氧化应激对鱼藤酮PC12细胞中的毒性作用
【摘要】 目的 探讨氧化应激在鱼藤酮多巴胺能神经元PC12细胞中的毒性作用。 方法 用高分化的PC12细胞作为多巴胺能神经元的细胞模型，经不同浓度的鱼藤酮处理，观察细胞形态及其超微结构，四甲基偶氮唑盐法检测细胞活性和增殖抑制及细胞代谢状态，生化分析法检测SOD活力、MDA含量，特异性DCF-DA荧光探针检测细胞内ROS水平。 结果 经鱼藤酮处理24h后PC12细胞突起样结构消失，细胞体积变小、形态变圆，部分细胞呈悬浮状态;细胞线粒体代谢和超微结构发生改变;PC12细胞增殖抑制，细胞活性降低;细胞内的SOD活力下降，MDA含量增高;荧光探针标记显示PC12细胞荧光强度增加，细胞内ROS含量增加。 结论 鱼藤酮在体外对多巴胺能神经元有毒性作用，可抑制细胞增殖，影响线粒体代谢，氧化应激可能在鱼藤酮的多巴胺神经元毒性机制中起作用。
【关键词】 鱼藤酮;PC12细胞;氧化性应激
Oxidative stress action in rotenone neurotoxicity on PC12
SAI Yan，WU Qiang，CHEN Jun-feng，YUE Wei-dong ，DONG Zhao-jun
1.Department of Preventive Medicine，Third Military Medical University，Chongqing 400038，China;
2.Health Science Center of Shanghai Institutes for Biologi-cal Sciences，CAS and Institute of Biomedical Sciences，Ruijin Hospital，Shanghai Second Medical U-niversity，Shanghai 200025，China
【Abstract】 Objective To investigate the mechanism of oxidative stress in rotenone neurotoxicity onto dopaminergic neuron.Methods High differentiated PC12cells as dopaminergic neurons were treated by different concentrations of rotenone.Cell morphology was observed with inverted phase contrast micro-scope and transmission electron microscope.SOD and MDA were detected with biochemical assay.And the specific fluorescent probe(DCF-DA)was used to examine the ROS in PC12cells.Results After being treated with rotenone for24hours，most of PC12cells treated by rotenone became smaller and rounder.The structure and metabolism of mitochondrial changed.Cell proliferation inhibition increased and cell activity decreased significantly when treated by rotenone.SOD increased and MDA decreased.The intensity of fluorescence was more obvious in PC12cells treated by rotenone compared with control group.Conclusions In vitro，rotenone should be neurotoxic to dopaminergic neuron.It was suggested that rotenone might affect the metabolism of oxidative stress in the pathogenesis of dopaminergic neuron.
【Key words】 Rotenone;PC12cells;Oxidative stress(Chin J Dis Control Prev2006，10(3):241-244)
