肾脏细胞凋亡在梗阻性黄疸大鼠肾脏损害中的作用及丹参的影响
http://www.100md.com
张云锋 ,王作仁 ,于琳华 ,韩水平 ,郑黎明
梗阻性黄疸;细胞凋亡;肾损害;病理学;丹参
 |
| 第1页 |
参见附件(415KB，4页)。
摘要：目的 观察梗阻性黄疸大鼠肾脏的组织学及超微结构改变，探讨细胞凋亡在梗阻性黄疸大鼠肾脏损害中的作用及丹参的影响。方法 SD大鼠100只，随机分为对照组20只，胆总管结扎组和丹参治疗组各40只；结扎胆总管建立梗阻性黄疸模型。丹参治疗组每日每只腹腔内注射1.7g丹参注射液，对照组、胆总管结扎组每日腹腔注射等量生理盐水。3组大鼠分别于术后第1、2、3、4周剖杀，检测血清BUN和Cr的变化，观察肾脏病理组织学及超微结构改变，TUNEL法检测肾小管凋亡细胞。结果 随着胆总管结扎时间的延长，大鼠血清BUN和Cr逐渐升高，肾小管上皮细胞凋亡数增加。应用丹参治疗后，肾功能和肾脏损害程度较轻，肾小管细胞凋亡数减少。结论 梗阻性黄疸可以引起大鼠肾脏损害，凋亡在梗阻性黄疸大鼠肾脏功能损害中发挥重要作用，应用丹参可降低梗阻性黄疸肾脏损害程度。
关键词：梗阻性黄疸；细胞凋亡；肾损害；病理学；丹参
Observation on apoptosis of renal cell in the rat with obstructive jaundice and salvia miltiorrhizas effect on apoptosis
Zhang Yunfeng, Wang Zuoren, Yu Linhua, Han Shuiping, Zheng Liming
(Department of Hepatobiliary Surgery, First Affiliated Hospital; Department of Pathology;Department of Morphological Center, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)
ABSTRACT: Objective To investigate the function of apoptosis in the renal injury by observing change of renal pathology and ultrastructure in the rat with obstructive jaundice(OJ) and if salvia miltiorrhiza(SM) can lighten the renal dysfunction of obstructive jaundice. Methods A total of 100 adult SpragueDawley rats were studied. Among them, the 80 models of obstructive jaundice were established by ligating bile duct(BDL), then divided into two groups: the OJ rats administered daily abdomen injections of SM(1.7g per rat) after operation of bile duct ligation (the SM group, n= 40); the OJ rats receiving only the same normal saline (the OJ group, n=40). The other rats with sham operation receiving only normal saline (the control group, n=20). Three groups of rats were sacrificed in groups at postoperation 1, 2, 3 and 4 week, respectively. Then serum BUN & Cr were tested and renal change of histopathology and ultrastructure were observed; Apoptosis of renal tissue were assayed by TUNEL method. Results With the time of BDL extending, the value of serum BUN & Cr increased; Apoptotic cells increased in renal tissue. After treatment with SM, the injury degree of renal function and histopathologic changes decreased. Conclusion Obstructive jaundice can lead to renal injury. Apoptosis had an important effect on renal function injury in the rat with obstructive jaundice. Salvia miltiorrhiza can ease the degree of renal function injury.
