一氧化氮对急性出血坏死性胰腺炎肝脏中Toll样受体2/4 mRNA表达的影响
张磊 吴河水 陈燕 陈铭坤 王琳 郭兴军 王春友 张景辉
【摘要】 目的 探讨一氧化氮(NO)对于急性出血坏死性胰腺炎(AHNP)时肝脏中Toll样受体2/4(TLR2/4)mRNA表达的影响。方法 采用牛磺胆酸钠(TAC)逆行胰胆管注射制备AHNP肺损伤大鼠模型。动物分为假手术组、胰腺炎组和L精氨酸(LArg)治疗组。假手术组于术后6 h，胰腺炎组和L Arg组分别于术后3、6、12 h取静脉血和肝组织，测定血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、淀粉酶和肝组织NO，逆转录聚合酶链反应(RTPCR)方法检测不同时间点肝组织肿瘤坏死因子α(TNF α)、TLR2/4 mRNA表达变化。结果 与假手术组比较，胰腺炎组大鼠3 h肝组织TLR2/4 mRNA表达开始增高〔(1970±0.362)×10-3,(175000±0111)×10-3比(1.150±0.725)×10-6,(11450±1724)×10-4〕,12 h表达达峰值〔(2.940±0316)×10-3,(2 673000±88.380)×10-3，P均<001〕；血清淀粉酶ALT、AST 3 h后即升高，肝损伤加重，肝组织TNFα mRNA表达升高，NO浓度逐渐降低(P<005或P<001)；给予LArg治疗后，NO浓度升高(P<0.05)，TLR2/4 mRNA表达降低〔3 h:(0351±0153)×10-3,(135.000±22.310)×10-3;6 h:(2.100±0.535)×10-3,(187000±26850)×10-3;12 h:(2620±0.208)×10-3,(1 959.000±270.000)×10-3;P<005或P<0.01〕，血清淀粉酶、ALT、AST均降低，肝损伤减轻，肝组织TNFα mRNA降低(P<0.05或P<0.01)。结论 AHNP时，肝组织内TLR2/4 mRNA表达上调,肝组织损伤加重；NO可以明显抑制AHNP肝组织TLR2/4 mRNA的表达。
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【关键词】 Toll样受体；胰腺炎，坏死性，出血，急性；肝脏；一氧化氮
Effect of nitric oxide on Tolllike receptor 2/4 gene expression in the liver in acute hemorrhagic necrotizing pancreatitis in rats ZHANG Lei, WU Heshui, CHEN Yan, CHEN Mingkun, WANG Lin, GUO Xingjun, WANG Chunyou, ZHANG Jinghui.Affiliated Union Hospital of Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, Hubei, China
Corresponding author: WU Heshui (Email: whs1898@public.wh.hb.cn)
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【Abstract】Objective To investigate the effect of nitric oxide (NO) on Tolllike receptors 2/4 (TLR 2/4) gene expression in the liver in acute hemorrhagic necrotizing pancreatitis (AHNP) in rats. Methods Seventy SD male rats were randomly divided into shamoperated group (n=10), AHNP group (n=30) and Larginine (LArg) treatment group (n=30). Blood samples and liver tissues were obtained at 6 hours in shamoperated group, and 3, 6, 12 hours respectively in AHNP group and LArgtreated group. Alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), amylase in serum, NO in liver tissue were determined. Tumor necrosis factorα(TNFα) and TLR2/4 mRNA expressions in the liver tissue were measured by reverse transcription polymerase chain reaction. Results TLR2/4 mRNA could be detected in the liver with low values in shamoperated group 〔(1.150±0.725)×10-6,(11.450±1.724)×10-4〕, but they were markedly upregulated at 3 hours in AHNP group 〔(1.970±0.362)×10-3,(175.000±0.111)×10-3〕, and peaked at 12 hours 〔(2.940±0.316)×10-3,(2 673.000±88.380)×10-3，all P<0.01〕. At the same time serum levels of amylase, ALT and AST increased, hepatic injuries were aggravated, levels of TNFα mRNA in the liver were increased and levels of NO in the liver were lowered (P<005 or P<001). Treatment with LArg could effectively inhibit TLR2/4 mRNA expression 〔3 h: (0.351±0.153)×10-3,(135000±22310)×10-3;6 h:(2.100±0.535)×10-3,(187000±26850)×10-3;12 h:(2620±0208)×10-3,(1 959.000±270.000)×10-3，P<0.05 or P<0.01〕 and alleviate hepatic injuries. The levels of serum amylase, ALT and AST lowered, and the levels of TNFα mRNA in the liver were lowered and the levels of NO were markly increased (P<0.05 or P<0.01). Conclusion These findings suggest that the expression of TLR2/4 mRNA is increased in the liver in AHNP, and the hepatic injuries are aggravated. NO could markly inhibit TLR2/4 mRNA gene expression in the liver in AHNP.
