间充质干细胞构建组织工程小血管
骨髓间充质干细胞
早在19世纪中叶,就有人发现骨髓具有成骨能力。40多年前,Friedenstein等观察到骨髓细胞可在体外培养并贴壁生长。在适宜的诱导条件下,骨髓间充质干细胞(MSC)能分化为造血细胞以外的细胞,特别是中胚层和神经外胚层来源的细胞,这种跨系分化,甚至跨胚层分化的特性被称为“可塑性”。同时,骨髓MSC具有造血支持、免疫调节、多向分化等潜能,易于转染和表达外源基因,是细胞治疗和基因治疗的理想载体和靶细胞。
血管损伤、缺血性疾病以及动脉瘤等,都需要合适的血管移植物,临床上应用的血管移植物包括自体血管、异体血管和人工合成材料血管等,但由于种种原因,这些血管移植物已很少被使用或不适于替代小口径血管。
因此,随着干细胞研究的重大进展以及材料和塑形科学研究的不断深入,利用组织工程学的方法构建良好血管替代物的血管组织工程学就成为了研究热点。
组织工程血管及相关研究
组织工程血管是利用各种血管壁细胞和相关的细胞外基质,制备并重建的三维血管组织。目前,关于组织工程血管的研究主要包括种子细胞、细胞支架、细胞支架和种子细胞复合体的培养、组织工程血管的抗凝特性和植入情况等,种子细胞的获取、培养和种植是组织工程血管研究的关键环节。现在被用作组织工程血管的种子细胞多是自体血管壁细胞以及可定向分化的干细胞,由于骨髓MSC具有取材方便、在体外可大量增殖、无免疫原性等特点,有望成为组织工程血管种子细胞的主要来源。
1. 种子细胞培养及生长特点
利用密度梯度离心和贴壁的方法,获取并纯化骨髓MSC,原代培养可获得约2×105个细胞,传至第5代(P5)可获得约4×108个细胞,扩增10代,细胞数约为8×1010,可基本满足组织工程需要。通过对P0、P5、P10 3代细胞生长曲线进行分析发现,传代培养的潜伏期为24~48小时,传代培养细胞的对数增长期为4~6 天。接种后8~9天进入平台期,细胞增殖和生长逐渐缓慢。用流式细胞仪检测细胞表面抗原显示,细胞高表达CD105,弱表达内皮生长因子受体KDR,不表达HLA-DR、CD34、CD45、CD11a及CD14。
取生长状态良好的P2~P4细胞,用含全反式维甲酸、二丁酰环磷酸腺苷钙的DMEM低糖培养液诱导分化,2周后细胞融合成片,可见细胞伸出较长突起相互接触,平行排列,并向同一方向生长,形成峰谷样外观。诱导14天后,β肌动蛋白阳性,符合血管平滑肌细胞的特点。诱导2周后,扫描电镜显示,细胞呈带状,平行排列,细胞周边伸出许多丝状突起,与相邻细胞的突起交织成网。透射电镜可见,胞浆内肌丝形成,多分布于核周及胞体突起内,细胞核呈锯齿状。胞浆内细胞器多时肌丝较少,位于胞膜附近。细胞内常见较多发育好的粗面内质网和较大线粒体,表现为较原始或发育初期血管内皮细胞的特点。
取生长状态良好的P4~P6细胞,用含血管内皮生长因子的培养液诱导,2周后,细胞呈鹅卵石样。诱导14天后,细胞表达血管性假血友病因子(vWF)。扫描电镜显示,细胞呈椭圆形、多角形或长方形等,平行排列,细胞表面也有绒毛样突起与周围细胞相互交织,但突起较少。透射电镜可见诱导的细胞表面有丰富的指状、球状或绒毛状突起,核一般呈卵圆形或肾型,位于中央,染色质致密,核周胞质及胞质内细胞器丰富,有大量粗面内质网、线粒体、游离核糖体、高尔基复合体和溶酶体等,还可见大量吞饮小泡,主要分布于胞膜内面,有些小泡有长颈与胞膜相连,有些彼此汇合成管状,一端或两端与细胞膜相连,具有内皮细胞的特点。
