免疫印迹试验在诊断儿童幽门螺旋杆菌感染中的应用评价
[摘 要] 目的：评价免疫印迹试验(Western Blotting)在诊断不同年龄组及不同病理表现儿童幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,HP)感染中的应用价值。方法：对450例有消化道症状的患儿，进行胃镜检查并取病变处胃黏膜组织行病理学检查，以及13C尿素呼气试验(13Curea breath test,13CUBT)、血清免疫印迹试验及胃液HPDNA PCR检查。结果：在4岁~6岁和6岁~12岁组患儿中，13CUBT HP检出率明显高于免疫印迹试验(P<0.01)；在12岁~18岁组患儿中，13CUBT HP检出率与免疫印迹试验比较差异无显著性(P>0.05)。细胞毒性基因相关蛋白(Cytotoxinassociated gene protein)阳性的HP感染在溃疡病组明显高于慢性胃炎组和正常组(P<0.05)，慢性胃炎组CagA(Cytotoxinassociated gene protein，CagA) 阳性 HP显著高与正常组(P<0.05)。结论：在12岁以上的少年患儿中，免疫印迹试验可作为快速诊断HP感染的可靠手段，并且能判断出是否为产毒菌株感染。在12岁以下的儿童中，免疫印迹试验最好与13CUBT联合使用。
[关键词] 免疫印迹试验；13C尿素呼气试验；幽门螺旋杆菌；细胞毒性基因相关蛋白；儿童
The Evaluation of Western Blotting Method for the Diagnosis of Helicobacter Pylori Infection in Children
CHEN Yunsheng, ZHOU Shaoming， LIU Bin, et al
(Shenzhen Children Hospital, Shenzhen, Guangdong 518026, China)
Abstract：Objective To evaluate the accuracy of the Western Blotting test in the diagnosis of Helicobacter pylori(HP) in different age groups with various gastric illnesses in children.Methods 450 children with digestive tract symptoms were tested for HP using pathological histology,13CUBT,serum western blotting and HPDNAPCR.Results In the groups with ages from 4 to 6 and 6 to12 years the detection frequency using13CUBT were significantly higher than Western blotting (P<0.01).In the group with ages from 12 to 18 years,there was no difference between13CUBT and Western Blotting in detection(P>0.05).Positive rate of Cag A antibody in peptic ulcer group was significantly higher than that of chronic gastritis group (P<0.05),Positive rate of Cag A antibody in chronic gastritis group was significantly higher than that of normal control group (P<0.05).Conclusion It is rapid and dependable that the Western Blotting can be used to examine the HP antibodies in children with ages above twelve years and to determine the type of HP.
Key words：Western Blotting;13Curea breath test;Helicobacter pylori;Cytotoxinassociated gene protein;Children
幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,HP)与胃肠疾病的发病关系目前正在被广泛研究。HP的致病因素包括CagA、VacA、菌毛、尿素酶、鞭毛等，其中以CagA、VacA最为重要，它们是HP毒力的标志[1]。免疫印迹试验判断出有无HP感染，并可区分HP感染的类型，在成人HP感染性疾病的诊断中已得到越来越多的重视。但在诊断儿童HP感染中的价值国内鲜见报道。本研究以2002年10月至2004年9月在我院消化科就诊的部分患儿为研究对象，探讨免疫印迹试验在诊断儿童HP感染及判断其致病性中的作用。
1 资料与方法
1.1 临床资料
450例病例均为我院2002年10月至2004年9月消化科患儿，年龄4岁~18岁，全部病例均有腹痛、恶心、厌食、呕吐等消化道症状，病程均在3个月以上。检查前4周内均未使用抗生素。其中4岁~6岁患儿56例，确诊HP感染18例；6岁~12岁患儿202例，确诊HP感染123例；12岁~18岁患儿192例，确诊HP感染146例。根据胃镜及病理检查结果分为：正常64例，确诊HP感染21例；慢性胃炎及十二指肠球炎248例，确诊有HP感染161例；胃十二指肠溃疡138例，确诊HP感染105例。
1.2 方法
1.2.1 应用Pentax FC 24纤维胃镜，由同一人操作。小儿慢性胃炎及胃溃疡的诊断按照小儿慢性胃炎、消化性溃疡胃镜诊断标准(试行)进行[2]。取病变处组织2块，应用10%甲醛固定，石蜡包埋，切片，脱蜡，常规病理检查。
1.2.2 HPDNA检测(PCR法)
留取胃液2 ml，使用PE5700基因扩增仪，试剂由达安基因诊断中心提供。
1.2.3 免疫印迹检查
空腹抽取静脉血2 ml，立即分离血清，-70 ℃冻存待查。采用深圳市伯劳特生物制品有限公司生产的HP免疫印迹试剂盒进行检测，严格按照操作说明书进行。显色后比对试剂盒所附的标准分子质量卡，即可测得血清样本中是否存在CagA的相应抗体。
1.2.4 13CUBT 受检患儿空腹4 h以上，先口服一杯实验餐，收集零时的呼气作为空白对照。后饮用溶有13C标记的尿素溶液50 ml，饮用后30 min收集呼气，密封待查。使用Isodiagnostika公司生产的ISOMAX2000设备，试剂由同一公司提供。
1.2.5 HP阳性结果判断
以三项试验(HPDNAPCR法、免疫印迹检查、13CUBT)中任两项阳性为确诊HP感染的诊断标准。
1.3 统计学方法
不同组别之间HP检出率的比较采用χ2检验。
2 结果
在4岁~6岁和6岁~12岁组患儿中，13CUBT HP检出率明显高于免疫印迹试验(P<0.01)；在12岁~18岁组患儿中，13CUBT HP检出率与免疫印迹试验比较差异无显著性(P>0.05)。见表1。表1 不同年龄组13CUBT与免疫印迹试验检出率的比较(略)
细胞毒性基因相关蛋白阳性(CagA+)的HP感染在溃疡病组明显高于慢性胃炎组和正常组(P<0.05)，慢性胃炎组CagA+HP显著高与正常组(P<0.05)。见表2。表2 不同组别CagA阳性HP感染率的比较(略)注：*表示正常组与溃疡组比较P<0.01；**表示胃炎组与正常组比较P<0.05；***表示溃疡组与胃炎组比较P<0.05。
3 讨论
HP于1983年由Warren和Marshall两位学者从胃黏膜中培养分离出以来，大量研究认为，HP是消化性溃疡、慢性活动性胃炎等上消化道疾病的主要致病因素。HP毒素按其分子质量可分为两种：一种为相对分子量为128 000的细胞毒素相关蛋白(CagA)，另一种为相对分子质量为87 000的空泡细胞毒素(VacA)。根据HP分泌毒素的情况不同可以将其分为产毒菌Tox+和非产毒菌Tox-，而研究表明Tox+菌其CagA蛋白几乎均为阳性，因此临床上将有CagA表达的HP称为Ⅰ型HP，其致病力强，国内李庭赞等[3]研究证明在成人慢性性胃炎、消化性溃疡、胃癌等疾病发生中Ⅰ型HP是重要的致病因素，Ⅱ型为无CagA表达的HP菌株，其毒性很弱。感染后可能发病较轻或不发病。免疫印迹试验能区分HP的类型。其工作原理是：先将HP的混合抗原用聚丙烯酰胺凝胶电泳，按分子量大小不同分开，再将其转移至硝酸纤维膜上，应用酶联免疫吸附反应，受检者的血清相关抗体会与抗原结合，在相应分子量的位置上出现显色区带，据此可判断HP的存在并区分感染的类型。
目前检测HP感染的方法很多，13CUBT被认为是一种测定小儿HP感染可靠的诊断方法，具有较高的敏感性和特异性[4]。本文将免疫印迹试验的HP检出率与13CUBT的结果比较，发现在12岁以下组13CUBT法 HP检出率明显高于免疫印迹试验；在12岁~18岁组患儿中，13CUBT法HP检出率与免疫印迹试验比较差异无显著性。这可能与年龄较小的患儿免疫功能较低，不能产生足够的抗体有关。证明免疫印迹试验不能单独检验年幼儿童的HP感染。此观点与Oliverira等关于酶联免疫吸附试验(ELISA)测定12岁以下患儿血清HPIgG敏感性太低的结论一致[5]。
进一步研究发现细胞毒性基因相关蛋白阳性(CagA+)的HP感染在消化道溃疡病组明显高于慢性胃炎组和正常组，慢性浅表胃炎组CagA+HP显著高于正常组。说明I型HP感染与儿童胃炎及消化道溃疡也有密切关系，细胞毒素可能是消化道溃疡形成的主要原因。
