革兰阴性杆菌产Ampc酶诱因探讨及其院内分布监测
【摘要】 目的 探讨Ampc酶与三代头孢及其用药时间长短的关系；统计高产Ampc酶菌株在院内检出分布的情况，达到指导临床合理用药。方法 利用头孢西丁初筛试验、三维确证试验。检测受试菌Ampc酶的产生情况；采用肉汤稀释渐进突变法，对耐药突变株进行选择，回顾性比较感染高产Ampc酶株及非高产Ampc酶株的患者。本次感染使用三代头孢时间上的差异；统计高产Ampc酶菌株在各科室的分布情况。结果 CAZ(头孢他啶)和CTX(头孢噻肟)对持续高产突变株的选择能力最强；CFE(头孢比肟)选择性较弱；IMP(亚安培兰)无选择性； 革兰阴性杆菌产Ampc酶的总检出率为15.1%；初筛试验与确证试验的总符合率68.0%；阴沟杆菌产Ampc酶的总检出率35.1%；初筛试验与确证试验的符合率59.1%；绿脓杆菌产Ampc酶的总检出率80%；初筛试验与确证试验的符合率69%；鲍曼不动杆菌产Ampc酶的总检出率11.0%；初筛试验与确证试验的符合率48.1%；大肠杆菌产Ampc酶的检出率3.5%；初筛试验与确证试验的符合率25.6%。感染高产Ampc酶菌的患者三代头孢平均用药时间(7.72±1.57)天(3～21天)；感染非高产Ampc酶菌的患者三代头孢平均用药时间(2.91±0.5)天(0～11天)；经t检验P>0.05； 高产Ampc酶菌主要科室分布： ICU 19.5%，外科14.4%，血液肿瘤科14.3%，呼吸科10.2%。结论 不同抗生素对高产Ampc酶突变株的选择性不一样，感染高产Ampc酶株的患者，用药时间显著性长于感染非高产Ampc酶株的患者；我院革兰阴性杆菌高产Ampc酶菌的总检出率，初筛试验与确证试验符合率，均高出国内平均报道水平[3，4]；三代头孢频繁使用的科室，高产Ampc酶菌株所占的比例大；这对临床用药有重要参考意义。
【关键词】 突变； Ampc酶； 革兰阴性杆菌
Investsation of reasons of Gram-negative bacilli with H-Ampc and their distribution patterns in hospital
LIN Li-zhong，SUN Jie，YANG Cui-yun，et al.
The People’s Hospital of Changde City，Hunan 415003，China
【Abstract】 Objective To investigate the relationship between the Gram-negative bacilli and how much that will produce Ampc and the induceable reasons including the kinds and using time of third generation cephalosporins else，to investigate the H-Ampc isolates whose distribution patterns and positive rate in our hospital，in order to select antibiotics correctly according to the results.Methods Detect the Ampc β-lactamase producting statues of Gram-negative bacilli with modified three dimensional test and screening test，the strains were subcultured daily with the tested antibiotics at doubling concentrations starting at 0.25 MIC，to certified weather there are some differences of the third generational β-lactam antibiotics，after high level Ampc-β-lactamase and nor-high level Ampc-β-lactamase Gram-negative bacilli isolated；we compare the using time of every patien to certified if there are some significant differences and statistics distribution of Gram negative bacilli whth high Ampc in all the departments in our hospital。Results CAZ and CTX exhibited the highest potential to select depressed mutants from strains，CEF showed low potential to select depressed mutants IMP failed to select it；the total positive rate of Ampc euzyme was 15.1% and 68.0% fits between screening test and confirmatory test；the rate of Ampc enzyme in Enterobacter cloacae，Pseudomonas aeruginosa，Acinetobacter baumanii， E.coli was 35.1%，80%，11.0%，3.5%，and the fits rates between screening test and confirmatory test was 59.1%，69%，48.1%，25.6% respectively； Statisticsed the third generaltional β-lactam antibiotics using time between H-Ampc and N-HAmpc，the first was 7.72±1.57d(3-20) the later was 2.91±0.5d(0-11)，the mainly distribution of Gram-negative bacilli whih HAMPC；ICU，the department of surgery， the department of hematology，the department of respiratory system was 19.5%， 14.4%， 14.3%， 10.2% respectively. Conclusions there are no same potential to select mutants for every antibiotics，there are significant diffrence of use time between H-Ampc and N-HAmpc，there are more positive rate than other hospitals in our country， more usual use and more positive rate， according to the results it is necessary for antibiotics use.