2.细胞支架制备
鼠尾尾腱经乙酸溶液作用和盐析等处理后,获取胶原蛋白,再用戊二醛交联。将胶原包埋的聚乙醇酸(PGA)放入序列冻干机中,真空冷冻干燥24小时,即可得到片状的胶原蛋白包埋PGA支架,该复合支架质地均匀,柔韧,固定成型,吸水性良好。细胞在胶原包埋的PGA支架上生长良好,该复合支架与诱导的血管平滑肌样细胞的组织相容性也很好。
3. 组织工程血管的制备
将2 cm×3 cm的复合支架平铺于6孔板内。标记种子细胞,收集P2~P3血管平滑肌样细胞,分期种植于支架表面,使细胞数量达到4×106。将无菌ECMgel均匀涂抹于支架表面,分期种植血管内皮样细胞,使细胞数量达到1×106。
实验分组情况为,对照组:将外径为4 mm的玻璃棒置入狗的皮下;单纯支架组:将未接种细胞的支架植入狗的皮下;实验组:将上述种植有种子细胞的复合支架包裹在直径4 mm的玻璃棒周围,植于狗的皮下(为种子细胞供体动物)。
结果显示,8周后,对照组的玻璃棒周围纤维组织稍增厚,抽去玻璃棒,不能维持管型结构。单纯支架组的管型结构稍明显,但管壁仍较薄。实验组的玻璃棒周围管型结构明显,呈血管样改变。组织学观察显示,对照组主要为纤维组织,细胞成分少。单纯支架组的管壁中细胞数量较少,分布较均匀,管壁结构不清晰,周围胶原成分增多。实验组的管壁结构较清晰,细胞数量也较少,胶原成分增多,管壁明显可见内膜、中膜和外膜。单纯支架组可承受100~150 mm Hg的血管腔内压力,实验组可承受200 mm Hg的血管腔内压力而不破裂。免疫荧光检测显示,部分细胞来源于所种植的种子细胞。
4. 组织工程血管移植实验
用所构建的组织工程血管进行血管移植实验。实验组移植物为所构建的组织工程化血管,对照组移植物为单纯支架组所形成的管状物。移植部位为狗股动脉。
结果显示,移植后组织工程血管通畅,近端和远端股动脉搏动良好,吻合口无渗漏,管壁无瘤样扩张,肢体无缺血改变。移植后1周,在体时血管通畅,搏动良好,管壁无瘤样扩张,肢体无缺血改变。切除移植血管可见,实验组组织工程血管长约3 cm,管壁略厚,管腔通畅,内膜粗糙,但无血栓形成。对照组血管内已有血栓形成,管腔闭塞。
移植后2周,实验组在体血管通畅,搏动良好,管壁仍无瘤样扩张,肢体无缺血改变。切除后可见,血管长约3 cm,管壁进一步发育成熟,管腔通畅,内膜已明显光滑,与正常血管壁相似,无血栓形成。管壁HE染色与正常生理性血管壁结构相似。内膜表面完整,有连续单层扁平上皮细胞覆盖,中膜有平滑肌样细胞,但细胞数量较少,胶原和细胞外基质成分较多,胶原纤维排列整齐且致密。外膜主要为疏松结缔组织。免疫荧光显示,组织工程血管内膜vWF阳性,中膜β肌动蛋白阳性。同时检测所标记的种子细胞证实,管壁细胞主要来源于所种植的种子细胞。
总 结
上述研究证实:①骨髓MSC表达CD105和KDR,具有分化为血管壁细胞的潜能;②骨髓MSC能在体外定向分化为具有平滑肌细胞和内皮细胞特性的细胞,可作为血管壁细胞的种子细胞;③种子细胞在胶原包埋的PGA复合支架上生长好,两者具有良好的组织相容性;④动物皮下可以作为生物反应器,构建的组织工程血管的组织结构和生理血管的组织结构相似;⑤该组织工程血管可以作为血管的替代物用于血管移植,种子细胞参与了血管结构的重构。, 百拇医药