帕金森病(Parkinson's disease，PD)是一种常见的中老年人进行性神经系统退行性疾病，其主要病理特征是黑质致密部多巴胺(dopamine，DA)能神经元显著缺失，从而导致纹状体中的DA含量减低 [1] 。家族性PD与遗传因素有关，但大多数散在患者的病因迄今不明 [2] 。鱼藤酮作为杀虫剂广泛使用，其虽无明显的遗传毒性作用，但大量使用可造成环境污染，并对人类神经系统造成一定的危害 [3～5] 。本实验旨在观察鱼藤酮对PC12细胞的毒性作用，研究氧化应激在PC12细胞损伤中的作用，为阐明鱼藤酮的神经毒性作用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 细胞培养
PC12细胞培养在高糖DMEM培养基。每2～3天换液，当单层培养细胞汇合以后，接种传代培养。鱼藤酮溶于二甲亚砜中，配成终浓度为10nmol/L的鱼藤酮母液，临用前稀释。
1.2 细胞形态学观察
1.2.1 倒置相差显微镜
PC12细胞经鱼藤酮作用24h，倒置相差显微镜观察。
1.2.2 电镜观察
PC12细胞经药物处理后，透射电镜观察。
1.3 四甲基偶氮唑盐实验
将生长良好的PC12细胞以2×10 4 /ml接种于平底96孔板培养48h，使细胞完全贴壁。药物处理后培养24h，每孔加20μl四甲基偶氮唑盐溶液，孵育4h。每孔再加入150μl DMSO，室温下振荡30min，酶标仪测定各孔吸光度OD值。计算鱼藤酮对PC12细胞的生长指数和增殖抑制率，并绘制细胞生长指数曲线和细胞增殖抑制曲线。
1.4 PC12细胞线粒体代谢改变
PC12细胞经药物处理后，加入四甲基偶氮唑盐，观察细胞线粒体代谢情况。
1.5 PC12细胞内丙二醛和超氧化物歧化酶的测定
具体操作按照试剂盒说明书进行。
1.6 PC12细胞内ROS含量测定
药物处理后，用100μmol/L的DCF-DA孵育30～40min，经PBS液漂洗后，荧光显微镜观察(激发波长488nm，发射波长为510nm)。
1.7 统计分析
采用SPSS11.0统计软件包进行数据统计，实验数据以x±s表示。多个样本均数比较用单因素方差分析。
2 结果
2.1 形态学观察
2.1.1 光镜观察
光镜下观察鱼藤酮处理的PC12细胞，细胞变圆变小，细胞突起减少且变短，部分细胞呈悬浮状态。对照组细胞则呈成纤维细胞状，具有长的突起，细胞贴壁生长(图1)。
2.1.2 电镜观察
鱼藤酮(1.0μmol/L)处理的PC12细胞具有明显的形态学改变:线粒体肿胀，出现空泡变性，无明显的嵴，内质网扩张，游离的核糖体增加。对照组PC12细胞具有正常的细胞形态和亚细胞结构，同时镜下可观察到明显的核分裂相(图2)。
2.2 四甲基偶氮唑盐实验
2.2.1 鱼藤酮对PC12细胞活性的影响
鱼藤酮作用于高分化PC12细胞检测其DA神经元毒性作用。不同浓度的鱼藤酮(0.0μmol/L、0.1μmol/L、0.5μmol/L和1.0μmol/L)作用于PC12细胞，其生长指数分别为76.01%、73.71%、65.57%和58.87%，随鱼藤酮浓度的增加而降低。当浓度增加到1.0μmol/L时，其生长指数与对照组差异有显著性(图3)。
2.2.2 PC12细胞的增殖抑制改变
四甲基偶氮唑盐细胞活性检测可见鱼藤酮明显抑制细胞增殖，鱼藤酮作用后的PC12细胞增殖能力降低，呈剂量依赖性。随着药物剂量加大，细胞增殖抑制程度明显(图3)。
2.3 PC12细胞内SOD、MDA含量改变
为明确鱼藤酮对细胞内氧化还原状态的影响，检测了PC12细胞内SOD活力、MDA含量。实验组SOD活力和MDA含量与正常对照组相比均出现改变，当鱼藤酮浓度增至1.0μmol/L时，SOD活力出现显著下降，而MDA含量显著高于正常对照组(表1)。表1 PC12细胞内SOD、MDA含量改变(略)
2.4 PC12细胞线粒体代谢
处于对数生长期的PC12细胞加入四甲基偶氮唑盐后，显微镜下可见实验组PC12细胞出现较多丧失了代谢功能的破碎细胞。对照组的细胞较完整，有明显的代谢，细胞内及细胞周围可见蓝紫色甲簪颗粒(图4)。
2.5 PC12细胞ROS含量改变
DCF-DA法借助荧光显微镜通过荧光的强弱可以得知细胞内的活性氧由基(reactive oxygen species，ROS)水平，进而推知细胞的损伤程度。实验显示鱼藤酮作用PC12细胞组荧光强度明显高于对照组，鱼藤酮处理的PC12细胞内的ROS水平较正常对照组增加(图5)。
3 讨论
鱼藤酮是一种广泛应用于农业的杀虫剂，主要抑制线粒体复合物I，导致机体ATP合成障碍 [6] ，短期暴露对细胞活性的影响不大，但是长期暴露可明显降低细胞活性。用小动物进行的研究 [7，8] 结果提示，长期接触鱼藤酮等线粒体复合酶I抑制剂，可出现类似PD样病理学及行为学改变，包括黑质纹状体DA神经元减少等。PC12细胞为大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤克隆化的细胞株，具有典型的神经内分泌细胞特征，表现出神经细胞的形态和生物化学特性，是体外研究鱼藤酮神经细胞毒性的良好模型。
