PCNA、p53和hTERT在子宫颈病变中的表达及意义
摘要：目的：探讨PCNA、p53和hTERT在宫颈糜烂,宫颈上皮内瘤样变(CIN)及宫颈癌中的表达及临床意义。方法:采用免疫组化技术检测宫颈糜烂22例, 宫颈上皮内瘤样变38例,宫颈癌20例中PCNA、p53和hTERT的表达。结果:PCNA、p53和hTERT在宫颈糜烂,宫颈上皮内瘤样变及宫颈癌中的表达有统计学差异。结论:PCNA、p53和hTERT与宫颈癌的发生发展相关,它们的异常表达为宫颈癌的诊断提供了一定的病理学依据。
关键词： 宫颈癌； p53； hTERT
Expression and Clinical Significance of PCNA, p53 Protein and hTERT in Cervical Lesion
WANG Yu-lian， et al
(The People's Hospital of Leizhou, Guangdong Leizhou 524200,China)
, 百拇医药
Abstract:Objective： To investigate the clinical significance and the expression of PCNA,P53 protein and hTERT in cervical lesion tissues. Method： Immunohistochemistry was used to examine the expression of PCNA,p53 protein and hTERT in 22 cervical erosion tissues and 38 cervical intraepithelial neoplasia(CIN) tissues and 20 cervical carcinoma tissues. Result： The expression of PCNA , p53 protein and hTERT showed an increasing tendency from 22 normal cervical tissues to 38 CIN tissues,then to 20 cervical carcinoma tissues. Conclusion： The expression of PCNA, p53 protein and hTERT plays an important role in the development and malignant changes of cervical carcinoma.
, 百拇医药
Key words: Cervical carcinoma; p53; hTERT
宫颈癌是妇科肿瘤中最常见的恶性肿瘤,而宫颈癌中的一部分由宫颈糜烂,宫颈上皮内瘤样变病变发展而来,其发生发展受诸多因素的影响。端粒酶是合成及维持端粒重复序列的一种特殊核糖核酸蛋白质复合体,主要由3部分组成:人端粒酶mRNA (hTR)、端粒酶相关蛋白 (TP1)和人端粒酶逆转录酶(hTERT),其中hTERT是维持端粒酶活性最重要的成分,与端粒酶活性呈平行相关[1,2],而端粒酶活性是癌细胞无限增殖的基础。增殖细胞核抗原(PCNA)已被证实与细胞增殖活跃和恶性程度密切相关。抑癌基因P53结构和功能的异常与大多数恶性肿瘤的发生密切相关。本研究应用免疫组化方法检测了宫颈糜烂,宫颈上皮内瘤样变及宫颈癌中的PCNA、P53蛋白和hTERT的表达,以揭示端粒酶活性、P53蛋白和PCNA在子宫颈癌变发生发展中的作用,不仅有助于阐明子宫颈癌前病变、癌变的发生发展机制,且有利于临床筛选高危人群和评估癌的预后及治疗效果。
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1 材料与方法
1.1 标本来源：收集广东医学院附属医院及雷州市人民医院妇科2002年至2005年活检或手术患者病变组织块,10%甲醛液固定,常规石蜡包埋,部分标本选自病检存档蜡块,共80例,其中宫颈糜烂22例, 宫颈上皮内瘤样变38例,宫颈癌20例，均经病理学确诊。经统计学处理,各组病例的平均年龄无显著性差异。
1.2 试剂与方法：免疫组化:Ⅰ抗: PCNA鼠抗IgG(PC10),P53鼠抗IgG (DO-7),购自北京中山生物技术有限公司;Envivion二步法试剂盒购自DAKO公司。按说明书进行,以已知PCNA或P53阳性的乳腺癌组织为阳性对照,用PBS液代替一抗作阴性对照。