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【Key words】 Tolllike receptors;acute hemorrhage necrotizinpancreatitis;liver;nitricoxide
急性出血坏死性胰腺炎(AHNP)发病凶险，病死率高，发病早期就可引起心、肺、肾、肝等多个器官功能不全，严重时发展到多器官功能障碍综合征(MODS)，但其具体机制不详。研究提示，多种促炎症细胞因子，如肿瘤坏死因子 α(TNFα)、白细胞介素6(IL6)、诱生型一氧化氮合酶(iNOS)等介导的全身炎症反应综合征(SIRS)可能在其发生中起重要作用〔13〕。近年来发现，刺激激活Toll样受体2/4(TLR2/4)基因表达后，可通过一系列信号转导产生炎症放大效应〔4，5〕，在AHNP发病中起一定作用。本研究中通过观察应用L精氨酸(L Arg)升高AHNP模型大鼠体内一氧化氮(NO)后肝组织TLR2/4 mRNA的表达变化及对肝损伤程度的影响，了解TLR2/4 mRNA在AHNP肝损伤中的作用，以及NO对AHNP肝损伤的治疗效果。
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1 材料与方法1.1 实验动物与分组：雄性SD大鼠70只，购自华中科技大学同济医学院实验动物中心，体重180~200 g，采用随机数字表法分为假手术组(10只)、胰腺炎组(30只)和LArg治疗组(30只)。胰腺炎组和LArg治疗组于术后又分为3、6、12 h 3个时间点，每个时间点10只。
1.2 动物模型制备：实验前大鼠禁食12 h，自由饮水。胰腺炎组采用质量分数为5%的牛磺胆酸钠(TAC,Sigma公司)0.1 ml/100 g逆行胰胆管注射制备动物模型；LArg治疗组在行TAC胰胆管逆行注射后立即经下腔静脉注射LArg(凌飞科技公司，日本)100 mg/kg；假手术组动物开腹翻动肠管后关腹。胰腺炎组和LArg治疗组大鼠于术后3、6和12 h活杀，假手术组于术后6 h活杀,留取静脉血和肝组织标本待测。
1.3 观察指标与方法
1.3.1 血清丙氨酸转氨酶(ALT)及天冬氨酸转氨酶(AST)由全自动生化分析仪测定。
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1.3.2 血清淀粉酶和肝组织NO测定：血清淀粉酶采用碘淀粉比色法测定；NO采用硝酸还原酶比色法测定(试剂盒由南京建成生物工程研究所提供)。
1.3.3 肝组织TNFα mRNA及TLR2/4 mRNA的表达：无菌留取肝组织各约50 mg，以Trizol一步法提取细胞总RNA(Promega公司，香港)。采用荧光实时定量逆转录聚合酶链反应(RTPCR)技术对逆转录扩增产物行定量分析。TLR2引物序列：5′CGCTTCCTGAACTTGTCC3′(正义链),5′GGTTGTCACCTGCTTCCA3′(反义链),扩增片段约为200 bp，荧光探针序列:5′ACTAAGAGGCGGAGCGGA3′；TLR4引物序列：5′ATCATGGCATTGTTCCT TTCCT3′(正义链),5′CTGAGATTCTGATCCATGCATTG3′(反义链),扩增片段约为100 bp，荧光探针序列:5′TCGGTAACGACGGTTGTAG3′；TNFα引物序列：5′CCCGTCGGAACAGGGAACTT3′(正义链),5′GGGTGTCCTTAGGGCA AG3′(反义链),扩增片段约为100 bp，荧光探针序列:5′CGAGGAGGCGAACC ACCAA3′；内参照β肌动蛋白(βactin)引物序列为:5′GAACGGTGAAGGTGACAG3′(正义链),5′TAGAGAGAGTGGGGTGG3′(反义链)，荧光探针序列:5′ACCACAGCACCTGCGGGAT3′。延伸过程中搜集荧光信号，于每次扩增的同时设无cDNA的阴性对照。结果由FTC2000型实时荧光定量PCR仪(上海枫岭生物技术有限公司)自带分析软件进行分析。
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1.4 统计学处理:数据以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS10.0统计软件包对数据进行方差分析、t检验等处理,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 血清淀粉酶、ALT和AST变化(表1):胰腺炎组血清淀粉酶明显高于假手术组(P均<0.01)，且随时间延长而升高，但各时间点之间比较差异无显著性(P均>0.05)。胰腺炎组ALT、AST均明显高于假手术组(P均<0.01)，且随时间延长而升高，各时间点之间比较差异有显著性(P均<0.01)。LArg治疗组血清淀粉酶、ALT和AST明显降低，但仍明显高于假手术组(P<0.05或P<0.01)。
