关键词 神经节苷脂；基底神经节；神经元；神经保护作用；体外培养

    谷氨酸可通过兴奋性毒性和氧化性毒性二种途径对培养的神经元产生毒性作用。高浓度谷氨酸通过激活谷氨酸受体引起一系列病理变化，最终导致神经元肿胀、代谢紊乱而死亡。神经节苷脂(monosialoganglioside，GM1)能促进中枢神经元损伤后的恢复，并能抑制神经元的凋亡。本实验旨在通过原代培养的胎鼠脊髓神经元，研究GM1是否会有效地防止由兴奋性谷氨酸造成的损伤，为临床上治疗神经元的损伤提供可靠依据。

     1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 实验动物

    滨州医学院实验动物中心提供的胎龄为15d的Wister胎鼠。

    1.1.2 主要试剂与仪器

    GM1、多聚赖氨酸(美国Sigma公司)、IX-70 倒置相差生物显微镜(日本Olympus)、CLSM510激光扫描共聚焦显微镜(德国ZEISS公司)、PCR仪(Tpersonal Biometra biomedizinische)。

    1.2 脊髓神经元细胞培养

    无菌条件下取胎龄为15d胎鼠，用D-Hank’s液冲洗3次，取脊髓，加入5～10倍体积的0.25%胰蛋白酶溶液(pH 7.4～7.8)，37℃孵育消化10min，用培养液调整细胞浓度为3×105/ml 细胞悬液。接种于24孔板中，每孔放入，加入1ml细胞悬液，置37℃ 5%CO2培养箱中培养。

    1.3 实验分组

    将以上原代培养的胎鼠脊髓神经元随机分为三组。①正常对照组：原代培养的脊髓神经元培养48h，然后加入50μl无菌去离子双蒸水孵育12h；②谷氨酸损伤组：对原代培养的脊髓神经元培养48h，然后加入谷氨酸(终浓度2mmol/L)孵育12h；③GM1保护组：将原代培养的脊髓神经元培养48h，然后同时加入谷氨酸(终浓度2mmol/L)和GM1(终浓度10ng/ml)孵育12h。

    1.4 倒置相差显微镜观察各组神经元形态变化

    用倒置相差显微镜观察各组原代培养的脊髓神经元和脊髓神经元在12h和24h时的形态学特征，培养至48h，根据实验分组分别给予不同的干预因素处理12h，观察并拍照后进行以下一系列处理。

    1.5 MTT鉴定法

    MTT法鉴定脊髓神经元的生存状态。

    1.6 GAP43和NF-L的mRNA表达检测

    1.6.1 引物设计

    GAP43引物以GeneBank上登录的mRNA序列为模板 ......