度[J]. 中国药房, 2002;13(2):96-97.Du WL, Wang MX, Xing YY, et al. Determination of propofol concentration in human serum with RPHPLC[J]. Chin Pharm, 2002;13(2):96-97.
[4] Jaap VUKY, Swanson RN, Rode Ra, et al. Pharmacodynamics of propofol in female patients[J]. Anesthesiology, 1992;77(1):3.
[5] Murray DM，Thorne GC，RigbyJones AE，et al. Electroencephalograph variables, drug concentrations and sedation scores in children emerging from propofol infusion anaesthesia[J]. Paediatr Anaesth, 2004;14(2):143-151.
[6] Williams RL. Dosage regimen design: Pharmacodynamic consideration[J]. J Clin Pharmacol, 1992;32(7):597.
[7] Mertens MJ, Engbers FH, Burm AG, et al. Predictive performance of computercontrolled infusion of remifentanil during propofol/remifentanil anaesthesia[J]. Br J Anaesth, 2003;90(2):132-141.
[8] Milne SE, Kenny GN, Schraag S. Propofol sparing effect of remifentanil using closedloop anaesthesia[J]. Br J Anaesth, 2003;90(5):623-629.
第四军医大学:1药学系化学教研室, 2口腔医院麻醉科,陕西 西安 710033
基金项目：国家自然科学基金(30300456)
作者简介：路丽华(1979)，女(汉族)，河北省唐县人. 助理实验师.
编辑许昌泰, 百拇医药(路丽华，张惠，高蓉，尉琳琳，吴红，李晓晔)
LU LiHua1，ZHANG Hui2，GAO Rong1，WEI LinLin1，WU Hong1, LI XiaoYe1
1Department of Chemistry, School of Pharmacy, 2Department of Anesthesiology, Stomatological Hospital, Fourth Military Medical University, Xian 710033, China
【Abstract】 AIM: To study the use of fluorescence detection in determining the propofol drug concentration in plasma. METHODS: Buffer solution of phosphoric acid and cyclohexanetertbutanol were added to plasma samples with different propofol concentration. After being vibrated, the samples were centrifugated. The upperclear solution was taken to determine the fluorescence intensity. The fluorescence detective excitation waves and emission waves were 265 nm and 310 nm respectively. RESULTS: Between the propofol concentrations and the fluorescence intensities, there was a good linear relationship in the range of 0.1-15.0 mg/L (r=0.9997). The average recovery was more than 95%. The relative standard deviation (RSD) of intraday and interday assays were all less than 3%. CONCLUSION: The method is sample, accurate and sensitive for determining drug concentration of propofol in plasma.
【Keywords】 propofol; drug concentration in plasma; fluorescence detection; pharmacokinetics
【摘要】 目的：探讨异丙酚血药浓度测定的荧光检测方法. 方法：在含异丙酚的人体血浆样品中加入磷酸缓冲液及环己烷/正丁醇，振摇、离心,取上清液测荧光强度(激发波长λex=265 nm，发射波长λem=310 nm). 结果：异丙酚标准液在浓度为0.1～15.0 mg/L的范围内，其荧光强度与质量浓度间具有线性关系(r=0.9997). 异丙酚的平均加样回收率大于95%，日内和日间RSD均小于3%. 结论：该方法简便、准确、灵敏度高，可用于临床异丙酚血药浓度检测.
【关键词】 异丙酚；血药浓度；荧光法；药代动力学
0引言
异丙酚是一种新型短效静脉麻醉药. 具有起效快、作用时间短等优点[1]，是临床应用较为广泛的麻醉药之一[2]. 杜文力等[3]报道多用高氯酸沉降法和甲醇沉降血清蛋白提取法测定异丙酚浓度，但回收率均偏低(低于86%). 而国外采用衍生化法提高回收率，但步骤繁琐[4]. 该药具有π共轭结构，具有较强的荧光特性. 为了满足药代动力学研究的需要，我们以环己烷、正丁醇作为提取液，研究并建立了一种简便、灵敏的荧光法来测定异丙酚的血药浓度，回收率可达95%以上.
1材料和方法
1.1材料选择男性健康志愿者8名，平均年龄(20.9±0.79)岁，平均体质量(60.2±3.76)kg，受试前接受健康检查均正常. 异丙酚通过TCI靶控系统进行静脉输注，靶控效应室浓度分别设定为1.5, 2.5和3.0 mg/L，当到达每个设定的浓度后，稳定10 min后，每隔3 min采血1次，每次3 mL，共5次. 抽取的血标本在4℃冰箱保存(肝素抗凝，实验在1 wk内完成). 异丙酚标准液1 g(mL)，纯度99.99%，捷利康中国有限公司提供)；磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，环己烷，正丁醇(分析纯，天津试剂二厂20041023). 用1 g异丙酚标准液配制成浓度分别为0.1, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0和10.0 mg/L的标准水溶液，用磷酸二氢钠、磷酸氢二钠配成pH=6.8的缓冲液，环己烷、正丁醇体积比按95∶5配制提取液. TCI 靶控泵(Alaris medical systems)，970CRT荧光分光光度计(上海三科仪器有限公司)，精密移液器(瑞士Socorex公司)，800型离心机(上海手术器械十厂)，XW80A振摇机(江苏海门市麒麟医用仪器厂).