显然，对于12岁以上的患儿，免疫印迹试验试验可作为快速诊断HP感染的方法之一，其优点在于在检出细菌的同时能作出分类，因此能有效指导临床用药。此检查特点为：非侵入性，易为患儿接受；用血少,方法简单，实验条件要求低；检测时间短，能快速出结果。但对于12岁以下的患儿由于其检出率有限，建议与13CUBT联合应用。
参考文献：
[1]陈敏章，胡伏莲，周殿元,等.幽门螺旋杆菌感染的基础与临床[M].北京：中国科学技术出版社,1997：106107.
[2]陈洁，吴秀英.小儿慢性胃炎、消化性溃疡胃镜诊断标准(试行)[J].中华儿科杂志，1996,34(5)：296297.
[3]李赞庭，陈志坦，孙丹莉,等.HP和CagA+HP与中国人慢性胃炎、胃腺癌、消化性溃疡的关系[J].临床内科杂志，2001,18(1)：2830.
[4]楼金吐，陈肖肖，曲一平,等.13C尿素呼气试验诊断儿童幽门螺旋杆菌感染的临床评估[J].检验医学，2005,20(2)119120.
[5]De Oliveira AM，Rocha GA，Queiroz DM，et al.Evaluation of enzymelinked immunosorbent assay for the diagnosis of Helicobacter pylori infection in children from different age groups with and without duodenal ulcer [J].J Pediatr Gastroenterol Nutr，1999，28(2)：157161.
深圳市儿童医院，广东 深圳 518026, http://www.100md.com(陈运生，周少明，刘彬，孙玲玲)
[关键词] 免疫印迹试验；13C尿素呼气试验；幽门螺旋杆菌；细胞毒性基因相关蛋白；儿童
The Evaluation of Western Blotting Method for the Diagnosis of Helicobacter Pylori Infection in Children
CHEN Yunsheng, ZHOU Shaoming， LIU Bin, et al
(Shenzhen Children Hospital, Shenzhen, Guangdong 518026, China)
Abstract：Objective To evaluate the accuracy of the Western Blotting test in the diagnosis of Helicobacter pylori(HP) in different age groups with various gastric illnesses in children.Methods 450 children with digestive tract symptoms were tested for HP using pathological histology,13CUBT,serum western blotting and HPDNAPCR.Results In the groups with ages from 4 to 6 and 6 to12 years the detection frequency using13CUBT were significantly higher than Western blotting (P<0.01).In the group with ages from 12 to 18 years,there was no difference between13CUBT and Western Blotting in detection(P>0.05).Positive rate of Cag A antibody in peptic ulcer group was significantly higher than that of chronic gastritis group (P<0.05),Positive rate of Cag A antibody in chronic gastritis group was significantly higher than that of normal control group (P<0.05).Conclusion It is rapid and dependable that the Western Blotting can be used to examine the HP antibodies in children with ages above twelve years and to determine the type of HP.