1.3 结果判定：PCNA、p53阳性细胞为细胞核呈棕黄色颗粒,随机选5个视野低倍镜(×200)采用图像分析系统对PCNA、p53阳性细胞进行计数,将收集的数据进行整理,并由此得出阳性细胞的百分比。hTERT阳性为细胞浆中出现蓝紫色颗粒,根据子宫颈上皮细胞特点及参考钟鸣[3]等文献资料,将染色结果分为:<10%计(-)即阴性,10%～40%计(+)即弱阳性,40%～70%计(++)即中阳性,>70%计(+++)即强阳性。
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1.4 统计学分析：检测结果用SPSS11.00软件进行统计学分析,各组的PCNA、p53阳性细胞百分比进行单因素方差分析, hTERT阳性率进行X2检验。
2 结果
2.1 hTERT的表达：在慢性宫颈炎组中仅1例有弱表达,主要位于基底层及棘细胞深层。在CIN组中,随着异常增生程度的增加,阳性率也逐渐增加,宫颈癌时阳性率达最高, 宫颈炎组织hTERT表达阳性率明显低于宫颈癌和CIN(见表1),且随着异常增生程度的增加阳性细胞分布也从基底层向表层扩展,在重度异常增生或原位癌中,甚至可达上皮全层,在高分化宫颈癌中,阳性细胞主要分布在癌巢周边部,分化较差的宫颈癌,肿瘤细胞呈片状弥漫性阳性染色。
表1 hTERT在子宫颈增生性病变中的表达(略)
2.2 p53蛋白的表达：22例宫颈炎标本中p53呈表达阳性者2例,阳性率9.0%;20例宫颈癌标本p53表达阳性8例,阳性率40.0%;38例CIN标本中,12例可见。p53表达阳性,阳性率31.6%。宫颈炎组织p53表达阳性率明显低于宫颈癌和CIN，而在CIN组织中随着组织分级的增加,p53表达阳性率和表达强度有增高趋势,CIN I与CIN II、CIN III比较差异有显著意义,CIN II与CIN III比较无显著差异，见表2和表3。
, 百拇医药
2.3 3种组织中PCNA的表达：PCNA阳性产物呈颗粒状散在分布于细胞膜和细胞核内，着色深浅不一。本文22例宫颈炎组织中PCNA表达阳性者9例，表达阳性率为40.9%。 CIN为78.9%、宫颈癌组织为95.0%。CIN及宫颈癌组织分化越差，其表达阳性率和表达强度越高。CIN I阳性产物分布与着色程度与宫颈炎表达的阳性细胞相似;而CIN II和CIN III阳性细胞中，着色颗粒更多集中于细胞核内，较密集、染色较深，与宫颈癌相似。宫颈癌低分化组与中、高分化组之间差异均有显著性(X2=27.1～39.2, P<0.05)，见表2和表3。
表2 P53、PCNA在CIN组织中的表达(略)
表3 P53、PCNA在宫颈癌组织中的表达(略)
3 讨论
端粒-端粒酶机制是近年肿瘤研究的热点,端粒酶通过催化端粒合成,保持端粒长度而维持细胞持续分裂能力,其激活与细胞增殖和生化密切相关,端粒酶活性由其重要组分hTERT决定[1],45%～81.18%的CIN和子宫颈癌中可测到端粒酶活性[3]。宫颈癌的发生与CIN关系密切,且异常增生程度与癌变呈正比,这种从异常增生到癌的连续性谱系为研究宫颈癌的发生的分子机制提供了良好模式。对异常增生到癌的连续病变，如口腔鳞癌、胃癌等的研究均显示端粒酶活性逐渐递增[3,4]。本研究显示的表达在慢性宫颈炎、CIN至宫颈癌中呈递增表现,且宫颈癌中显著高于异常增生,提示阳性的上皮异常增生,癌变危险性增加。
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p53基因是至今发现与人类肿瘤相关性最高的基因,现普遍认为p53是抑癌基因,只有p53发生基因突变或与其他蛋白相互作用,才导致p53正常功能丧失,进而引起肿瘤形成。约12%~100%的宫颈癌和头颈部鳞癌中存在p53突变[5],主要存在于上皮基底层和肿瘤前沿。本研究显示宫颈癌组织中p53蛋白有40.0%的阳性,在CIN占31.6%,两者差异显著(P<0.05),提示p53的突变在肿瘤的发生发展中意义重大,可通过检测p53突变/表达来预测个体对癌症危险性的反应。
PCNA是聚合酶的辅助蛋白,也是一种细胞调节蛋白,随细胞周期而变化,是评价细胞增殖状态的客观指标,目前已广泛应用于癌前病变、恶性肿瘤细胞增生活性的研究。本研究显示PCNA在宫颈癌组织中的表达明显的高于在CIN和慢性宫颈炎中的表达。
肿瘤的发生发展是一个多步骤的过程,往往是在致病因素作用同时,多种基因同时或先后协同作用的结果。PCNA、p53和hTERT均参与子宫颈癌前病变、癌变的发生发展,其在上皮重度异常增生及鳞癌中的高表达及上皮单纯增生中的低表达,表明PCNA、p53和hTERT有望成为肿瘤标志物,临床上多种基因的同时检测,将有利于监控宫颈癌的发生和发展,以及预后的评估。