PC12细胞经鱼藤酮处理后，细胞形态学及细胞代谢发生改变。随着鱼藤酮浓度的增加，这些改变愈加明显。生化分析结果显示，当鱼藤酮浓度增加至1.0μmol/L时，MDA和SOD与对照组比较均发生了显著性改变，PC12细胞的荧光强度增加明显，ROS含量增加，且鱼藤酮对PC12的影响也表现在细胞的超微结构改变。Sherer等 [8] 和Comfier [9] 等报道大鼠鱼藤酮中毒时脑内多处DA神经元损伤，且伴有明显的氧化损伤，与本文细胞模型实验结果相吻合。综合分析上述材料认为，氧化应激损伤可能在鱼藤酮的DA神经元毒性中发挥重要作用。
SOD对机体的氧化和抗氧化平衡起着至关重要的作用，它能清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤，其活性大小或含量反映了细胞的抗氧化能力。MDA是脂质过氧化的产物，它的含量高低可反映机体内脂质过氧化的程度。细胞在生理条件下不断产生ROS，同时机体存在着清除和抑制自由基产生的系统，但在鱼藤酮处理的PC12细胞可导致两者失去平衡。本实验中表现为SOD活力下降，PC12细胞清除自由基能力下降，造成ROS增多，进而导致生物膜中的多不饱和脂肪酸过氧化反应和脂 质过氧化物的分解产物MDA含量增加，引起细胞损伤，细胞增殖抑制，线粒体代谢下降。
DA代谢本身是高度氧化的过程，生理状态下代谢产生的氧化产物不足以引起组织的损伤，鱼藤酮抑制线粒体后引起氧化应激，而线粒体是细胞对氧化应激最敏感的细胞器，自由基可造成线粒体损伤;线粒体损伤反过来进一步加剧氧化应激。这些ROS与DNA、脂质和蛋白反应，引起氧化损伤，产生大量的超氧阴离子、过氧化氢、羟自由基和单线态氧等，加重呼吸链的损伤，形成一个恶性循环。这可能是导致鱼藤酮处理PC12神经细胞死亡的重要原因，是鱼藤酮DA神经元毒性的作用机制之一，鱼藤酮整体动物实验选择性DA神经元毒性的作用机制。
综上所述，本研究认为鱼藤酮对DA神经元PC12具有毒性作用，氧化应激是鱼藤酮的PC12细胞毒性作用机制之一，从而进一步证实了PD的“农药-环境暴露因素”的假设。
【参考文献】
[1]Bulpitt CJ，Shaw K，Clifton P，et al.The symptoms of patients treated for Parkinson's disease [J].Clin Neuropharmacol，1985，8(2):175-183.
[2]Betarbet R，Sherer TB，MacKenzie G.Chronic systemic pesticide exposure reproduces features of Parkinson's disease [J].Nat Neurosci，2000，3:1301-1306.
[3]董兆君.鱼藤酮的多巴胺神经元毒性与帕金森病[J]. 国外医学·神经病学神经外科学分册 ，2001，5:357-360.
[4]杨黠，董兆君，范舒，等.农药鱼藤酮的遗传毒性鉴定[J]. 疾病控制杂志 ，2005，2:125-126.
[5]Alam M，Schmidt WJ.Rotenone destroys dopaminergic neurons and induces parkinsonian symptoms in rats [J].Behav Brain Res，2002，136(1):317-324.
[6]Fleming SM，Zhu C，Fernagut PO，et al.Behavioral and im-munohistochemical effects of chronic intravenous and subcutaneous infusions of varying doses of rotenone [J].Exp Neurol，2004，187:418-429.
[7]Degli Esposti M.Inhibitors of NADH-ubiquinone reductase:an overview[J].Biochim Biophys Acta，1998，1364(2):222-235.
[8]Sherer TB，Kim JH，Betarbet R，et al.Subcutaneous rotenone exposure causes highly selective dopaminergic degeneration and al-pha-synuclein aggregation[J].Exp Neurol，2003，179(1):9-16.
[9] Comfier A，Mofin C，Zini R，et al.Nicotine protects rat brain mltohondria against experimental injuries [J ].Neuro Pharmacology，2003，44(5):642-652.