Key words：Western Blotting;13Curea breath test;Helicobacter pylori;Cytotoxinassociated gene protein;Children
幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,HP)与胃肠疾病的发病关系目前正在被广泛研究。HP的致病因素包括CagA、VacA、菌毛、尿素酶、鞭毛等，其中以CagA、VacA最为重要，它们是HP毒力的标志[1]。免疫印迹试验判断出有无HP感染，并可区分HP感染的类型，在成人HP感染性疾病的诊断中已得到越来越多的重视。但在诊断儿童HP感染中的价值国内鲜见报道。本研究以2002年10月至2004年9月在我院消化科就诊的部分患儿为研究对象，探讨免疫印迹试验在诊断儿童HP感染及判断其致病性中的作用。
1 资料与方法
1.1 临床资料
450例病例均为我院2002年10月至2004年9月消化科患儿，年龄4岁~18岁，全部病例均有腹痛、恶心、厌食、呕吐等消化道症状，病程均在3个月以上。检查前4周内均未使用抗生素。其中4岁~6岁患儿56例，确诊HP感染18例；6岁~12岁患儿202例，确诊HP感染123例；12岁~18岁患儿192例，确诊HP感染146例。根据胃镜及病理检查结果分为：正常64例，确诊HP感染21例；慢性胃炎及十二指肠球炎248例，确诊有HP感染161例；胃十二指肠溃疡138例，确诊HP感染105例。
1.2 方法
1.2.1 应用Pentax FC 24纤维胃镜，由同一人操作。小儿慢性胃炎及胃溃疡的诊断按照小儿慢性胃炎、消化性溃疡胃镜诊断标准(试行)进行[2]。取病变处组织2块，应用10%甲醛固定，石蜡包埋，切片，脱蜡，常规病理检查。
1.2.2 HPDNA检测(PCR法)
留取胃液2 ml，使用PE5700基因扩增仪，试剂由达安基因诊断中心提供。
1.2.3 免疫印迹检查
空腹抽取静脉血2 ml，立即分离血清，-70 ℃冻存待查。采用深圳市伯劳特生物制品有限公司生产的HP免疫印迹试剂盒进行检测，严格按照操作说明书进行。显色后比对试剂盒所附的标准分子质量卡，即可测得血清样本中是否存在CagA的相应抗体。
1.2.4 13CUBT 受检患儿空腹4 h以上，先口服一杯实验餐，收集零时的呼气作为空白对照。后饮用溶有13C标记的尿素溶液50 ml，饮用后30 min收集呼气，密封待查。使用Isodiagnostika公司生产的ISOMAX2000设备，试剂由同一公司提供。
1.2.5 HP阳性结果判断
以三项试验(HPDNAPCR法、免疫印迹检查、13CUBT)中任两项阳性为确诊HP感染的诊断标准。
1.3 统计学方法
不同组别之间HP检出率的比较采用χ2检验。
2 结果
在4岁~6岁和6岁~12岁组患儿中，13CUBT HP检出率明显高于免疫印迹试验(P<0.01)；在12岁~18岁组患儿中，13CUBT HP检出率与免疫印迹试验比较差异无显著性(P>0.05)。见表1。表1 不同年龄组13CUBT与免疫印迹试验检出率的比较(略)
细胞毒性基因相关蛋白阳性(CagA+)的HP感染在溃疡病组明显高于慢性胃炎组和正常组(P<0.05)，慢性胃炎组CagA+HP显著高与正常组(P<0.05)。见表2。表2 不同组别CagA阳性HP感染率的比较(略)注：*表示正常组与溃疡组比较P<0.01；**表示胃炎组与正常组比较P<0.05；***表示溃疡组与胃炎组比较P<0.05。
3 讨论