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参考文献：
[1] M Morita, K Nakanishi, T Kawai, et al.Telomere length, telomerase activity, and expression of human telomerase reverse transcriptase mRNA in growth plate of epiphyseal articular cartilage in femoral head during normal human development and in thanatophoric dysplasia.Hum Pathol[J]. Apr， 2004， 35(4): 403-411.
[2] Kenoki Ohuchida, Kazuhiro Mizumoto, Yasuhiro Ogura,et al.Quantitative Assessment of Telomerase Activity and Human Telomerase Reverse Transcriptase Messenger RNA Levels in Pancreatic Juice Samples for the Diagnosis of Pancreatic Cancer[J]. Clin Cancer Res,2005，11:2285-2292.
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[3] 吴国英,朱玲,祁兵.端粒酶逆转录酶在口腔黏膜癌前病变和鳞癌中的表达[J].口腔医学,2003,23(3)：B137-139.
[4] 杨仕明,张学庸,樊代明,等.胃癌和癌前组织中端粒酶活性的检测及其临床意义[J].中华医学杂志,1998,78：B207-209.
[5] Nagai MA, Miracca EC, Yamamoto L, et al.T p53 geneticalterations in head and carcinomas from brazil[J].Int Cancer,1998,76(1):13-18.
(广东省雷州市人民医院， 广东 雷州 524200
广东医学院附属医院, 广东 湛江 524001), 百拇医药(王玉莲， 方林彬， 林琼燕)
关键词： 宫颈癌； p53； hTERT
Expression and Clinical Significance of PCNA, p53 Protein and hTERT in Cervical Lesion
WANG Yu-lian， et al
(The People's Hospital of Leizhou, Guangdong Leizhou 524200,China)
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Abstract:Objective： To investigate the clinical significance and the expression of PCNA,P53 protein and hTERT in cervical lesion tissues. Method： Immunohistochemistry was used to examine the expression of PCNA,p53 protein and hTERT in 22 cervical erosion tissues and 38 cervical intraepithelial neoplasia(CIN) tissues and 20 cervical carcinoma tissues. Result： The expression of PCNA , p53 protein and hTERT showed an increasing tendency from 22 normal cervical tissues to 38 CIN tissues,then to 20 cervical carcinoma tissues. Conclusion： The expression of PCNA, p53 protein and hTERT plays an important role in the development and malignant changes of cervical carcinoma.