2.2 肝组织NO浓度、TNFα mRNA变化(表2)：胰腺炎组肝组织TNFα mRNA 3 h明显高于假手术组，然后逐渐降低，但仍高于假手术组(P均<0.01)；而NO浓度胰腺炎组明显低于假手术组，并随时间延长而明显降低(P<0.05或P<0.01)。LArg治疗组肝组织NO浓度于3 h和6 h明显高于胰腺炎组相应时间点(P均<0.05)，12 h比较差异无显著性(P>0.05)；TNFα mRNA明显低于胰腺炎组相应时间点(P均<0.01)。
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2.3 肝组织中TLR2/4 mRNA表达变化(表2)：TLR2/4 mRNA在假手术组有少量表达，胰腺炎组较假手术组3 h有明显升高，6~12 h继续升高，12 h达到峰值(P均<0.01)。LArg治疗组较胰腺炎组肝组织TLR2/4 mRNA表达明显降低(P<0.05或P<0.01)。
3 讨论
现在已经发现了10种人体内TLR〔6，7〕。TLRs胞外有富含亮氨酸的结构域(LRR)，而其胞浆区结构和功能与白细胞介素1受体(IL1R)非常相似，因此被共同归为TLR/IL1R超家族。TLRs通过识别保守的细菌结构，即病原相关分子模式(PAMP)，而在天然免疫反应中发挥重要作用。同时TLR与PAMP结合可激活抗原提呈细胞，使之表达多种共刺激分子和细胞因子，从而参与特异性免疫应答的启动。其中TLR2/4在细菌感染中效应最显著〔8〕，TLR2可以识别革兰阳性菌的PAMP，如肽聚糖、脂膜酸等；TLR4可以识别革兰阴性菌和白色念珠菌的PAMP，如脂多糖(LPS)和热休克蛋白(HSP)等，从而在感染的发生、发展中起作用〔9〕。在对TLR2/4基因缺失小鼠的研究中发现，TLR2或TLR4基因缺失会导致机体对病原微生物易感性增强〔1013〕。LArg经一氧化氮合酶催化生成NO，是体内NO的惟一来源〔14〕。本研究中，给予LArg能升高大鼠体内NO浓度，通过观察AHNP肝损伤中TLR2/4 mRNA表达的变化规律及NO对AHNP肝损伤中TLR2/4 mRNA表达的影响，有助于了解NO和TLR2/4 mRNA表达之间的相互作用及NO对AHNP肝损伤的治疗效果。
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AHNP肠道细菌和内毒素移位是引起AHNP重型化的重要一环。肠道细菌和内毒素移位引起细菌和内毒素入血，首先经门静脉进入肝脏，在肝脏的解毒免疫作用下灭活。但当肝功能受损或进入肝脏的细菌和内毒素量超过肝脏承受能力时，细菌和内毒素就可以进入血液循环造成脓毒症，进一步加重组织损伤。AHNP则可引起肝功能不全，甚至衰竭。所以肝脏在AHNP中可能扮演重要角色。
本实验结果显示：假手术组大鼠肝组织中均有少量TLR2/4 mRNA表达。胰腺炎组3 h时肝组织TLR2/4 mRNA表达开始增高，6~12 h继续升高，于12 h达到峰值；同时肝组织TNFα mRNA表达明显升高，NO明显降低。LArg治疗后，NO显著升高，肝组织TLR2/4 mRNA表达明显下降，肝组织损伤减轻，TNFα mRNA表达明显降低。因此，推测AHNP时肝组织TLR2/4 mTNA表达明显上调，诱导各种促炎症细胞因子过量合成与释放，参与机体失控性炎症反应和多器官功能衰竭；应用LArg后，NO浓度升高，后者可通过调节肝组织内TLR2/4 mRNA的表达而减轻肺损伤。
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NO的抗炎作用机制可能为〔15〕：①降低中性粒细胞和黏附分子的聚集；②降低肺泡灌洗液中炎症因子的浓度；③维持微循环舒缩血管因子平衡，改善微循环；④减少氧自由基损伤，抑制血小板聚集和炎症因子的产生，抑制白细胞、内皮细胞相互作用等。本实验结果显示：胰腺炎组肝组织中的NO显著降低；通过提高大鼠体内NO的浓度，可使肝组织TLR2/4 mRNA表达明显下调，炎症因子合成、释放减少，肝组织损伤减轻。NO对TLR2/4 mRNA表达所具有抑制作用，可能也是NO抗炎作用的一条途径，同时为临床应用NO预防和治疗AHNP肺损伤提供了进一步的依据。
参考文献：1 Li M,Carpio D F,Zheng Y,et al.An essential role of the NFκB/Tolllike receptor pathway in induction of inflammatory and tissuerepair gene expression by necrotic cells〔J〕.J Immunol，2001,166:71287135.