HP于1983年由Warren和Marshall两位学者从胃黏膜中培养分离出以来，大量研究认为，HP是消化性溃疡、慢性活动性胃炎等上消化道疾病的主要致病因素。HP毒素按其分子质量可分为两种：一种为相对分子量为128 000的细胞毒素相关蛋白(CagA)，另一种为相对分子质量为87 000的空泡细胞毒素(VacA)。根据HP分泌毒素的情况不同可以将其分为产毒菌Tox+和非产毒菌Tox-，而研究表明Tox+菌其CagA蛋白几乎均为阳性，因此临床上将有CagA表达的HP称为Ⅰ型HP，其致病力强，国内李庭赞等[3]研究证明在成人慢性性胃炎、消化性溃疡、胃癌等疾病发生中Ⅰ型HP是重要的致病因素，Ⅱ型为无CagA表达的HP菌株，其毒性很弱。感染后可能发病较轻或不发病。免疫印迹试验能区分HP的类型。其工作原理是：先将HP的混合抗原用聚丙烯酰胺凝胶电泳，按分子量大小不同分开，再将其转移至硝酸纤维膜上，应用酶联免疫吸附反应，受检者的血清相关抗体会与抗原结合，在相应分子量的位置上出现显色区带，据此可判断HP的存在并区分感染的类型。
目前检测HP感染的方法很多，13CUBT被认为是一种测定小儿HP感染可靠的诊断方法，具有较高的敏感性和特异性[4]。本文将免疫印迹试验的HP检出率与13CUBT的结果比较，发现在12岁以下组13CUBT法 HP检出率明显高于免疫印迹试验；在12岁~18岁组患儿中，13CUBT法HP检出率与免疫印迹试验比较差异无显著性。这可能与年龄较小的患儿免疫功能较低，不能产生足够的抗体有关。证明免疫印迹试验不能单独检验年幼儿童的HP感染。此观点与Oliverira等关于酶联免疫吸附试验(ELISA)测定12岁以下患儿血清HPIgG敏感性太低的结论一致[5]。
进一步研究发现细胞毒性基因相关蛋白阳性(CagA+)的HP感染在消化道溃疡病组明显高于慢性胃炎组和正常组，慢性浅表胃炎组CagA+HP显著高于正常组。说明I型HP感染与儿童胃炎及消化道溃疡也有密切关系，细胞毒素可能是消化道溃疡形成的主要原因。
显然，对于12岁以上的患儿，免疫印迹试验试验可作为快速诊断HP感染的方法之一，其优点在于在检出细菌的同时能作出分类，因此能有效指导临床用药。此检查特点为：非侵入性，易为患儿接受；用血少,方法简单，实验条件要求低；检测时间短，能快速出结果。但对于12岁以下的患儿由于其检出率有限，建议与13CUBT联合应用。
参考文献：
[1]陈敏章，胡伏莲，周殿元,等.幽门螺旋杆菌感染的基础与临床[M].北京：中国科学技术出版社,1997：106107.
[2]陈洁，吴秀英.小儿慢性胃炎、消化性溃疡胃镜诊断标准(试行)[J].中华儿科杂志，1996,34(5)：296297.
[3]李赞庭，陈志坦，孙丹莉,等.HP和CagA+HP与中国人慢性胃炎、胃腺癌、消化性溃疡的关系[J].临床内科杂志，2001,18(1)：2830.
[4]楼金吐，陈肖肖，曲一平,等.13C尿素呼气试验诊断儿童幽门螺旋杆菌感染的临床评估[J].检验医学，2005,20(2)119120.
[5]De Oliveira AM，Rocha GA，Queiroz DM，et al.Evaluation of enzymelinked immunosorbent assay for the diagnosis of Helicobacter pylori infection in children from different age groups with and without duodenal ulcer [J].J Pediatr Gastroenterol Nutr，1999，28(2)：157161.
深圳市儿童医院，广东 深圳 518026, http://www.100md.com(陈运生，周少明，刘彬，孙玲玲)