【基金项目】国家自然科学基金项目(30400347)
【作者单位】 1 第三军医大学预防医学系，重庆 400038
2 上海第二医科大学瑞金医院生命科学研究院健康科学中心，上海 200025
【作者简介】赛燕(1976-)，女，山东威海人，助教，在读博士
研究生。主要研究方向:化学毒物的神经褪变性作用。
【通讯作者】董兆君Tel:023-68752285, 百拇医药(赛燕，吴强，陈峻峰，乐卫东，董兆君)
【关键词】 鱼藤酮;PC12细胞;氧化性应激
Oxidative stress action in rotenone neurotoxicity on PC12
SAI Yan，WU Qiang，CHEN Jun-feng，YUE Wei-dong ，DONG Zhao-jun
1.Department of Preventive Medicine，Third Military Medical University，Chongqing 400038，China;
2.Health Science Center of Shanghai Institutes for Biologi-cal Sciences，CAS and Institute of Biomedical Sciences，Ruijin Hospital，Shanghai Second Medical U-niversity，Shanghai 200025，China
【Abstract】 Objective To investigate the mechanism of oxidative stress in rotenone neurotoxicity onto dopaminergic neuron.Methods High differentiated PC12cells as dopaminergic neurons were treated by different concentrations of rotenone.Cell morphology was observed with inverted phase contrast micro-scope and transmission electron microscope.SOD and MDA were detected with biochemical assay.And the specific fluorescent probe(DCF-DA)was used to examine the ROS in PC12cells.Results After being treated with rotenone for24hours，most of PC12cells treated by rotenone became smaller and rounder.The structure and metabolism of mitochondrial changed.Cell proliferation inhibition increased and cell activity decreased significantly when treated by rotenone.SOD increased and MDA decreased.The intensity of fluorescence was more obvious in PC12cells treated by rotenone compared with control group.Conclusions In vitro，rotenone should be neurotoxic to dopaminergic neuron.It was suggested that rotenone might affect the metabolism of oxidative stress in the pathogenesis of dopaminergic neuron.
【Key words】 Rotenone;PC12cells;Oxidative stress(Chin J Dis Control Prev2006，10(3):241-244)
帕金森病(Parkinson's disease，PD)是一种常见的中老年人进行性神经系统退行性疾病，其主要病理特征是黑质致密部多巴胺(dopamine，DA)能神经元显著缺失，从而导致纹状体中的DA含量减低 [1] 。家族性PD与遗传因素有关，但大多数散在患者的病因迄今不明 [2] 。鱼藤酮作为杀虫剂广泛使用，其虽无明显的遗传毒性作用，但大量使用可造成环境污染，并对人类神经系统造成一定的危害 [3～5] 。本实验旨在观察鱼藤酮对PC12细胞的毒性作用，研究氧化应激在PC12细胞损伤中的作用，为阐明鱼藤酮的神经毒性作用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 细胞培养