早在19世纪中叶,就有人发现骨髓具有成骨能力。40多年前,Friedenstein等观察到骨髓细胞可在体外培养并贴壁生长。在适宜的诱导条件下,骨髓间充质干细胞(MSC)能分化为造血细胞以外的细胞,特别是中胚层和神经外胚层来源的细胞,这种跨系分化,甚至跨胚层分化的特性被称为“可塑性”。同时,骨髓MSC具有造血支持、免疫调节、多向分化等潜能,易于转染和表达外源基因,是细胞治疗和基因治疗的理想载体和靶细胞。
血管损伤、缺血性疾病以及动脉瘤等,都需要合适的血管移植物,临床上应用的血管移植物包括自体血管、异体血管和人工合成材料血管等,但由于种种原因,这些血管移植物已很少被使用或不适于替代小口径血管。
因此,随着干细胞研究的重大进展以及材料和塑形科学研究的不断深入,利用组织工程学的方法构建良好血管替代物的血管组织工程学就成为了研究热点。
组织工程血管及相关研究
组织工程血管是利用各种血管壁细胞和相关的细胞外基质,制备并重建的三维血管组织。目前,关于组织工程血管的研究主要包括种子细胞、细胞支架、细胞支架和种子细胞复合体的培养、组织工程血管的抗凝特性和植入情况等,种子细胞的获取、培养和种植是组织工程血管研究的关键环节。现在被用作组织工程血管的种子细胞多是自体血管壁细胞以及可定向分化的干细胞,由于骨髓MSC具有取材方便、在体外可大量增殖、无免疫原性等特点,有望成为组织工程血管种子细胞的主要来源。
1. 种子细胞培养及生长特点
利用密度梯度离心和贴壁的方法,获取并纯化骨髓MSC,原代培养可获得约2×105个细胞,传至第5代(P5)可获得约4×108个细胞,扩增10代,细胞数约为8×1010,可基本满足组织工程需要。通过对P0、P5、P10 3代细胞生长曲线进行分析发现,传代培养的潜伏期为24~48小时,传代培养细胞的对数增长期为4~6 天。接种后8~9天进入平台期,细胞增殖和生长逐渐缓慢。用流式细胞仪检测细胞表面抗原显示,细胞高表达CD105,弱表达内皮生长因子受体KDR,不表达HLA-DR、CD34、CD45、CD11a及CD14。
取生长状态良好的P2~P4细胞,用含全反式维甲酸、二丁酰环磷酸腺苷钙的DMEM低糖培养液诱导分化,2周后细胞融合成片,可见细胞伸出较长突起相互接触,平行排列,并向同一方向生长,形成峰谷样外观。诱导14天后,β肌动蛋白阳性,符合血管平滑肌细胞的特点。诱导2周后,扫描电镜显示,细胞呈带状,平行排列,细胞周边伸出许多丝状突起,与相邻细胞的突起交织成网。透射电镜可见,胞浆内肌丝形成,多分布于核周及胞体突起内,细胞核呈锯齿状。胞浆内细胞器多时肌丝较少,位于胞膜附近。细胞内常见较多发育好的粗面内质网和较大线粒体,表现为较原始或发育初期血管内皮细胞的特点。
取生长状态良好的P4~P6细胞,用含血管内皮生长因子的培养液诱导,2周后,细胞呈鹅卵石样。诱导14天后,细胞表达血管性假血友病因子(vWF)。扫描电镜显示,细胞呈椭圆形、多角形或长方形等,平行排列,细胞表面也有绒毛样突起与周围细胞相互交织,但突起较少。透射电镜可见诱导的细胞表面有丰富的指状、球状或绒毛状突起,核一般呈卵圆形或肾型,位于中央,染色质致密,核周胞质及胞质内细胞器丰富,有大量粗面内质网、线粒体、游离核糖体、高尔基复合体和溶酶体等,还可见大量吞饮小泡,主要分布于胞膜内面,有些小泡有长颈与胞膜相连,有些彼此汇合成管状,一端或两端与细胞膜相连,具有内皮细胞的特点。