KEY WORDS: obstructive jaundice; apoptosis; renal injury; pathology; salvia miltiorrhiza
梗阻性黄疸(obstructive jaundice, OJ)是肝胆外科常见病症，OJ病人均存在不同程度的肾功能损害，术后急性肾功能衰竭(acute renal failure, ARF)是OJ病人死亡的重要原因\[1\]。在甘油、缺血等致大鼠肾功能衰竭实验中及临床上肾功能衰竭病人肾活检标本中，均观察到肾脏细胞凋亡现象，提示细胞凋亡在肾功能损害过程中发挥重要作用\[24\]。我们通过结扎SD大鼠胆管建立OJ模型，对大鼠肾脏细胞进行形态学观察,了解细胞凋亡在OJ肾脏损害过程中的作用。
1 材料与方法
1.1 动物实验 SD大鼠100只，雌雄各半，体质量250-280g，购自西安交通大学医学院实验动物中心。随机分为正常对照组20只，胆总管结扎组40只，丹参治疗组40只。3组大鼠均雌雄分笼自由饲养。大鼠氯胺酮腹腔注射麻醉(100mg/kg)，取上腹正中切口入腹，显露第一肝门，钝性游离肝门部胆总管予以双重结扎，2线之间剪断胆总管，建立OJ模型。对照组仅剖腹游离肝门部胆总管。丹参治疗组每日每只腹腔内注射1.7g 丹参注射液(购自杭州正大青春宝药业有限公司，批号0304213)，正常对照、胆总管结扎组每日每只腹腔内注射等量生理盐水。分别于术后1、2、3、4周剖杀动物取血清和肾组织。
1.2 肾功能的检测 血尿素氮(BUN) 和肌酐(Cr)采用全自动生化分析仪测定。
1.3 肾组织形态学检查 肾脏组织分别用10%(体积分数)甲醛溶液和2.5%(体积分数)戊二醛、锇酸液固定，按常规方法制作切片，行光镜、透射电镜(HITACHIH600)观察。
1.4 TUNEL法检测肾小管上皮细胞凋亡 采用西安华美生物公司凋亡检测试剂盒，按试剂盒操作说明对肾脏石蜡切片进行染色，在光镜下观察5个高倍视野中肾小管上皮阳性细胞数,以此作为凋亡指数。
1.5 统计学分析 应用SPSS11.5统计软件进行方差分析、秩和检验、Spearmans相关分析，P<0.05有统计学意义。
2 结果
剖杀实验组大鼠发现全部胆总管结扎成功，胆总管明显增粗，直径1.5-5mm不等；肾脏肿胀，部分不同程度发绿。
2.1 大鼠血清BUN和Cr的变化 随着OJ时间的延长，大鼠血清BUN和Cr值逐渐升高。从术后第 2周开始，对照组与实验组之间BUN和Cr相比，有明显差异(P<0.01)。丹参治疗组较相同时段胆总管结扎组的血清BUN、Cr值降低，从术后第二周开始，有显著统计学差异(P<0.01，表1)。
表1 各组大鼠血清BUN和Cr值(略)
Table 1 Levels of serum BUN & Cr in rats of different groups
2.2 光镜观察 胆总管结扎1周时，近端小管上皮细胞水肿，上皮细胞内、肾小管腔内有胆色素颗粒，肾小球病变轻微。2周时，肾小管病变较前加重，部分肾小球基底膜轻度增厚，间质内有少量淋巴细胞、单核细胞浸润。3、4周时，近端小管上皮细胞水肿加重，有凋亡细胞出现。凋亡细胞形态特点为细胞核浓缩、深染或碎裂，细胞体积缩小，胞质嗜酸性增强(图1)。可见个别肾小管坏死，皮髓交界区尤为明显；肾小管细胞胞浆内胆色素颗粒增多，管腔内可见胆栓及脱落的坏死细胞。远端小管、集合管内有蛋白管型，少量细胞管型。PAS染色肾小球毛细血管基底膜增厚(图2)，毛细血管丛呈分叶状结构；内皮细胞肿胀，鲍氏囊间隙扩大，间质内单核细胞、淋巴细胞等炎细胞浸润明显增多等多种病变。胆总管结扎4周组有1例大量肾小管细胞坏死，管腔缩小，间质纤维结缔组织大量增生。丹参治疗组在各时段病变表现均较胆总管结扎组轻。
图1 肾小管上皮细胞凋亡，核染色质浓缩，体积变小，似凋亡小体(略)
Fig.1 Renal tubular epithelium apoptosis, the nuclear chromatin was condensed, volume of cell diminished, like apoptotic body (HE×400)
图2 肾小球基底膜增厚(略)
Fig.2 Glomerular basic membrane thicken (PAS×400)
2.3 电镜观察 透射电镜下可见，胆道梗阻1周时肾近端小管上皮细胞出现变化，表面微绒毛稀疏、短缩、缺失，线粒体肿胀，嵴缺损，溶解空泡化，内质网扩张，溶酶体增多，胆色素沉积，基底质膜内褶紊乱、减少、短缩；随BDL时间的延长，病变逐渐加重。凋亡细胞增多,表现为胞体逐渐变小,胞质基质密度增加, 线粒体增多，结构不清；核内染色质边集，核膜周围有许多内空的空泡结构，也可见核变小，核膜模糊，核碎裂和凋亡小体(图3)。肾小球毛细血管内皮细胞亦出现线粒体肿胀，嵴缺损，溶解空泡化，内质网扩张，胆色素沉积，内皮细胞核染色质边集，凋亡。足突融合或微绒毛化，肾小球毛细血管基底膜局限性增厚，胆总管结扎3周出现基底膜局部变薄或结构不清(图4)。对照组近端小管上皮细胞、肾小球结构正常，未见病变。丹参治疗组病变表现均较胆总管结扎组轻。