【Key words】 mutant； Ampc enzyme； Gram-negative bacilli
目前，临床常用三代头孢及其酶抑制剂合成产品治疗革兰阴性杆菌引起的感染；除传统染色体介导的产Ampc酶革兰阴性杆菌大量存在外；质粒介导的产Ampc酶株陆续发现，进一步加强了耐药株在院内流行[1]；而国内外对临床如何治疗产Ampc酶的革兰阴性杆菌引起的感染尚无定论；主要因三代头孢不仅诱导革兰阴性杆菌高产Ampc酶，降低疗效；而且对Ampd基因突变产生的持续(去阻碍型)高产Ampc酶具有强选择型，一旦形成持续高产Ampc酶菌株，会对单酰胺类。三代头孢及其酶抑制剂合成产品产生耐药[2]。因此，对耐药原因的分析，Ampc酶的检测都有重要的临床意义，为此我们从临床标本中分离出896株革兰阴性杆菌进行Ampc酶的初筛试验与确证试验，选出23株原单纯易诱导型阴沟杆菌，进行突变选择，回顾性比较感染高产与非高产Ampc酶株患者在使用三代头孢时间上的差别；统计高产Ampc酶菌株各科室分布情况。现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 菌株来源 2004～2005年我院896株临床分离革兰阴性杆菌，其中有常见的大肠杆菌、阴沟杆菌、不动杆菌；质控标准株：E.coli.ATCC 25922 E.cloacae029 E.cloacae 029 M(为持续高产阳性对照)。
1.2 培养基、药敏纸片、抗生素药粉 由杭州天和生物制剂公司提供。
1.3 研究方法
1.3.1 耐药突变株的选择方法[5，6] 选择培养基为含适当抗生素的MH肉汤，菌量(4～8)×106 CFU/ml 35℃孵育过夜，选择过程为7天；抗生素浓度第1天为1/4mic；遂日2倍递增，至第7天为16mic。
1.3.2 Ampc酶检测的初筛试验 采用纸片扩散法进行初筛，以fox(30μg)药敏纸片检测受试菌，根据nccls标准抑菌圈直径，≤17mm提示对fox中介或耐药，疑为产Ampc酶株。
1.3.3 酶粗提物的制备 挑取数个菌落于2ml MHB中，35℃24h培养次日取20μl加入5ml新鲜MHB中，置35℃18h，然后5000r/min 4℃离心30min 弃去清液收集细菌，用0.1M pH 7.0 PBS洗1次。重悬于5ml 0.01M pH7.0 PBS中在冰-水浴条件下超声波破壁(900W，3min)，14000r/min，4℃离心1h，上清液置于-20℃备用。
1.3.4 头孢西丁三维确证试验 参照coudorn[5]等报道的酶提取物。三维试验方法作了部分改进。按标准的K-B法操作：将0.5麦氏单位E.coliATCC 25922匀涂M-H；取30μg fox(头孢西丁)置于平皿中心，使用自动割刀片在离纸片边缘5mm处放射性地由里向外切割一道狭缝(15mm×1mm)，用加样器加入40μl酶粗提物，将培养基35℃过夜，若观察到狭缝与抑菌圈1/4交接处出现扩大长菌区域，视为三维试验阳性，说明粗酶中有Ampc酶。
1.3.5 统计学方法 采用SAS8.2软件，对用药时间进行t检验。
2 结果
2.1 不同细菌Ampc酶总检出率 Ampc酶总检出率15.1%，初筛与确试验的符合率为68.0%。见表1。
2.2 在耐药突变株的选择中不同药物在不同时间出现的选择耐药突变株 见表2。
2.3 对微生物室分离出的感染高产Ampc酶株的患者和非高产Ampc酶株的患者 在其他因素无显著差别的情况下，进行临床三代头孢及其酶抑制剂合成产品使用时间上的回顾性调查分析，结果：高产Ampc酶患者136例，平均使用时间(7.72±1.57)天(3～20天)；非高产Ampc酶患者230/760例，使用时间(2.91±0.53)天(0～11天)。两组对照用药时间进行t检验，P>0.05，差异有显著性。
