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编号:11124268
川芎嗪对大鼠局部脑缺血后空间学习和记忆的影响
http://www.100md.com 赵建军,刘　勇,陈新林,刘建新,田英芳,邱　芬,张蓬勃,康前
川芎嗪;学习记忆;morris水迷宫;脑缺血
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    参见附件(572KB，5页)。

     作者简介：赵建军(1968)，男，副教授，在读博士研究生. 研究方向：脑缺血.

    摘要：目的 探讨川芎嗪对大鼠局部脑缺血后空间学习记忆能力障碍的作用。方法 线栓法制作大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型，术后2周内腹腔注射川芎嗪，第15天开始采用Morris水迷宫装置评价大鼠的空间学习记忆能力，脑切片尼氏染色观察皮质和海马的神经元数量变化。结果 脑缺血对照组大鼠在定向航行试验和空间探索试验中均表现出明显的空间认知功能的障碍，川芎嗪治疗组大鼠平均逃避潜伏期与缺血对照组比较明显缩短(P<0.01)。在空间探索试验中，川芎嗪治疗组大鼠原平台象限停留时间百分比以及穿过原平台位置次数均大于脑缺血对照组(P<0.01)。在形态学观察中，川芎嗪治疗组大鼠缺血侧顶叶皮质神经元数量明显多于脑缺血对照组(P<0.01)，各组动物海马神经元数量上无统计学差异。结论 川芎嗪可以明显改善大鼠永久性局部脑缺血后空间学习记忆能力，其机制可能与川芎嗪对神经元的保护作用有关。

    关键词：川芎嗪；学习记忆；morris水迷宫；脑缺血

    Effect of tetramethylpyrazine on function of spatial learning and memory in rat after focal cerebral ischemiaZhao Jianjun, Liu Yong, Chen Xinlin, Liu Jianxin, Tian Yingfang, Qiu Fen, Zhang Pengbo, Kang Qianyan

    (Research Center for Neuroscience, Department of Anatomy, Histology and Embryology, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)

    ABSTRACT: Objective To investigate the effects of tetramethylpyrazine on function of spatial learning and memory in rat after focal cerebral ischemia. Methods The focal cerebral ischemic model was established by introducing an intraluminal filament into the left middle cerebral artery of the rat, then tetramethylpyrazine was administered introperitoneally after the operation and afterward once a day for 2 weeks. The spatial learning and memory function was studied by Morris water maze test. Nissl staining technique was conducted for observing the morphology of neurons in cortex and hippocampus. Results The ischemiacontrol group exhibited seriously spatial learning and memory deficits in both place navigation trail and spatial probe trial. In place navigation trial, the mean values of escape latency of lowerdose, middledose and higherdose tetramethylpyrazine groups were shorter than those of ischemiacontrol group(P<0.01). In spatial probe trial, there were significant difference in the time percentage of spending in the former platform quadrant and frequency of crossing the former platform site between lower, middle and higherdose tetramethylpyrazine groups and ischemiacontrol group(P<0.01). Compared with ischemiacontrol group, lower, middle and higherdose tetramethylpyrazine groups had more neurons of nissl staining in ipsilateral parietal cortex(P<0.01). The cell numbers of total neurons of hippocampus had no significant difference between lower, middle and higherdose tetramethylpyrazine groups and ischemiacontrol group. Conclusion Tetramethylpyrazine improves the rat spatial learning and memory ability after focal cerebral ischemia, and the neuroprotective role of the drug in new cortex may be involved in its mechanism.

    KEY WORDS: tetramethylpyrazine; learning; memory; morris water maze; cerebral ischemia

    临床和实验证明，脑梗塞后存活者不仅存在各种运动功能的缺损，也伴随着较为严重的认知能力的损害，学习记忆能力下降是其主要表现。川芎嗪(tetramethylpyrazine, TMP)具有扩张血管、抑制血小板聚集、改善微循环、清除氧自由基的作用，临床上对急性缺血性脑血管疾病有一定疗效，但是对于脑缺血引起的脑高级功能障碍是否有作用，值得研究。因此，本研究以大脑中动脉阻塞大鼠为模型，用Morris水迷宫实验方法及形态学方法，研究川芎嗪改善局部脑缺血所致大鼠空间学习记忆能力障碍的作用及其初步机制。

    1 材料与方法

    1.1 局灶性脑缺血模型制作 采用线栓法制作大鼠脑缺血模型。雄性SD大鼠，体重250-300g，腹腔内注射戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉，仰卧于手术台上，左侧颈部切口，结扎颈外动脉和颈总动脉近端，动脉夹夹闭颈内动脉，在颈总动脉近分叉约0.4cm处剪一小口，将末端烧成球状长2.5cm的3/0尼龙线，插入颈内动脉，线进入长度距离颈总动脉分叉处为(17.5±0.5)mm。维持肛温在37℃左右，保持呼吸道通畅。大鼠大脑中动脉梗塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)后2h，参照改良的Bedersons评分方法进行神经功能缺失评分，选择评分大于2分的动物进行下一步实验。

