络病与心脑血管疾病相关性及治疗研究进展 通心络对大鼠脑缺血再灌注损伤后神经干细胞增殖分化的
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4. 结果的判定
BrdU标记法 各组大鼠于处死前两天即造模后第1、2天,第5、6天,第12、13天,第19、20天时分别腹腔注射BrdU生理盐水液(sigma),按100 mg/kg体重的量,每日给药两次,间隔8 h。
脑组织切片制备 各组大鼠于末次腹腔注射BrdU后24 h,在10 %水合氯醛麻醉下,迅速断头取脑,放入特制的小盒内,缓缓平放入盛有液氮的小杯中,当盒底接触液氮时即开始气化沸腾,10~20 min后脑组织迅速冰结成块,取出脑组织冰块立即置入恒温箱切片机冷冻切片。参考《大鼠脑立体定向图谱》,以前卤后0.3~1.2 mm为侧脑室;前卤后3.14~4.52 mm为海马区部位,连续冠状切片,切片以0.1%多聚赖氨酸处理,每张脑片厚8 μm,所得切片依次入4 %多聚甲醛固定15 min后,吹干,置4 ℃冰箱中备用。
BrdU与β-Tubulin、BrdU与GFAP免疫荧光双标染色法 分别取每只大鼠相邻的SVZ、DG区脑片各8张,参考鸡尾酒法按以下步骤行免疫荧光染色:将脑片入2 mol/L HCL中30 min(37 ℃);30.1 M硼酸缓冲液(pH 8.4)洗10 min;0.2%H2O2放置30 min;脑片上分别加入正常血清封闭液,即正常山羊血清、正常山羊血清+正常兔血清60 min后甩去多余的血清,不以PBS冲洗;再分别加一抗:小鼠抗大鼠 BrdU IgG(1:50)和兔抗大鼠β-Tubulin IgG(1:100)或山羊抗大鼠 GFAP IgG(1:100)混和液,湿盒中4 ℃孵育72 h。洗后再分别加二抗:山羊抗兔 IgG-TRITC(1:100)+山羊抗小鼠IgG-FITC(1:20),或兔抗山羊 IgG-TRITC(1:100)+山羊抗小鼠IgG-FITC(1:20),避光,湿盒中室温孵育3h。磷酸缓冲液(PBS)冲洗两次,缓甘油封片,避光保存,即送激光共聚焦显微镜下观察。
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各组另取两张片为阴性对照,一张不加入一抗,另一张不加入二抗,余步骤同上。
上述各图片在激光共聚焦显微镜统一放大倍数(10×20)下,设置相等的检测窗口面积,随机选10个阳性细胞区域,分别测其缺血侧DG、SVZ区阳性细胞的荧光强度值并求均值,作为此张片的阳性细胞荧光强度值。
统计学处理
所得数据输入计算机用SPSS10.0软件进行统计处理。检测数据以x±s表示,作单因素方差分析和t 检验。
结 果
1. 大鼠脑缺血再灌注后各时段活动情况
大鼠脑缺血再灌注后各个时间段活动较正常组减少,体重减轻。免疫组化双标图片显示,各时段对照组BrdU阳性细胞主要分布在缺血侧皮质、DG、SVZ、脉络丛上皮细胞等;部分BrdU阳性细胞同时呈β-Tubulin、GFAP染色阳性;随缺血再灌注时间的延长,荧光强度值增加,其中造模后第7天大鼠DG区BrdU阳性细胞荧光强度值最高,与其他时间点相比,差异极显著(P<0.001);第14天时SVZ、脉络丛上皮细胞的BrdU阳性细胞荧光强度值最高,与其他时间点相比,差异极显著(P<0.001);但造模后第21天时,BrdU阳性细胞荧光强度和BrdU+β-Tubulin、BrdU+GFAP免疫双标荧光强度值下降, 但仍高于第3天时的强度值,差异显著(P<0.005)。同时发现,各时间段缺血侧SVZ、脉络丛上皮细胞BrdU+GFAP免疫双标荧光强度值高于DG区的荧光强度值;而DG区的BrdU+β-Tubulin免疫双标荧光强度值高于SVZ、脉络丛上皮细胞的荧光强度值,且均在第14天时强度最高。表明在海马颗粒层和齿状回增生的干细胞大部分分化为神经元,而在SVZ、脉络丛上皮细胞增生的干细胞大部分分化为星形胶质细胞。
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2. 通心络对脑缺血再灌注大鼠不同时间段NSC增殖分化的影响
实验观察到,给予通心络干预后,第3天缺血侧DG、SVZ的BrdU阳性细胞荧光强度值(表1)和BrdU+β-Tubulin(表2)、BrdU+GFAP免疫组化双标荧光强度值(表3)与模型对照组相比无显著差异。通心络干预后第7、14、21天时DG、SVZ的BrdU阳性细胞荧光强度值和BrdU+β-Tubulin、BrdU+GFAP免疫组化双标荧光强度值均高于缺血对照组,差异极显著(P<0.001)。通心络大剂量组第7、14、21天时荧光值均高于通心络小剂量组,差异极显著(P<0.001)。表明通心络干预的第7天起,缺血侧DG、SVZ神经干细胞开始大量增殖,部分增殖细胞分化为神经元和星形胶质细胞,并持续到缺血后第21天,而以通心络大剂量组效果更为明显。相关数据见表1、2、3,免疫组化检测结果见图1~4。(图1、2见6月29日第16版,图4见7月13日第17版)(未完待续)