表1 不同细菌Ampc酶总检出率(略)
表2 不同药物在不同时间出现的选择耐药突变株(略)
2.4 主要科室高产AMPC酶菌株的分布情况 ICU 19.5%，外科14.4%，血液肿瘤14.3%，呼吸10.2%；显然使用率高的科室分布广。
3 讨论
耐药突变株的选择中，CAZ、CTX选择性最强；CFP最弱；IMP未选择出突变株。可见用三代头孢及单酰胺类治疗产诱导酶的阴性杆菌，易筛选出高产Ampc酶的耐药株，特定地在院内流行；故慎用三代头孢及其合成剂。四代头孢与Ampc酶亲合力低，快速通过外膜屏障与PSP结合将菌杀死；适合于临床使用。但四代头孢选择的高产Ampc酶菌株，对四代头孢耐药，因其伴有外膜蛋白OMP39-40的减少或缺失[7]，IMP无选择性，也无耐药性增强； 可作为临床较好的选择。本院高产Ampc酶菌株总阳性率高达15.1%，用药频率高的科室所占比例大，应引起临床注意。既往研究表明Ampd的突变频率高达10-5～10-8；因β-内酰胺抗生素对突变的选择性，感染患者长期用药，筛选高产Ampc酶株几率增大，这就提示：较长时间不合理使用β-内酰胺类抗生素是导致高产Ampc酶菌的主要因素。微生物工作者应向临床多宣传，且使用过程中须对耐药进行密切监测。并建议3～5天后重新检验感染菌的药敏试验。
【参考文献】
1 吴伟元，陈民钧，阴沟肠杆菌Ampd基因突变去阻碍持续高产Ampc酶.中国抗感染化疗杂志，2001，1(2)：65-69.
2 徐升强，詹.肠杆菌科细菌产AMPC酶检测及耐药性分析.江汉大学学报，2004，32(2)：30-32.
3 汪亚萍，应春妹.革兰阴性杆菌Ampc酶的检测及分析.检验医学，2004，19(5)：390-392.
4 张乐海，傅云霜.双抑制剂扩散协同法检测两种超广谱β-内酰胺酶.中华检验医学杂志，2001，24(4)：211-213.
5 Coudron PE，Moland ES，Thomson KS.Occurrence and detection of Ampc Betta-lactamases among Escherichia coli，Klebsiella pneumoniae and protens mirabilis isolates at a veterans medical center. J Clin Microbiol， 2000，38：1791-1796.
6 Fung-tome JC， Gradelski E， Hcczkoe， et al.Diffrences in the resistant variants of Enterobacter cloacae selected by extended-spectrum cephalosporins.Antimicrob Agents Chemother， 1996，40：1289-1293.
7 Barnaud G.Antimilrob Agents Chemother， 1997，41：2177-2183.
(编辑：悦 铭)
作者单位： 415003 湖南常德，常德市第一人民医院检验科, 百拇医药(林立中， 孙洁， 杨翠云， 夏先考)
【关键词】 突变； Ampc酶； 革兰阴性杆菌
Investsation of reasons of Gram-negative bacilli with H-Ampc and their distribution patterns in hospital
LIN Li-zhong，SUN Jie，YANG Cui-yun，et al.