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2 杜微，王红，张淑文，等.全身炎症反应综合征与急性胰腺炎病情严重程度关系的探讨〔J〕.中国危重病急救医学，2005，17：279281.
3 谷俊朝，王宇，高东宸，等.抗生素腹腔灌洗治疗急性出血坏死性胰腺炎效果的观察〔J〕.中国危重病急救医学，2000，12：410 412.
4 Frantz S,Kelly R A,Bourcier T.Role of TLR2 in the activation of NFkappaB by oxidative stress in the cardiac myocytes〔J〕.J Biol Chem.2001,276:51975203.
5 姚咏明,鄢小建，姚风华，等.严重腹腔感染大鼠组织Toll样受体2/4基因表达及其调节机制〔J〕.中国危重病急救医学，2003，15：646650.
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6 Kiyoshi Takeda,Shizuo Akira.TLR signaling pathways〔J〕.Semin Immun，2004，16：39.
7 Zhang D,Zhang G,Hayden M S,et al.A Tolllike receptor that prevents infection by uropathogenic bacteria〔J〕.Science,2004,303:15221526.
8 万幸，王培训，周联，等.脂多糖刺激前后小鼠肺肝脾组织中Toll样受体基因表达情况〔J〕.中国危重病急救医学，2004，16：73 76.
9 Netea G,Van der Meer J W,Kullerg B J.Tolllike receptors as an escape mechanism from the host defense〔J〕.TRENDS Microbiol，2004,12:484489.
, http://www.100md.com
10 Echchannaoui H,Frei K,Schnell C,et al.Tolllike receptor 2deficient mice are highly susceptible to Streptococcus pneumoniae meningitis because of reduced bacterial clearing and enhanced inflammation〔J〕.J Infect Dis，2002，186：798806.
11 Koedel U,Angele B,Rupprecht T,et al.Tolllike receptor 2 participates in mediation of immune response in experimental pneumococcal meningitis〔J〕.J Immunol，2003，170：438444.
12 Woods J P,Frelinger J A,Warrack G,et al.Mouse genetic locus LPS influences susceptibility to Neisseria meningitidis infection〔J〕.Infect Immun,1988，56：19501955.
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13 Shahin R D,Engberg I,Hagberg L,et al.Neutrophil recruitment and bacterial clearance correlated with LPS responsiveness in local Gramnegative infection〔J〕.J Immunol，1987，138：34753480.
14 李广阔，张肇达，刘续宝，等.左旋精氨酸对急性胰腺炎的作用〔J〕.中华试验外科杂志，1999，16：244248.