    1.2 动物分组与处理方法 将大鼠分为正常对照组、脑缺血对照组和川芎嗪治疗组(低剂量组40mg/kg、中剂量组80mg/kg和高剂量组120mg/kg)，每组10只。治疗组于脑缺血后立即腹腔注射川芎嗪，正常对照组和脑缺血对照组，术后腹腔注射等量生理盐水，第2天至第14天连续给药。

    1.3 学习记忆行为学与神经功能观测 Morris 水迷宫为一不锈钢的圆形水池，直径130cm，高50cm，水深30cm，水温控制在(24±1)℃。池壁标明4个入水点，由此将水池等分为4个象限，任选其中1个象限，正中放置1个直径11cm、高29cm的平台。迷宫上方装有摄像机，并和录像机以及显示器连接，自动录入大鼠游泳轨迹进行分析。训练期间迷宫外参照物保持不变。

    测试内容包括：①定位航行试验(place navigation)，历时5d，每天分上、下午两段, 每段训练4次，将大鼠面向池壁分别从4个入水点放入水中，记录其寻找到平台的时间(逃避潜伏期, escape latency)和游泳路径。如果大鼠在120s内未找到平台，潜伏期记为120s，并由实验者将其牵引至平台上，停留10s，再放回笼中。定位航行试验通过对训练大鼠游泳寻找平台，观测其逃避潜伏期长短可检测动物的学习能力；②空间探索试验(spatial probe)，第5天撤除平台，将大鼠从入水点放入水中，记录120s内大鼠在池中的游泳轨迹和时间。学习记忆功能正常动物会在120s内在原平台所在象限反复寻找平台，而对于学习记忆功能障碍的动物则会在水迷宫中茫无目的地寻找原平台。

    1.4 组织学检查 在Morris水迷宫测试后，戊巴比妥钠麻醉，用40g/L多聚甲醛经左心室灌注固定后取脑，后固定24h，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。分别选择额叶、颞叶及背侧海马部位切片，片厚10μm。切片二甲苯脱蜡，梯度乙醇降至水，甲苯胺兰染色。每只动物每一部位选择4张切片，用网格法在显微镜下计数尼氏染色神经元。

    1.5 数据分析及处理 各组大鼠寻找平台逃避潜伏期、原平台象限停留时间百分比以及穿过原平台位置次数均以均数±标准误表示，统计学软件为SPSS 10.0，采用重复测量的单因素方差分析(postway RANOVA)比较组间差异，进一步posthoc分析采用Tukey比较两组间差异。各组大鼠寻找平台搜索策略也以均数±标准误表示，采用MannWhitney U秩检验比较组间差异。平台象限停留时间占总游泳时间的百分比采用Oneway ANOVA 单因素方差分析。细胞计数采用均数±标准差表示，单因素方差分析、t检验比较两组间差异。P≤0.05为差异有显著性。

     2 结 果

    2.1 川芎嗪对大鼠局部脑缺血后空间学习记忆能力的影响 大鼠接受了5d 9个时间段训练，第1-3时间段潜伏期迅速下降，第4-6时间段降势趋缓，第7-9时间段潜伏期平稳。与脑缺血对照组相比，正常对照组、川芎嗪低、中、高剂量组在每一时间段逃避潜伏期均明显缩短(P<0.05)；川芎嗪低、中剂量组在6、8、9时间段潜伏期趋于吻合，而高剂量组和正常对照组在5-9时间段潜伏期基本吻合；川芎嗪不同剂量组与脑缺血对照组比较在每一时间段逃避潜伏期明显缩短；川芎嗪不同剂量组之间比较，在第4-9时间段川芎嗪高剂量组逃避潜伏期明显短于川芎嗪低、中剂量组，而川芎嗪低、中剂量组间无显著性差异(图1，表1)。表1 定向航行实验逃避潜伏期平均值(略)图1 不同时间段平均逃避潜伏期(略)在定向航行试验中，缺血对照组多采用边缘式和随机式搜索策略；正常对照组和川芎嗪高剂量组多采用直线式搜索策略；川芎嗪低、中剂量组采用直线和趋向式搜索策略的频数较多。统计分析显示，各组之间在趋向式搜索策略频数无明显差异；而直线式、边缘式和随机式搜索策略，川芎嗪不同剂量组与脑缺血对照组比较有显著性差异(P<0.05)；川芎嗪低剂量组和川芎嗪中剂量组之间、及正常组与川芎嗪高剂量组之间均无显著性差异，但后两者与前两者之间存在显著性差异(P<0.05，图2)。图2 定向航行实验的搜索策略频数(略) 各组动物在原平台象限停留时间占总游泳时间百分比均大于脑缺血对照组；正常对照组和川芎嗪治疗组动物穿过原平台位置的次数均多于脑缺血对照组(表2)。表2 在平台象限停留时间占总游泳时间的百分比和穿过原平台位置的平均次数(略)