The People’s Hospital of Changde City，Hunan 415003，China
【Abstract】 Objective To investigate the relationship between the Gram-negative bacilli and how much that will produce Ampc and the induceable reasons including the kinds and using time of third generation cephalosporins else，to investigate the H-Ampc isolates whose distribution patterns and positive rate in our hospital，in order to select antibiotics correctly according to the results.Methods Detect the Ampc β-lactamase producting statues of Gram-negative bacilli with modified three dimensional test and screening test，the strains were subcultured daily with the tested antibiotics at doubling concentrations starting at 0.25 MIC，to certified weather there are some differences of the third generational β-lactam antibiotics，after high level Ampc-β-lactamase and nor-high level Ampc-β-lactamase Gram-negative bacilli isolated；we compare the using time of every patien to certified if there are some significant differences and statistics distribution of Gram negative bacilli whth high Ampc in all the departments in our hospital。Results CAZ and CTX exhibited the highest potential to select depressed mutants from strains，CEF showed low potential to select depressed mutants IMP failed to select it；the total positive rate of Ampc euzyme was 15.1% and 68.0% fits between screening test and confirmatory test；the rate of Ampc enzyme in Enterobacter cloacae，Pseudomonas aeruginosa，Acinetobacter baumanii， E.coli was 35.1%，80%，11.0%，3.5%，and the fits rates between screening test and confirmatory test was 59.1%，69%，48.1%，25.6% respectively； Statisticsed the third generaltional β-lactam antibiotics using time between H-Ampc and N-HAmpc，the first was 7.72±1.57d(3-20) the later was 2.91±0.5d(0-11)，the mainly distribution of Gram-negative bacilli whih HAMPC；ICU，the department of surgery， the department of hematology，the department of respiratory system was 19.5%， 14.4%， 14.3%， 10.2% respectively. Conclusions there are no same potential to select mutants for every antibiotics，there are significant diffrence of use time between H-Ampc and N-HAmpc，there are more positive rate than other hospitals in our country， more usual use and more positive rate， according to the results it is necessary for antibiotics use.
【Key words】 mutant； Ampc enzyme； Gram-negative bacilli
目前，临床常用三代头孢及其酶抑制剂合成产品治疗革兰阴性杆菌引起的感染；除传统染色体介导的产Ampc酶革兰阴性杆菌大量存在外；质粒介导的产Ampc酶株陆续发现，进一步加强了耐药株在院内流行[1]；而国内外对临床如何治疗产Ampc酶的革兰阴性杆菌引起的感染尚无定论；主要因三代头孢不仅诱导革兰阴性杆菌高产Ampc酶，降低疗效；而且对Ampd基因突变产生的持续(去阻碍型)高产Ampc酶具有强选择型，一旦形成持续高产Ampc酶菌株，会对单酰胺类。三代头孢及其酶抑制剂合成产品产生耐药[2]。因此，对耐药原因的分析，Ampc酶的检测都有重要的临床意义，为此我们从临床标本中分离出896株革兰阴性杆菌进行Ampc酶的初筛试验与确证试验，选出23株原单纯易诱导型阴沟杆菌，进行突变选择，回顾性比较感染高产与非高产Ampc酶株患者在使用三代头孢时间上的差别；统计高产Ampc酶菌株各科室分布情况。现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 菌株来源 2004～2005年我院896株临床分离革兰阴性杆菌，其中有常见的大肠杆菌、阴沟杆菌、不动杆菌；质控标准株：E.coli.ATCC 25922 E.cloacae029 E.cloacae 029 M(为持续高产阳性对照)。