PC12细胞培养在高糖DMEM培养基。每2～3天换液，当单层培养细胞汇合以后，接种传代培养。鱼藤酮溶于二甲亚砜中，配成终浓度为10nmol/L的鱼藤酮母液，临用前稀释。
1.2 细胞形态学观察
1.2.1 倒置相差显微镜
PC12细胞经鱼藤酮作用24h，倒置相差显微镜观察。
1.2.2 电镜观察
PC12细胞经药物处理后，透射电镜观察。
1.3 四甲基偶氮唑盐实验
将生长良好的PC12细胞以2×10 4 /ml接种于平底96孔板培养48h，使细胞完全贴壁。药物处理后培养24h，每孔加20μl四甲基偶氮唑盐溶液，孵育4h。每孔再加入150μl DMSO，室温下振荡30min，酶标仪测定各孔吸光度OD值。计算鱼藤酮对PC12细胞的生长指数和增殖抑制率，并绘制细胞生长指数曲线和细胞增殖抑制曲线。
1.4 PC12细胞线粒体代谢改变
PC12细胞经药物处理后，加入四甲基偶氮唑盐，观察细胞线粒体代谢情况。
1.5 PC12细胞内丙二醛和超氧化物歧化酶的测定
具体操作按照试剂盒说明书进行。
1.6 PC12细胞内ROS含量测定
药物处理后，用100μmol/L的DCF-DA孵育30～40min，经PBS液漂洗后，荧光显微镜观察(激发波长488nm，发射波长为510nm)。
1.7 统计分析
采用SPSS11.0统计软件包进行数据统计，实验数据以x±s表示。多个样本均数比较用单因素方差分析。
2 结果
2.1 形态学观察
2.1.1 光镜观察
光镜下观察鱼藤酮处理的PC12细胞，细胞变圆变小，细胞突起减少且变短，部分细胞呈悬浮状态。对照组细胞则呈成纤维细胞状，具有长的突起，细胞贴壁生长(图1)。
2.1.2 电镜观察
鱼藤酮(1.0μmol/L)处理的PC12细胞具有明显的形态学改变:线粒体肿胀，出现空泡变性，无明显的嵴，内质网扩张，游离的核糖体增加。对照组PC12细胞具有正常的细胞形态和亚细胞结构，同时镜下可观察到明显的核分裂相(图2)。
2.2 四甲基偶氮唑盐实验
2.2.1 鱼藤酮对PC12细胞活性的影响
鱼藤酮作用于高分化PC12细胞检测其DA神经元毒性作用。不同浓度的鱼藤酮(0.0μmol/L、0.1μmol/L、0.5μmol/L和1.0μmol/L)作用于PC12细胞，其生长指数分别为76.01%、73.71%、65.57%和58.87%，随鱼藤酮浓度的增加而降低。当浓度增加到1.0μmol/L时，其生长指数与对照组差异有显著性(图3)。
2.2.2 PC12细胞的增殖抑制改变
四甲基偶氮唑盐细胞活性检测可见鱼藤酮明显抑制细胞增殖，鱼藤酮作用后的PC12细胞增殖能力降低，呈剂量依赖性。随着药物剂量加大，细胞增殖抑制程度明显(图3)。
2.3 PC12细胞内SOD、MDA含量改变
为明确鱼藤酮对细胞内氧化还原状态的影响，检测了PC12细胞内SOD活力、MDA含量。实验组SOD活力和MDA含量与正常对照组相比均出现改变，当鱼藤酮浓度增至1.0μmol/L时，SOD活力出现显著下降，而MDA含量显著高于正常对照组(表1)。表1 PC12细胞内SOD、MDA含量改变(略)
2.4 PC12细胞线粒体代谢
处于对数生长期的PC12细胞加入四甲基偶氮唑盐后，显微镜下可见实验组PC12细胞出现较多丧失了代谢功能的破碎细胞。对照组的细胞较完整，有明显的代谢，细胞内及细胞周围可见蓝紫色甲簪颗粒(图4)。
2.5 PC12细胞ROS含量改变
DCF-DA法借助荧光显微镜通过荧光的强弱可以得知细胞内的活性氧由基(reactive oxygen species，ROS)水平，进而推知细胞的损伤程度。实验显示鱼藤酮作用PC12细胞组荧光强度明显高于对照组，鱼藤酮处理的PC12细胞内的ROS水平较正常对照组增加(图5)。
3 讨论
鱼藤酮是一种广泛应用于农业的杀虫剂，主要抑制线粒体复合物I，导致机体ATP合成障碍 [6] ，短期暴露对细胞活性的影响不大，但是长期暴露可明显降低细胞活性。用小动物进行的研究 [7，8] 结果提示，长期接触鱼藤酮等线粒体复合酶I抑制剂，可出现类似PD样病理学及行为学改变，包括黑质纹状体DA神经元减少等。PC12细胞为大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤克隆化的细胞株，具有典型的神经内分泌细胞特征，表现出神经细胞的形态和生物化学特性，是体外研究鱼藤酮神经细胞毒性的良好模型。
PC12细胞经鱼藤酮处理后，细胞形态学及细胞代谢发生改变。随着鱼藤酮浓度的增加，这些改变愈加明显。生化分析结果显示，当鱼藤酮浓度增加至1.0μmol/L时，MDA和SOD与对照组比较均发生了显著性改变，PC12细胞的荧光强度增加明显，ROS含量增加，且鱼藤酮对PC12的影响也表现在细胞的超微结构改变。Sherer等 [8] 和Comfier [9] 等报道大鼠鱼藤酮中毒时脑内多处DA神经元损伤，且伴有明显的氧化损伤，与本文细胞模型实验结果相吻合。综合分析上述材料认为，氧化应激损伤可能在鱼藤酮的DA神经元毒性中发挥重要作用。