15 陈祥建，张启瑜，陈必成，等.早期应用L精氨酸治疗急性出血坏死性胰腺炎的实验研究〔J〕.肝胆胰外科杂志，2002，14：220222
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30200272)
作者单位：430022湖北武汉，华中科技大学同济医学院附属协和医院胰腺外科中心(张磊，吴河水，王琳，郭兴军，王春友，张景辉)；430030湖北武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院儿科(陈燕)；271002山东省新泰市第二人民医院神经内科(陈铭坤)
通讯作者：吴河水，教授，博士研究生导师
作者简介：张磊，男，硕士研究生。, http://www.100md.com
【摘要】 目的 探讨一氧化氮(NO)对于急性出血坏死性胰腺炎(AHNP)时肝脏中Toll样受体2/4(TLR2/4)mRNA表达的影响。方法 采用牛磺胆酸钠(TAC)逆行胰胆管注射制备AHNP肺损伤大鼠模型。动物分为假手术组、胰腺炎组和L精氨酸(LArg)治疗组。假手术组于术后6 h，胰腺炎组和L Arg组分别于术后3、6、12 h取静脉血和肝组织，测定血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、淀粉酶和肝组织NO，逆转录聚合酶链反应(RTPCR)方法检测不同时间点肝组织肿瘤坏死因子α(TNF α)、TLR2/4 mRNA表达变化。结果 与假手术组比较，胰腺炎组大鼠3 h肝组织TLR2/4 mRNA表达开始增高〔(1970±0.362)×10-3,(175000±0111)×10-3比(1.150±0.725)×10-6,(11450±1724)×10-4〕,12 h表达达峰值〔(2.940±0316)×10-3,(2 673000±88.380)×10-3，P均<001〕；血清淀粉酶ALT、AST 3 h后即升高，肝损伤加重，肝组织TNFα mRNA表达升高，NO浓度逐渐降低(P<005或P<001)；给予LArg治疗后，NO浓度升高(P<0.05)，TLR2/4 mRNA表达降低〔3 h:(0351±0153)×10-3,(135.000±22.310)×10-3;6 h:(2.100±0.535)×10-3,(187000±26850)×10-3;12 h:(2620±0.208)×10-3,(1 959.000±270.000)×10-3;P<005或P<0.01〕，血清淀粉酶、ALT、AST均降低，肝损伤减轻，肝组织TNFα mRNA降低(P<0.05或P<0.01)。结论 AHNP时，肝组织内TLR2/4 mRNA表达上调,肝组织损伤加重；NO可以明显抑制AHNP肝组织TLR2/4 mRNA的表达。
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【关键词】 Toll样受体；胰腺炎，坏死性，出血，急性；肝脏；一氧化氮
Effect of nitric oxide on Tolllike receptor 2/4 gene expression in the liver in acute hemorrhagic necrotizing pancreatitis in rats ZHANG Lei, WU Heshui, CHEN Yan, CHEN Mingkun, WANG Lin, GUO Xingjun, WANG Chunyou, ZHANG Jinghui.Affiliated Union Hospital of Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, Hubei, China
Corresponding author: WU Heshui (Email: whs1898@public.wh.hb.cn)
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【Abstract】Objective To investigate the effect of nitric oxide (NO) on Tolllike receptors 2/4 (TLR 2/4) gene expression in the liver in acute hemorrhagic necrotizing pancreatitis (AHNP) in rats. Methods Seventy SD male rats were randomly divided into shamoperated group (n=10), AHNP group (n=30) and Larginine (LArg) treatment group (n=30). Blood samples and liver tissues were obtained at 6 hours in shamoperated group, and 3, 6, 12 hours respectively in AHNP group and LArgtreated group. Alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), amylase in serum, NO in liver tissue were determined. Tumor necrosis factorα(TNFα) and TLR2/4 mRNA expressions in the liver tissue were measured by reverse transcription polymerase chain reaction. Results TLR2/4 mRNA could be detected in the liver with low values in shamoperated group 〔(1.150±0.725)×10-6,(11.450±1.724)×10-4〕, but they were markedly upregulated at 3 hours in AHNP group 〔(1.970±0.362)×10-3,(175.000±0.111)×10-3〕, and peaked at 12 hours 〔(2.940±0.316)×10-3,(2 673.000±88.380)×10-3，all P<0.01〕. At the same time serum levels of amylase, ALT and AST increased, hepatic injuries were aggravated, levels of TNFα mRNA in the liver were increased and levels of NO in the liver were lowered (P<005 or P<001). Treatment with LArg could effectively inhibit TLR2/4 mRNA expression 〔3 h: (0.351±0.153)×10-3,(135000±22310)×10-3;6 h:(2.100±0.535)×10-3,(187000±26850)×10-3;12 h:(2620±0208)×10-3,(1 959.000±270.000)×10-3，P<0.05 or P<0.01〕 and alleviate hepatic injuries. The levels of serum amylase, ALT and AST lowered, and the levels of TNFα mRNA in the liver were lowered and the levels of NO were markly increased (P<0.05 or P<0.01). Conclusion These findings suggest that the expression of TLR2/4 mRNA is increased in the liver in AHNP, and the hepatic injuries are aggravated. NO could markly inhibit TLR2/4 mRNA gene expression in the liver in AHNP.