图3 肾小管上皮细胞凋亡，核染色质浓缩，边集于核膜下，线粒体肿胀(略)
Fig.3 Apoptosis in renal tubular epithelium, the nuclear chromatin was condensed, aggregated peripherally under the nuclear membrane; Mitochondria swellened (EM×15000)
图4 肾小球毛细血管内皮细胞凋亡，核染色质边集，基底膜增厚(略)
Fig.4 Apoptosis in renal glomerular endothelium, the condensed nuclear chromatin aggregated peripherally under the nuclear membrane, basic membrane become thick (EM×15000)
2.4 肾小管上皮细胞凋亡 TUNEL 法染色凋亡细胞核呈棕黄色(图5)。随OJ时间的延长，凋亡细胞数持续增高(表2)。胆总管结扎组中的肾小管细胞凋亡数均显著高于对照组(P<0.01)。而丹参治疗组中的肾小管细胞凋亡数较胆总管结扎组降低，各周之间均有统计学差异(P<0.01)。
图5 肾小管上皮细胞凋亡(略)
Fig.5 Apoptosis in renal tubular epithelium (TUNEL×400)
2.5 相关分析 经统计学Spearmans相关分析，肾小管上皮细胞凋亡数与血清BUN值正相关(rs=0.715，P< 0.01)；与血清Cr值正相关(rs=0.701，P<0.01)。
表2 各组大鼠肾小管上皮细胞凋亡数(略)
Table 2 Count of apoptosis of renal tubular epithelium in rats of different groups
3 讨论
早在1910年，Clairmant和 Vov Haberest认识到梗阻性黄疸和肾功能障碍之间的关系。1930年Helwig等提出“肝肾综合征”的概念，此后，各国学者对梗阻性黄疸导致肾功能损害机制进行了大量临床及基础研究，但到目前为止，梗阻性黄疸术后ARF 的发生率和死亡率仍无明显改善，表明其确切发生机制仍不清楚\[5\]。
既往研究认为，急性肾小管上皮细胞坏死、梗阻、小管液回漏是ARF发生的主要机制。但经临床肾脏活检和实验研究证实的轻度或少量的急性肾小管坏死常常与病人所表现出的严重肾功能障碍相矛盾，Lieberthal 等推测存在急性肾小管坏死以外的肾小管上皮细胞损伤、丢失途径\[6\]。随后证明在急性缺血和毒性肾损伤的ARF动物模型细胞凋亡发挥重要作用\[79 \]，临床急性肾功能损害的病人肾脏活检示肾小管坏死的同时亦伴有细胞凋亡\[1011\]。当细胞受到损伤时，细胞死亡的表现形式有两种：坏死或凋亡。细胞死亡表现为凋亡还是坏死依赖于引起细胞损伤因素的性质和程度，同样的损伤因素，当程度较轻时表现为凋亡，而严重时表现为坏死\[3\]。由于凋亡和坏死的特点不同，在组织中存在的时间不相同；坏死一般可存在数天，而凋亡仅存在1-3h。因而，凋亡在急性肾功能损害过程中的作用常被低估。
我们在组织切片、透射电镜中观察到梗阻性黄疸肾损害中受损肾小管上皮细胞除变性、坏死外，还有另外一种重要的形态学变化，即肾小管上皮细胞凋亡，随梗阻性黄疸时间的延长，凋亡细胞增多。提示肾小管上皮细胞凋亡是梗阻性黄疸肾损伤时的细胞死亡形式。采用TUNEL 法检测肾小管的细胞凋亡水平，结果发现正常大鼠肾组织细胞凋亡水平很低，随梗阻性黄疸时间的延长，凋亡细胞显著增多，胆总管结扎组与对照组肾小管上皮细胞凋亡数比较，各周之间均有统计学差异，为形态学观察结果提供了佐证。同时，随着梗阻性黄疸时间的延长，大鼠血清BUN和Cr值逐渐升高，从术后第二周开始，胆总管结扎组与相同时段对照组的血清BUN和Cr值相比，均明显升高，说明有肾功能损害。经统计学Spearmans相关分析，肾小管上皮细胞凋亡数与血清BUN值和Cr值正相关。因此，我们认为肾小管上皮细胞凋亡在梗阻性黄疸大鼠肾功能损害中发挥重要作用，可能是梗阻性黄疸术后ARF发生的重要原因。
另外，电镜下可见肾小球毛细血管内皮细胞线粒体肿胀，胆色素沉积，基底膜局限性增厚等病变；随梗阻性黄疸时间的延长，肾小球病变渐明显，出现毛细血管内皮细胞凋亡，足突融合或微绒毛化，PAS染色可见胆总管结扎3周的大鼠肾小球毛细血管基底膜增厚，这些均会影响肾小球的滤过功能。肾小球毛细血管基底膜增厚会引起肾小球硬化，是慢性肾功能不全的典型表现。因此，肾小球病变在梗阻性黄疸肾功能损害中也有一定作用。