SOD对机体的氧化和抗氧化平衡起着至关重要的作用，它能清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤，其活性大小或含量反映了细胞的抗氧化能力。MDA是脂质过氧化的产物，它的含量高低可反映机体内脂质过氧化的程度。细胞在生理条件下不断产生ROS，同时机体存在着清除和抑制自由基产生的系统，但在鱼藤酮处理的PC12细胞可导致两者失去平衡。本实验中表现为SOD活力下降，PC12细胞清除自由基能力下降，造成ROS增多，进而导致生物膜中的多不饱和脂肪酸过氧化反应和脂 质过氧化物的分解产物MDA含量增加，引起细胞损伤，细胞增殖抑制，线粒体代谢下降。
DA代谢本身是高度氧化的过程，生理状态下代谢产生的氧化产物不足以引起组织的损伤，鱼藤酮抑制线粒体后引起氧化应激，而线粒体是细胞对氧化应激最敏感的细胞器，自由基可造成线粒体损伤;线粒体损伤反过来进一步加剧氧化应激。这些ROS与DNA、脂质和蛋白反应，引起氧化损伤，产生大量的超氧阴离子、过氧化氢、羟自由基和单线态氧等，加重呼吸链的损伤，形成一个恶性循环。这可能是导致鱼藤酮处理PC12神经细胞死亡的重要原因，是鱼藤酮DA神经元毒性的作用机制之一，鱼藤酮整体动物实验选择性DA神经元毒性的作用机制。
综上所述，本研究认为鱼藤酮对DA神经元PC12具有毒性作用，氧化应激是鱼藤酮的PC12细胞毒性作用机制之一，从而进一步证实了PD的“农药-环境暴露因素”的假设。
【参考文献】
[1]Bulpitt CJ，Shaw K，Clifton P，et al.The symptoms of patients treated for Parkinson's disease [J].Clin Neuropharmacol，1985，8(2):175-183.
[2]Betarbet R，Sherer TB，MacKenzie G.Chronic systemic pesticide exposure reproduces features of Parkinson's disease [J].Nat Neurosci，2000，3:1301-1306.
[3]董兆君.鱼藤酮的多巴胺神经元毒性与帕金森病[J]. 国外医学·神经病学神经外科学分册 ，2001，5:357-360.
[4]杨黠，董兆君，范舒，等.农药鱼藤酮的遗传毒性鉴定[J]. 疾病控制杂志 ，2005，2:125-126.
[5]Alam M，Schmidt WJ.Rotenone destroys dopaminergic neurons and induces parkinsonian symptoms in rats [J].Behav Brain Res，2002，136(1):317-324.
[6]Fleming SM，Zhu C，Fernagut PO，et al.Behavioral and im-munohistochemical effects of chronic intravenous and subcutaneous infusions of varying doses of rotenone [J].Exp Neurol，2004，187:418-429.
[7]Degli Esposti M.Inhibitors of NADH-ubiquinone reductase:an overview[J].Biochim Biophys Acta，1998，1364(2):222-235.
[8]Sherer TB，Kim JH，Betarbet R，et al.Subcutaneous rotenone exposure causes highly selective dopaminergic degeneration and al-pha-synuclein aggregation[J].Exp Neurol，2003，179(1):9-16.
[9] Comfier A，Mofin C，Zini R，et al.Nicotine protects rat brain mltohondria against experimental injuries [J ].Neuro Pharmacology，2003，44(5):642-652.
【基金项目】国家自然科学基金项目(30400347)
【作者单位】 1 第三军医大学预防医学系，重庆 400038
2 上海第二医科大学瑞金医院生命科学研究院健康科学中心，上海 200025
【作者简介】赛燕(1976-)，女，山东威海人，助教，在读博士
研究生。主要研究方向:化学毒物的神经褪变性作用。
【通讯作者】董兆君Tel:023-68752285, 百拇医药(赛燕，吴强，陈峻峰，乐卫东，董兆君)