1.2 培养基、药敏纸片、抗生素药粉 由杭州天和生物制剂公司提供。
1.3 研究方法
1.3.1 耐药突变株的选择方法[5，6] 选择培养基为含适当抗生素的MH肉汤，菌量(4～8)×106 CFU/ml 35℃孵育过夜，选择过程为7天；抗生素浓度第1天为1/4mic；遂日2倍递增，至第7天为16mic。
1.3.2 Ampc酶检测的初筛试验 采用纸片扩散法进行初筛，以fox(30μg)药敏纸片检测受试菌，根据nccls标准抑菌圈直径，≤17mm提示对fox中介或耐药，疑为产Ampc酶株。
1.3.3 酶粗提物的制备 挑取数个菌落于2ml MHB中，35℃24h培养次日取20μl加入5ml新鲜MHB中，置35℃18h，然后5000r/min 4℃离心30min 弃去清液收集细菌，用0.1M pH 7.0 PBS洗1次。重悬于5ml 0.01M pH7.0 PBS中在冰-水浴条件下超声波破壁(900W，3min)，14000r/min，4℃离心1h，上清液置于-20℃备用。
1.3.4 头孢西丁三维确证试验 参照coudorn[5]等报道的酶提取物。三维试验方法作了部分改进。按标准的K-B法操作：将0.5麦氏单位E.coliATCC 25922匀涂M-H；取30μg fox(头孢西丁)置于平皿中心，使用自动割刀片在离纸片边缘5mm处放射性地由里向外切割一道狭缝(15mm×1mm)，用加样器加入40μl酶粗提物，将培养基35℃过夜，若观察到狭缝与抑菌圈1/4交接处出现扩大长菌区域，视为三维试验阳性，说明粗酶中有Ampc酶。
1.3.5 统计学方法 采用SAS8.2软件，对用药时间进行t检验。
2 结果
2.1 不同细菌Ampc酶总检出率 Ampc酶总检出率15.1%，初筛与确试验的符合率为68.0%。见表1。
2.2 在耐药突变株的选择中不同药物在不同时间出现的选择耐药突变株 见表2。
2.3 对微生物室分离出的感染高产Ampc酶株的患者和非高产Ampc酶株的患者 在其他因素无显著差别的情况下，进行临床三代头孢及其酶抑制剂合成产品使用时间上的回顾性调查分析，结果：高产Ampc酶患者136例，平均使用时间(7.72±1.57)天(3～20天)；非高产Ampc酶患者230/760例，使用时间(2.91±0.53)天(0～11天)。两组对照用药时间进行t检验，P>0.05，差异有显著性。
表1 不同细菌Ampc酶总检出率(略)
表2 不同药物在不同时间出现的选择耐药突变株(略)
2.4 主要科室高产AMPC酶菌株的分布情况 ICU 19.5%，外科14.4%，血液肿瘤14.3%，呼吸10.2%；显然使用率高的科室分布广。
3 讨论
耐药突变株的选择中，CAZ、CTX选择性最强；CFP最弱；IMP未选择出突变株。可见用三代头孢及单酰胺类治疗产诱导酶的阴性杆菌，易筛选出高产Ampc酶的耐药株，特定地在院内流行；故慎用三代头孢及其合成剂。四代头孢与Ampc酶亲合力低，快速通过外膜屏障与PSP结合将菌杀死；适合于临床使用。但四代头孢选择的高产Ampc酶菌株，对四代头孢耐药，因其伴有外膜蛋白OMP39-40的减少或缺失[7]，IMP无选择性，也无耐药性增强； 可作为临床较好的选择。本院高产Ampc酶菌株总阳性率高达15.1%，用药频率高的科室所占比例大，应引起临床注意。既往研究表明Ampd的突变频率高达10-5～10-8；因β-内酰胺抗生素对突变的选择性，感染患者长期用药，筛选高产Ampc酶株几率增大，这就提示：较长时间不合理使用β-内酰胺类抗生素是导致高产Ampc酶菌的主要因素。微生物工作者应向临床多宣传，且使用过程中须对耐药进行密切监测。并建议3～5天后重新检验感染菌的药敏试验。
【参考文献】
1 吴伟元，陈民钧，阴沟肠杆菌Ampd基因突变去阻碍持续高产Ampc酶.中国抗感染化疗杂志，2001，1(2)：65-69.
2 徐升强，詹.肠杆菌科细菌产AMPC酶检测及耐药性分析.江汉大学学报，2004，32(2)：30-32.
3 汪亚萍，应春妹.革兰阴性杆菌Ampc酶的检测及分析.检验医学，2004，19(5)：390-392.
4 张乐海，傅云霜.双抑制剂扩散协同法检测两种超广谱β-内酰胺酶.中华检验医学杂志，2001，24(4)：211-213.
5 Coudron PE，Moland ES，Thomson KS.Occurrence and detection of Ampc Betta-lactamases among Escherichia coli，Klebsiella pneumoniae and protens mirabilis isolates at a veterans medical center. J Clin Microbiol， 2000，38：1791-1796.
6 Fung-tome JC， Gradelski E， Hcczkoe， et al.Diffrences in the resistant variants of Enterobacter cloacae selected by extended-spectrum cephalosporins.Antimicrob Agents Chemother， 1996，40：1289-1293.
7 Barnaud G.Antimilrob Agents Chemother， 1997，41：2177-2183.
(编辑：悦 铭)
作者单位： 415003 湖南常德，常德市第一人民医院检验科, 百拇医药(林立中， 孙洁， 杨翠云， 夏先考)