图3 缺血再灌注对照组与通心络治疗组SVZ BrdU免疫组化荧光标记图片(10×20)
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A、B、C、D分别为缺血再灌后第3、7、14、21天的SVZ BrdU荧光标记图片。control为对照组,TX为通心络小剂量组,TD为通心络大剂量组。
表1 各组大鼠脑缺血侧室管膜及SVZ、DG区BrdU阳性细胞荧光强度值的比较(x±s,×200)
组
对照组
通心络小剂量组
通心络大剂量组
对照组
通心络小剂量组
通心络大剂量组
Ncase
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6
8
8
6
8
8
Nscore 3d
67.3±5.7
67.7±7.5
67.5±5.8
76.5±10.2
78.6±13.5
75.8±11.4
, 百拇医药
Nscore 7d
86.4±9.0
111.3±8.9**
132.9±8.5**△△
168.3±15.7
196.9±12.4**
210.0±13.3**△△
Nscore 14d
118.3±16.2
150.9±14.3**
175.0±10.2**△△
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100.1±12.3
127.7±14.3**
155.0±13.3**△△
Nscore 21d
72.5±9.4
92.3±10.4**
118.0±16.0**△
87.2±4.7
96.0±8.8*
111.0±6.5**△△
注:各时段各组强度值以单因素方差分析t检验,与对照组比较 *P<0.05 **P<0.01;与通心络小剂量组比较△P<0.05,△△P<0.001。
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表2 各组大鼠脑缺血侧室管膜及SVZ、DG区BrdU+β-Tubulin阳性细胞荧光强度值的比较(x±s,×200)
组
对照组
通心络小剂量组
通心络大剂量组
对照组
通心络小剂量组
通心络大剂量组
Ncase
6
8
8
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6
8
8
Nscore 3d
53.1±10.2
54.6±11.6
55.1±12.4
66.2±11.4
68.6±13.2
67.8±12.1
Nscore 7d
75.0±10.8
, 百拇医药
98.4±12.3**
122.5±11.4**△
90.3±12.4
119.4±16.3**
146.9±10.7**△
Nscore 14d
101.2±10.9
127.4±12.8**
155.9±13.4**△△
134.7±14.6
163.8±13.3**
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215.9±15.7**△△
Nscore 21d
71.5±7.3
89.7±10.3*
110.8±9.3**△
78.5±10.2
100.3±11.0*
121.9±9.8**△
注:各时段各组强度值以单因素方差分析t检验,与对照组比较*P<0.05 **P<0.01;与通心络小剂量组比较△P<0.05,△△P<0.01。
表3 各组大鼠脑缺血侧室管膜及SVZ、DG区BrdU+GFAP阳性细胞荧光强度值的比较(x±s,×200)
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组
对照组
通心络小剂量组
通心络大剂量组
对照组
通心络小剂量组
通心络大剂量组
Ncase
6
8
8
6
8
, 百拇医药
8
Nscore 3d
73.7±10.6
74.1±12.2
75.3±11.1
62.4±11.3
63.1±10.8
64.3±12.1
Nscore 7d
96.9±11.7
122.7±13.5**
147.0±10.3**△△
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85.1±10.6
107.5±11.2**
132.0±13.2**△△
Nscore 14d
120.7±10.4
143.8±11.3**
168.0±12.4**△△
108.5±10.2
132.4±13.1**
158.0±11.7**△△
Nscore 21d
91.5±6.3
107.3±9.1*
126.4±9.3**△
71.9±10.1
92.9±9.4*
111.8±8.3**△
注:各时段各组强度值以单因素方差分析t检验,与对照组比较*P<0.05 **P<0.01;与通心络小剂量组比较△P<0.05,△△P<0.01。, 百拇医药