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Key words: Cervical carcinoma; p53; hTERT
宫颈癌是妇科肿瘤中最常见的恶性肿瘤,而宫颈癌中的一部分由宫颈糜烂,宫颈上皮内瘤样变病变发展而来,其发生发展受诸多因素的影响。端粒酶是合成及维持端粒重复序列的一种特殊核糖核酸蛋白质复合体,主要由3部分组成:人端粒酶mRNA (hTR)、端粒酶相关蛋白 (TP1)和人端粒酶逆转录酶(hTERT),其中hTERT是维持端粒酶活性最重要的成分,与端粒酶活性呈平行相关[1,2],而端粒酶活性是癌细胞无限增殖的基础。增殖细胞核抗原(PCNA)已被证实与细胞增殖活跃和恶性程度密切相关。抑癌基因P53结构和功能的异常与大多数恶性肿瘤的发生密切相关。本研究应用免疫组化方法检测了宫颈糜烂,宫颈上皮内瘤样变及宫颈癌中的PCNA、P53蛋白和hTERT的表达,以揭示端粒酶活性、P53蛋白和PCNA在子宫颈癌变发生发展中的作用,不仅有助于阐明子宫颈癌前病变、癌变的发生发展机制,且有利于临床筛选高危人群和评估癌的预后及治疗效果。
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1 材料与方法
1.1 标本来源：收集广东医学院附属医院及雷州市人民医院妇科2002年至2005年活检或手术患者病变组织块,10%甲醛液固定,常规石蜡包埋,部分标本选自病检存档蜡块,共80例,其中宫颈糜烂22例, 宫颈上皮内瘤样变38例,宫颈癌20例，均经病理学确诊。经统计学处理,各组病例的平均年龄无显著性差异。
1.2 试剂与方法：免疫组化:Ⅰ抗: PCNA鼠抗IgG(PC10),P53鼠抗IgG (DO-7),购自北京中山生物技术有限公司;Envivion二步法试剂盒购自DAKO公司。按说明书进行,以已知PCNA或P53阳性的乳腺癌组织为阳性对照,用PBS液代替一抗作阴性对照。
1.3 结果判定：PCNA、p53阳性细胞为细胞核呈棕黄色颗粒,随机选5个视野低倍镜(×200)采用图像分析系统对PCNA、p53阳性细胞进行计数,将收集的数据进行整理,并由此得出阳性细胞的百分比。hTERT阳性为细胞浆中出现蓝紫色颗粒,根据子宫颈上皮细胞特点及参考钟鸣[3]等文献资料,将染色结果分为:<10%计(-)即阴性,10%～40%计(+)即弱阳性,40%～70%计(++)即中阳性,>70%计(+++)即强阳性。
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1.4 统计学分析：检测结果用SPSS11.00软件进行统计学分析,各组的PCNA、p53阳性细胞百分比进行单因素方差分析, hTERT阳性率进行X2检验。
2 结果
2.1 hTERT的表达：在慢性宫颈炎组中仅1例有弱表达,主要位于基底层及棘细胞深层。在CIN组中,随着异常增生程度的增加,阳性率也逐渐增加,宫颈癌时阳性率达最高, 宫颈炎组织hTERT表达阳性率明显低于宫颈癌和CIN(见表1),且随着异常增生程度的增加阳性细胞分布也从基底层向表层扩展,在重度异常增生或原位癌中,甚至可达上皮全层,在高分化宫颈癌中,阳性细胞主要分布在癌巢周边部,分化较差的宫颈癌,肿瘤细胞呈片状弥漫性阳性染色。
表1 hTERT在子宫颈增生性病变中的表达(略)
2.2 p53蛋白的表达：22例宫颈炎标本中p53呈表达阳性者2例,阳性率9.0%;20例宫颈癌标本p53表达阳性8例,阳性率40.0%;38例CIN标本中,12例可见。p53表达阳性,阳性率31.6%。宫颈炎组织p53表达阳性率明显低于宫颈癌和CIN，而在CIN组织中随着组织分级的增加,p53表达阳性率和表达强度有增高趋势,CIN I与CIN II、CIN III比较差异有显著意义,CIN II与CIN III比较无显著差异，见表2和表3。
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2.3 3种组织中PCNA的表达：PCNA阳性产物呈颗粒状散在分布于细胞膜和细胞核内，着色深浅不一。本文22例宫颈炎组织中PCNA表达阳性者9例，表达阳性率为40.9%。 CIN为78.9%、宫颈癌组织为95.0%。CIN及宫颈癌组织分化越差，其表达阳性率和表达强度越高。CIN I阳性产物分布与着色程度与宫颈炎表达的阳性细胞相似;而CIN II和CIN III阳性细胞中，着色颗粒更多集中于细胞核内，较密集、染色较深，与宫颈癌相似。宫颈癌低分化组与中、高分化组之间差异均有显著性(X2=27.1～39.2, P<0.05)，见表2和表3。