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【Key words】 Tolllike receptors;acute hemorrhage necrotizinpancreatitis;liver;nitricoxide
急性出血坏死性胰腺炎(AHNP)发病凶险，病死率高，发病早期就可引起心、肺、肾、肝等多个器官功能不全，严重时发展到多器官功能障碍综合征(MODS)，但其具体机制不详。研究提示，多种促炎症细胞因子，如肿瘤坏死因子 α(TNFα)、白细胞介素6(IL6)、诱生型一氧化氮合酶(iNOS)等介导的全身炎症反应综合征(SIRS)可能在其发生中起重要作用〔13〕。近年来发现，刺激激活Toll样受体2/4(TLR2/4)基因表达后，可通过一系列信号转导产生炎症放大效应〔4，5〕，在AHNP发病中起一定作用。本研究中通过观察应用L精氨酸(L Arg)升高AHNP模型大鼠体内一氧化氮(NO)后肝组织TLR2/4 mRNA的表达变化及对肝损伤程度的影响，了解TLR2/4 mRNA在AHNP肝损伤中的作用，以及NO对AHNP肝损伤的治疗效果。
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1 材料与方法1.1 实验动物与分组：雄性SD大鼠70只，购自华中科技大学同济医学院实验动物中心，体重180~200 g，采用随机数字表法分为假手术组(10只)、胰腺炎组(30只)和LArg治疗组(30只)。胰腺炎组和LArg治疗组于术后又分为3、6、12 h 3个时间点，每个时间点10只。
1.2 动物模型制备：实验前大鼠禁食12 h，自由饮水。胰腺炎组采用质量分数为5%的牛磺胆酸钠(TAC,Sigma公司)0.1 ml/100 g逆行胰胆管注射制备动物模型；LArg治疗组在行TAC胰胆管逆行注射后立即经下腔静脉注射LArg(凌飞科技公司，日本)100 mg/kg；假手术组动物开腹翻动肠管后关腹。胰腺炎组和LArg治疗组大鼠于术后3、6和12 h活杀，假手术组于术后6 h活杀,留取静脉血和肝组织标本待测。
1.3 观察指标与方法
1.3.1 血清丙氨酸转氨酶(ALT)及天冬氨酸转氨酶(AST)由全自动生化分析仪测定。
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1.3.2 血清淀粉酶和肝组织NO测定：血清淀粉酶采用碘淀粉比色法测定；NO采用硝酸还原酶比色法测定(试剂盒由南京建成生物工程研究所提供)。
1.3.3 肝组织TNFα mRNA及TLR2/4 mRNA的表达：无菌留取肝组织各约50 mg，以Trizol一步法提取细胞总RNA(Promega公司，香港)。采用荧光实时定量逆转录聚合酶链反应(RTPCR)技术对逆转录扩增产物行定量分析。TLR2引物序列：5′CGCTTCCTGAACTTGTCC3′(正义链),5′GGTTGTCACCTGCTTCCA3′(反义链),扩增片段约为200 bp，荧光探针序列:5′ACTAAGAGGCGGAGCGGA3′；TLR4引物序列：5′ATCATGGCATTGTTCCT TTCCT3′(正义链),5′CTGAGATTCTGATCCATGCATTG3′(反义链),扩增片段约为100 bp，荧光探针序列:5′TCGGTAACGACGGTTGTAG3′；TNFα引物序列：5′CCCGTCGGAACAGGGAACTT3′(正义链),5′GGGTGTCCTTAGGGCA AG3′(反义链),扩增片段约为100 bp，荧光探针序列:5′CGAGGAGGCGAACC ACCAA3′；内参照β肌动蛋白(βactin)引物序列为:5′GAACGGTGAAGGTGACAG3′(正义链),5′TAGAGAGAGTGGGGTGG3′(反义链)，荧光探针序列:5′ACCACAGCACCTGCGGGAT3′。延伸过程中搜集荧光信号，于每次扩增的同时设无cDNA的阴性对照。结果由FTC2000型实时荧光定量PCR仪(上海枫岭生物技术有限公司)自带分析软件进行分析。
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1.4 统计学处理:数据以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS10.0统计软件包对数据进行方差分析、t检验等处理,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 血清淀粉酶、ALT和AST变化(表1):胰腺炎组血清淀粉酶明显高于假手术组(P均<0.01)，且随时间延长而升高，但各时间点之间比较差异无显著性(P均>0.05)。胰腺炎组ALT、AST均明显高于假手术组(P均<0.01)，且随时间延长而升高，各时间点之间比较差异有显著性(P均<0.01)。LArg治疗组血清淀粉酶、ALT和AST明显降低，但仍明显高于假手术组(P<0.05或P<0.01)。