2.细胞支架制备
鼠尾尾腱经乙酸溶液作用和盐析等处理后,获取胶原蛋白,再用戊二醛交联。将胶原包埋的聚乙醇酸(PGA)放入序列冻干机中,真空冷冻干燥24小时,即可得到片状的胶原蛋白包埋PGA支架,该复合支架质地均匀,柔韧,固定成型,吸水性良好。细胞在胶原包埋的PGA支架上生长良好,该复合支架与诱导的血管平滑肌样细胞的组织相容性也很好。
3. 组织工程血管的制备
将2 cm×3 cm的复合支架平铺于6孔板内。标记种子细胞,收集P2~P3血管平滑肌样细胞,分期种植于支架表面,使细胞数量达到4×106。将无菌ECMgel均匀涂抹于支架表面,分期种植血管内皮样细胞,使细胞数量达到1×106。
实验分组情况为,对照组:将外径为4 mm的玻璃棒置入狗的皮下;单纯支架组:将未接种细胞的支架植入狗的皮下;实验组:将上述种植有种子细胞的复合支架包裹在直径4 mm的玻璃棒周围,植于狗的皮下(为种子细胞供体动物)。
结果显示,8周后,对照组的玻璃棒周围纤维组织稍增厚,抽去玻璃棒,不能维持管型结构。单纯支架组的管型结构稍明显,但管壁仍较薄。实验组的玻璃棒周围管型结构明显,呈血管样改变。组织学观察显示,对照组主要为纤维组织,细胞成分少。单纯支架组的管壁中细胞数量较少,分布较均匀,管壁结构不清晰,周围胶原成分增多。实验组的管壁结构较清晰,细胞数量也较少,胶原成分增多,管壁明显可见内膜、中膜和外膜。单纯支架组可承受100~150 mm Hg的血管腔内压力,实验组可承受200 mm Hg的血管腔内压力而不破裂。免疫荧光检测显示,部分细胞来源于所种植的种子细胞。
4. 组织工程血管移植实验
用所构建的组织工程血管进行血管移植实验。实验组移植物为所构建的组织工程化血管,对照组移植物为单纯支架组所形成的管状物。移植部位为狗股动脉。
结果显示,移植后组织工程血管通畅,近端和远端股动脉搏动良好,吻合口无渗漏,管壁无瘤样扩张,肢体无缺血改变。移植后1周,在体时血管通畅,搏动良好,管壁无瘤样扩张,肢体无缺血改变。切除移植血管可见,实验组组织工程血管长约3 cm,管壁略厚,管腔通畅,内膜粗糙,但无血栓形成。对照组血管内已有血栓形成,管腔闭塞。
移植后2周,实验组在体血管通畅,搏动良好,管壁仍无瘤样扩张,肢体无缺血改变。切除后可见,血管长约3 cm,管壁进一步发育成熟,管腔通畅,内膜已明显光滑,与正常血管壁相似,无血栓形成。管壁HE染色与正常生理性血管壁结构相似。内膜表面完整,有连续单层扁平上皮细胞覆盖,中膜有平滑肌样细胞,但细胞数量较少,胶原和细胞外基质成分较多,胶原纤维排列整齐且致密。外膜主要为疏松结缔组织。免疫荧光显示,组织工程血管内膜vWF阳性,中膜β肌动蛋白阳性。同时检测所标记的种子细胞证实,管壁细胞主要来源于所种植的种子细胞。
总 结
上述研究证实:①骨髓MSC表达CD105和KDR,具有分化为血管壁细胞的潜能;②骨髓MSC能在体外定向分化为具有平滑肌细胞和内皮细胞特性的细胞,可作为血管壁细胞的种子细胞;③种子细胞在胶原包埋的PGA复合支架上生长好,两者具有良好的组织相容性;④动物皮下可以作为生物反应器,构建的组织工程血管的组织结构和生理血管的组织结构相似;⑤该组织工程血管可以作为血管的替代物用于血管移植,种子细胞参与了血管结构的重构。, 百拇医药