丹参为临床常用中药，现有研究提示丹参可从多方面发挥对OJ肾功能的保护作用。丹参可以降低OJ时内毒素血症水平，并抑制OJ时内毒素所激发的炎症介质释放；调节OJ时血管活性物质在血浆和肾脏的生成和分泌，维持ET/NO、PGI2/TXA2比值；改变血液流变学达到改善微循环的治疗作用；这些也可间接改善肾脏血流灌注，减轻OJ时肾内自由基对细胞膜脂质过氧化损伤。本实验结果显示胆总管结扎后，大鼠血清BUN、Cr显著升高。应用丹参后，血清BUN、Cr升高幅度明显减慢，丹参治疗组较胆总管结扎组的血清BUN、Cr明显降低。丹参治疗组的肾小管细胞凋亡数较胆总管结扎组降低，光镜下丹参治疗组肾脏病变、电镜下SM组肾小管上皮细胞凋亡和肾小球等病变亦较胆总管结扎组轻。我们认为丹参对OJ造成的肾脏功能损害有保护作用。
致谢：感谢医学院病理学教研室郭尚温老师在实验过程中的无私帮助。
参考文献：
\[1\]Fogarty BJ, Parks RW, Rowlands BJ, et al. Renal dysfunction in obstructive jaundice \[J\]. Br J Surg, 1995, 82(7):877884.
\[2\]赵晓琴,刘唐威,邝晓聪,等. 甘油致大鼠急性肾功能衰竭肾小管细胞凋亡的动态实验观察 \[J\]. 中华急诊医学杂志, 2003,12(3):167169.
\[3\]Ueda N, Kaushal GP, Shah SV. Apoptotic Mechanisms in Acute Renal Failure \[J\]. Am J Med, 2000,108(5):403415.
\[4\]Bonegio R, Lieberthal W. Role of apoptosis in the pathogenesis of acute renal failure \[J\]. Curr Opin Nephrol Hypertens, 2002, 11(3):301308.
\[5\]何宇. 梗阻性黄疸与急性肾功能损害 \[J\]. 重庆医学, 2001,30(6):556558.
\[6\]Lieberthal W, Koh JS, Levine JS. Necrosis and apoptosis in acute renal failure \[J\]. Semi Nephrol, 1998, 18(5):505518.
\[7\]Taguchi T, Uchida H, Kiyokawa N, et al. Verotoxins induce apoptosis in human renal tubular epithelium derived cells \[J\]. Kidney Int, 1998,53(6):16811688.
\[8\]Kelly KJ, Plotkin Z, Dagher PC. Guanosine supplementation reduces apoptosis and protects renal function in the setting of ischemic injury \[J\]. J Clin Invest, 2001,108(9):12911298.
\[9\]Lieberthal W, Fuhro R, Andry CC, et al. Rapamycin impairs recovery from acute renal failure: role of cellcycle arrest and apoptosis of tubular cells \[J\]. Am J Physiol Renal Physiol, 2001, 281(4):F693706.
\[10\]Solez K, Racusen LC. Role of the renal biopsy in acute renal failure \[J\]. Contrib Nephrol, 2001, (132):6875.
\[11\]Toronyi E, Lord R, Bowen ID, et al. Renal tubular cell necrosis and apoptosis in transplanted kidneys\[J\]. Cell Biol Int, 2001,25(3):267270.
(编辑 邱 芬)
作者简介：张云锋(1970)，男(汉族)，外科学博士，现工作于肿瘤外科. Email: zyf119@126.com
(西安交通大学医学院：第一附属医院肝胆外科；病理学教研室；形态中心，陕西西安 710061)
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(415KB，4页)。