2.2 肝组织NO浓度、TNFα mRNA变化(表2)：胰腺炎组肝组织TNFα mRNA 3 h明显高于假手术组，然后逐渐降低，但仍高于假手术组(P均<0.01)；而NO浓度胰腺炎组明显低于假手术组，并随时间延长而明显降低(P<0.05或P<0.01)。LArg治疗组肝组织NO浓度于3 h和6 h明显高于胰腺炎组相应时间点(P均<0.05)，12 h比较差异无显著性(P>0.05)；TNFα mRNA明显低于胰腺炎组相应时间点(P均<0.01)。
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2.3 肝组织中TLR2/4 mRNA表达变化(表2)：TLR2/4 mRNA在假手术组有少量表达，胰腺炎组较假手术组3 h有明显升高，6~12 h继续升高，12 h达到峰值(P均<0.01)。LArg治疗组较胰腺炎组肝组织TLR2/4 mRNA表达明显降低(P<0.05或P<0.01)。
3 讨论
现在已经发现了10种人体内TLR〔6，7〕。TLRs胞外有富含亮氨酸的结构域(LRR)，而其胞浆区结构和功能与白细胞介素1受体(IL1R)非常相似，因此被共同归为TLR/IL1R超家族。TLRs通过识别保守的细菌结构，即病原相关分子模式(PAMP)，而在天然免疫反应中发挥重要作用。同时TLR与PAMP结合可激活抗原提呈细胞，使之表达多种共刺激分子和细胞因子，从而参与特异性免疫应答的启动。其中TLR2/4在细菌感染中效应最显著〔8〕，TLR2可以识别革兰阳性菌的PAMP，如肽聚糖、脂膜酸等；TLR4可以识别革兰阴性菌和白色念珠菌的PAMP，如脂多糖(LPS)和热休克蛋白(HSP)等，从而在感染的发生、发展中起作用〔9〕。在对TLR2/4基因缺失小鼠的研究中发现，TLR2或TLR4基因缺失会导致机体对病原微生物易感性增强〔1013〕。LArg经一氧化氮合酶催化生成NO，是体内NO的惟一来源〔14〕。本研究中，给予LArg能升高大鼠体内NO浓度，通过观察AHNP肝损伤中TLR2/4 mRNA表达的变化规律及NO对AHNP肝损伤中TLR2/4 mRNA表达的影响，有助于了解NO和TLR2/4 mRNA表达之间的相互作用及NO对AHNP肝损伤的治疗效果。
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AHNP肠道细菌和内毒素移位是引起AHNP重型化的重要一环。肠道细菌和内毒素移位引起细菌和内毒素入血，首先经门静脉进入肝脏，在肝脏的解毒免疫作用下灭活。但当肝功能受损或进入肝脏的细菌和内毒素量超过肝脏承受能力时，细菌和内毒素就可以进入血液循环造成脓毒症，进一步加重组织损伤。AHNP则可引起肝功能不全，甚至衰竭。所以肝脏在AHNP中可能扮演重要角色。
本实验结果显示：假手术组大鼠肝组织中均有少量TLR2/4 mRNA表达。胰腺炎组3 h时肝组织TLR2/4 mRNA表达开始增高，6~12 h继续升高，于12 h达到峰值；同时肝组织TNFα mRNA表达明显升高，NO明显降低。LArg治疗后，NO显著升高，肝组织TLR2/4 mRNA表达明显下降，肝组织损伤减轻，TNFα mRNA表达明显降低。因此，推测AHNP时肝组织TLR2/4 mTNA表达明显上调，诱导各种促炎症细胞因子过量合成与释放，参与机体失控性炎症反应和多器官功能衰竭；应用LArg后，NO浓度升高，后者可通过调节肝组织内TLR2/4 mRNA的表达而减轻肺损伤。
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NO的抗炎作用机制可能为〔15〕：①降低中性粒细胞和黏附分子的聚集；②降低肺泡灌洗液中炎症因子的浓度；③维持微循环舒缩血管因子平衡，改善微循环；④减少氧自由基损伤，抑制血小板聚集和炎症因子的产生，抑制白细胞、内皮细胞相互作用等。本实验结果显示：胰腺炎组肝组织中的NO显著降低；通过提高大鼠体内NO的浓度，可使肝组织TLR2/4 mRNA表达明显下调，炎症因子合成、释放减少，肝组织损伤减轻。NO对TLR2/4 mRNA表达所具有抑制作用，可能也是NO抗炎作用的一条途径，同时为临床应用NO预防和治疗AHNP肺损伤提供了进一步的依据。
参考文献：1 Li M,Carpio D F,Zheng Y,et al.An essential role of the NFκB/Tolllike receptor pathway in induction of inflammatory and tissuerepair gene expression by necrotic cells〔J〕.J Immunol，2001,166:71287135.