表2 P53、PCNA在CIN组织中的表达(略)
表3 P53、PCNA在宫颈癌组织中的表达(略)
3 讨论
端粒-端粒酶机制是近年肿瘤研究的热点,端粒酶通过催化端粒合成,保持端粒长度而维持细胞持续分裂能力,其激活与细胞增殖和生化密切相关,端粒酶活性由其重要组分hTERT决定[1],45%～81.18%的CIN和子宫颈癌中可测到端粒酶活性[3]。宫颈癌的发生与CIN关系密切,且异常增生程度与癌变呈正比,这种从异常增生到癌的连续性谱系为研究宫颈癌的发生的分子机制提供了良好模式。对异常增生到癌的连续病变，如口腔鳞癌、胃癌等的研究均显示端粒酶活性逐渐递增[3,4]。本研究显示的表达在慢性宫颈炎、CIN至宫颈癌中呈递增表现,且宫颈癌中显著高于异常增生,提示阳性的上皮异常增生,癌变危险性增加。
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p53基因是至今发现与人类肿瘤相关性最高的基因,现普遍认为p53是抑癌基因,只有p53发生基因突变或与其他蛋白相互作用,才导致p53正常功能丧失,进而引起肿瘤形成。约12%~100%的宫颈癌和头颈部鳞癌中存在p53突变[5],主要存在于上皮基底层和肿瘤前沿。本研究显示宫颈癌组织中p53蛋白有40.0%的阳性,在CIN占31.6%,两者差异显著(P<0.05),提示p53的突变在肿瘤的发生发展中意义重大,可通过检测p53突变/表达来预测个体对癌症危险性的反应。
PCNA是聚合酶的辅助蛋白,也是一种细胞调节蛋白,随细胞周期而变化,是评价细胞增殖状态的客观指标,目前已广泛应用于癌前病变、恶性肿瘤细胞增生活性的研究。本研究显示PCNA在宫颈癌组织中的表达明显的高于在CIN和慢性宫颈炎中的表达。
肿瘤的发生发展是一个多步骤的过程,往往是在致病因素作用同时,多种基因同时或先后协同作用的结果。PCNA、p53和hTERT均参与子宫颈癌前病变、癌变的发生发展,其在上皮重度异常增生及鳞癌中的高表达及上皮单纯增生中的低表达,表明PCNA、p53和hTERT有望成为肿瘤标志物,临床上多种基因的同时检测,将有利于监控宫颈癌的发生和发展,以及预后的评估。
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参考文献：
[1] M Morita, K Nakanishi, T Kawai, et al.Telomere length, telomerase activity, and expression of human telomerase reverse transcriptase mRNA in growth plate of epiphyseal articular cartilage in femoral head during normal human development and in thanatophoric dysplasia.Hum Pathol[J]. Apr， 2004， 35(4): 403-411.
[2] Kenoki Ohuchida, Kazuhiro Mizumoto, Yasuhiro Ogura,et al.Quantitative Assessment of Telomerase Activity and Human Telomerase Reverse Transcriptase Messenger RNA Levels in Pancreatic Juice Samples for the Diagnosis of Pancreatic Cancer[J]. Clin Cancer Res,2005，11:2285-2292.
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[3] 吴国英,朱玲,祁兵.端粒酶逆转录酶在口腔黏膜癌前病变和鳞癌中的表达[J].口腔医学,2003,23(3)：B137-139.
[4] 杨仕明,张学庸,樊代明,等.胃癌和癌前组织中端粒酶活性的检测及其临床意义[J].中华医学杂志,1998,78：B207-209.
[5] Nagai MA, Miracca EC, Yamamoto L, et al.T p53 geneticalterations in head and carcinomas from brazil[J].Int Cancer,1998,76(1):13-18.
(广东省雷州市人民医院， 广东 雷州 524200
广东医学院附属医院, 广东 湛江 524001), 百拇医药(王玉莲， 方林彬， 林琼燕)