1.2方法采用0.1 mg/L异丙酚标准水溶液1 mL，加入磷酸缓冲液4 mL，加环己烷/乙丁醇提取液1 mL，再加血浆1 mL，振摇、离心(3500 r/min)，取上清液. 用不含异丙酚的空白液作对照，在970CRT荧光分光光度计上扫描，(狭缝5 nm/5 nm，OR=4)得到异丙酚的激发光谱和发射光谱图(激发波长λex=265 nm，发射波长λem=310 nm)，以此波作为样本测定的激发波长和发射波长.
2结果
2.1标准曲线的绘制将异丙酚制成浓度为0.1, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0和10 mg/L的标准水溶液，加入磷酸缓冲对4 mL，加环己烷/乙丁醇1 mL，再加血浆1 mL，振荡2 min，离心10 min，取上清液测定荧光强度. 970CRT荧光分光光度计测量系统绘制标准曲线，结果表明异丙酚标准液的质量浓度在0.1～10.0 mg/L的范围内呈线性关系(r=0.9997). 以荧光强度(X)与异丙酚质量浓度(Y)进行线性回归，其回归方程为：Y＝0.426X-6.069.
2.2回收率和精密度取浓度为0.1，1.0和2.5 mg/L的标准样品溶液各5份，按样品测定操作进样，从标准曲线中读出相当于异丙酚的含量，计算回收率(RSD=s/x×100%). 各浓度日内重复测定5次，并连续测定5 d，计算绝对回收率及日内、日间的精密度(Tab 1). 从表中可以看出：异丙酚的平均加样回收率大于95%，日内和日间RSD均小于3%.
表1异丙酚的回收率 略
2.3样品浓度的测定将采集的血样按样品测定操作进样，从标准曲线中读出异丙酚的含量. 1.5, 2.5和3.0 mg/L三种靶控效应室浓度的实际测定结果分别为：(1.51±0.01)，(2.50±0.01)和(3.05±0.04) mg/L.
3讨论
因为大多数药物的效应与其血药浓度呈正相关[5]. 所以，调整血药浓度即可达到调整药物效应目的[6]. 靶控输注法(target controlled infusion，TCI)是指在输注静脉麻醉药时应用药代动力学和药效动力学原理，通过调节目标或靶位(血浆或效应部位)的药物浓度来控制或维持麻醉在适当的深度，并保持在稳定的血药浓度[7,8]. 本研究的目的就是要检测同一靶控效应室浓度下，是否能达到较为稳定的血药浓度. 以往的研究，血标本大多是在临床麻醉下采集的，标本中还有大量的其他的药物，如肌松药、镇痛药、止血药和激素类等药物，这些药物可能会影响到异丙酚血药浓度的测定，本研究使用单一的药物，避免了其他药物的影响. 研究结果表明实测浓度与目标血药浓度基本一致, 即目标浓度不变时实测浓度保持稳定, 这样医生可以根据临床需要成比例地调整目标浓度.
异丙酚为π环共轭不饱和结构，具有发射荧光的特性，用970CRT型荧光分光光度计能准确地检测其血药浓度. 实验结果表明，异丙酚投入量(0.05～15.00 mg/L)与测得的荧光强度间有很好的线性关系，异丙酚在人体代谢过程中符合药代动力学三室开放模型. 该方法灵敏度高，线性范围大，操作简便，可用于临床异丙酚血药浓度的检测.
【参考文献】
[1] Galletly DC，Short TG. Total intravenous anaesthesia using propofol infusion50 consecutive cases[J]. Anaesth Intens Care, 1988;16(2):150.
[2] 柴伟,于代华,高昌俊,等. 靶控输注异丙酚全凭静脉麻醉[J]. 第四军医大学学报, 2002;23(15):1398-1400.Chai W, Yu DH, Gao CJ, et al. Targetcontrolled infusion with propofol for total intravenous anesthesia[J]. J Fourth Mil Med Univ, 2002;23(15):1398-1400.
[3] 杜文力,王明霞,邢玉英,等. 反相高效液相色谱荧光法测定血清中异丙酚浓度[J]. 中国药房, 2002;13(2):96-97.Du WL, Wang MX, Xing YY, et al. Determination of propofol concentration in human serum with RPHPLC[J]. Chin Pharm, 2002;13(2):96-97.
[4] Jaap VUKY, Swanson RN, Rode Ra, et al. Pharmacodynamics of propofol in female patients[J]. Anesthesiology, 1992;77(1):3.
[5] Murray DM，Thorne GC，RigbyJones AE，et al. Electroencephalograph variables, drug concentrations and sedation scores in children emerging from propofol infusion anaesthesia[J]. Paediatr Anaesth, 2004;14(2):143-151.
[6] Williams RL. Dosage regimen design: Pharmacodynamic consideration[J]. J Clin Pharmacol, 1992;32(7):597.
[7] Mertens MJ, Engbers FH, Burm AG, et al. Predictive performance of computercontrolled infusion of remifentanil during propofol/remifentanil anaesthesia[J]. Br J Anaesth, 2003;90(2):132-141.
[8] Milne SE, Kenny GN, Schraag S. Propofol sparing effect of remifentanil using closedloop anaesthesia[J]. Br J Anaesth, 2003;90(5):623-629.
第四军医大学:1药学系化学教研室, 2口腔医院麻醉科,陕西 西安 710033
基金项目：国家自然科学基金(30300456)
作者简介：路丽华(1979)，女(汉族)，河北省唐县人. 助理实验师.
编辑许昌泰, 百拇医药(路丽华，张惠，高蓉，尉琳琳，吴红，李晓晔)