, 百拇医药
2 杜微，王红，张淑文，等.全身炎症反应综合征与急性胰腺炎病情严重程度关系的探讨〔J〕.中国危重病急救医学，2005，17：279281.
3 谷俊朝，王宇，高东宸，等.抗生素腹腔灌洗治疗急性出血坏死性胰腺炎效果的观察〔J〕.中国危重病急救医学，2000，12：410 412.
4 Frantz S,Kelly R A,Bourcier T.Role of TLR2 in the activation of NFkappaB by oxidative stress in the cardiac myocytes〔J〕.J Biol Chem.2001,276:51975203.
5 姚咏明,鄢小建，姚风华，等.严重腹腔感染大鼠组织Toll样受体2/4基因表达及其调节机制〔J〕.中国危重病急救医学，2003，15：646650.
, 百拇医药
6 Kiyoshi Takeda,Shizuo Akira.TLR signaling pathways〔J〕.Semin Immun，2004，16：39.
7 Zhang D,Zhang G,Hayden M S,et al.A Tolllike receptor that prevents infection by uropathogenic bacteria〔J〕.Science,2004,303:15221526.
8 万幸，王培训，周联，等.脂多糖刺激前后小鼠肺肝脾组织中Toll样受体基因表达情况〔J〕.中国危重病急救医学，2004，16：73 76.
9 Netea G,Van der Meer J W,Kullerg B J.Tolllike receptors as an escape mechanism from the host defense〔J〕.TRENDS Microbiol，2004,12:484489.
, http://www.100md.com
10 Echchannaoui H,Frei K,Schnell C,et al.Tolllike receptor 2deficient mice are highly susceptible to Streptococcus pneumoniae meningitis because of reduced bacterial clearing and enhanced inflammation〔J〕.J Infect Dis，2002，186：798806.
11 Koedel U,Angele B,Rupprecht T,et al.Tolllike receptor 2 participates in mediation of immune response in experimental pneumococcal meningitis〔J〕.J Immunol，2003，170：438444.
12 Woods J P,Frelinger J A,Warrack G,et al.Mouse genetic locus LPS influences susceptibility to Neisseria meningitidis infection〔J〕.Infect Immun,1988，56：19501955.
, 百拇医药
13 Shahin R D,Engberg I,Hagberg L,et al.Neutrophil recruitment and bacterial clearance correlated with LPS responsiveness in local Gramnegative infection〔J〕.J Immunol，1987，138：34753480.
14 李广阔，张肇达，刘续宝，等.左旋精氨酸对急性胰腺炎的作用〔J〕.中华试验外科杂志，1999，16：244248.
15 陈祥建，张启瑜，陈必成，等.早期应用L精氨酸治疗急性出血坏死性胰腺炎的实验研究〔J〕.肝胆胰外科杂志，2002，14：220222
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30200272)
作者单位：430022湖北武汉，华中科技大学同济医学院附属协和医院胰腺外科中心(张磊，吴河水，王琳，郭兴军，王春友，张景辉)；430030湖北武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院儿科(陈燕)；271002山东省新泰市第二人民医院神经内科(陈铭坤)
通讯作者：吴河水，教授，博士研究生导师
作者简介：张磊，男，硕士研究生。, http://www.100md.com