    2.2 川芎嗪对大鼠局部脑缺血后皮质及海马神经元数量的影响 顶叶皮质甲苯胺兰染色，胞体较大，胞质蓝染，核圆呈空泡状为神经元；细小蓝色颗粒状为胶质细胞；坏死区胶质细胞增生明显。川芎嗪不同剂量组与脑缺血对照组比较，左侧顶叶皮质神经元数量明显增多(P<0.01)，左侧额叶皮质神经元数量虽高于缺血对照组，但无显著性差异。所有组织间皮质神经元数量都无显著性差异，川芎嗪不同剂量组之间无显著性差异。海马CA1、CA2、CA3区神经元计数经单因素方差分析组间无差异 (表3，图3)。表3 尼氏染色皮质神经元计数(略)图3 顶叶皮质神经元和海马神经元尼氏染色(略)

    3 讨 论

    川芎嗪为中药川芎的有效成分之一，化学结构为四甲基吡嗪。目前已知，川芎嗪具有扩张血管、抑制血小板聚集、改善微循环、清除氧自由基、保护血脑屏障的作用，临床上对急性缺血性脑血管疾病有一定疗效。局部脑缺血是脑卒中最为多发和严重的病理过程，可以导致大鼠学习记忆障碍已在实验中得到证实。采用穿梭箱系统和八等臂迷宫实验证明川芎嗪可提高脑缺血后大鼠学习和记忆功能。为了证明川芎嗪可以明显改善大鼠局灶性脑缺血后学习记忆能力障碍，本研究选用了近年来发展较快、能较好评价实验动物空间学习记忆能力的Morris水迷宫测试系统，与过去的水迷宫及跳台、避暗等检测工具相比，它具有能提供较多的实验参数，系统全面地考察实验动物空间认知加工的过程，客观地反映其认知水平的优点。应用包括单因素重复测量数据在内的统计分析方法，提高了研究结果的科学性和客观性，并对保护机制做了初步探讨。

    本研究结果显示，局部永久性脑缺血对大鼠造成了明显的空间学习记忆能力损害。在定向航行试验中，川芎嗪治疗组大鼠在最初的学习记忆过程中，逃避潜伏期的下降速度快于脑缺血对照组，且在每一时间段逃避潜伏期均明显缩短，这与正常组大鼠显示了相似的过程，而脑缺血对照组动物在整个训练时间段逃避潜伏期一直处于缓慢下降过程，说明其始终没有完全学会对平台的寻找；川芎嗪明显缩短了大鼠在每一训练时间段潜伏期及全部训练过程的平均潜伏期，证明川芎嗪可以提高局部脑缺血大鼠的空间学习记忆能力。缺血对照组多采用边缘式和随机式搜索策略，正常对照组和川芎嗪高剂量组多采用直线式搜索策略，川芎嗪低、中剂量组采用直线和趋向式搜索策略的频数较多，说明川芎嗪可以明显改善脑缺血后大鼠在空间探索试验中的表现。川芎嗪各剂量组大鼠原平台象限停留时间百分比以及穿过原平台位置的次数均较脑缺血对照组大鼠有明显增加，说明川芎嗪提高了大鼠局部脑缺血后空间搜索能力。

    额叶皮质、顶叶皮质和海马都是与学习记忆密切相关的脑区。本研究通过观察这两个部位神经元数量的变化初步探讨川芎嗪改善大鼠局部脑缺血后空间学习记忆功能障碍的机制。目前的研究证实川芎嗪能显著减少大鼠脑缺血边缘区神经元的凋亡，具有神经保护作用，本实验结果显示，局部脑缺血后皮质神经元数量显著减少，川芎嗪显著提高了缺血侧顶叶皮质的神经元数量，缺血侧额叶皮质神经元数量与脑缺血对照组比较虽然较多，但并无显著性差异。由于额叶皮质大部分处于坏死核心区域，我们因此分析川芎嗪对神经元的保护作用主要是通过减少脑缺血后半暗区及保护周边区域神经元而实现的。在海马，各组间均无明显差别。以前的研究证实，不像全脑缺血海马受损较为明显，大鼠MCAO并不能导致大鼠海马及临近皮质区域的梗死，而且，无论在缺血后急性期或者亚急性期，海马区的任何组织病理学改变也未被发现。川芎嗪明显改善大鼠永久性局部脑缺血后空间学习记忆能力，其机制可能与川芎嗪对神经元的保护作用有关。

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    西安交通大学医学院神经科学研究中心，人体解剖学与组织胚胎学系，陕西西安 710061

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