粉防己碱对脂多糖致大鼠胰腺腺泡细胞损伤的保护作用及其机制研究
张红 李永渝 吴咸中
【摘要】 目的 探讨粉防己碱(Tet)对脂多糖(LPS)诱发大鼠胰腺腺泡细胞损伤的保护作用及其机制。方法 胶原酶法分离雄性SD大鼠胰腺腺泡细胞，预先经Tet(50 μmol/L、100 μmol/L) 处理15 min后,再经LPS (10 mg/L)或正常培养液处理，在0、1、4和10 h采集上清液，检测其中丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)、磷脂酶A2(PLA2)活性；采用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)检测胰腺腺泡细胞存活情况；部分胰腺腺泡细胞经Fluo3/AM荧光探针负载后，于相应时间点采用灌流方式给予Tet或LPS，激光共聚焦显微镜观察单个胰腺腺泡细胞内钙离子浓度(〔Ca2+〕i)。结果 Tet可减轻LPS所致的细胞损伤(P均<005)，抑制LPS诱发的胰腺腺泡细胞 〔Ca2+〕i 升高(P均<005)，降低细胞培养上清液中MDA含量和PLA2活性、增加SOD活性。结论 Tet可能通过抑制钙超载、增强抗氧化能力以及减少胰酶活化，减少LPS所致胰腺腺泡细胞损伤，从而发挥对胰腺腺泡细胞的保护作用。
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【关键词】 粉防己碱；脂多糖；胰腺；腺泡细胞；钙
Study on protective effect of tetrandrine on lipopolysaccharide induced pancreatic acinar cell damage and its mechanism ZHANG Hong， LI Yongyu， WU Xianzhong.Department of Pathophysiology, Shanxi College of Traditional Chinese Medicine, Xianyang 712046, Shanxi, China
【Abstract】Objective To evaluate the protective effect of tetrandrine (Tet) on lipopolysaccharide (LPS) induced pancreatic acinar cell damage and to explore its mechanism. Methods SD male rat′s pancreatic acinar cells were isolated by collagenase digestion and they were pretreated with Tet (50 μmol/L and 100 μmol/L), then exposed to LPS (10 mg/L) or conventional culture medium respectively. At 0, 1, 4, 10 hours after treatment with the agents, cell viability was determined by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT), and the supernatant supernate of cells was collected for determination of the content of malondialdehyde (MDA) and the activity of superoxide dismutase (SOD) and phospholipase A2 (PLA2). Some cells were loaded with Fluo3/AM, and the dynamic change in intracellular Ca2+ (〔Ca2+〕i) in single pancreatic acinar cell was determined by laser scanning confocal microscopy. ResultsTet attenuated LPSinduced cell damage (P<005 and P<001) and inhibited the elevation of cytosolic free calcium of rat pancreatic acinar cells. In the supernatant, Tet pretreatment decreased the content of MDA and the activity of PLA2 and increased the activity of SOD (all P<005). Conclusion Tet attenuates LPSinduced cell damage by blocking 〔Ca2+〕ioverload, inhibiting superoxidative response，decreasing activity of pancreatic enzyme, thus it shows a protective effect on pancreatic acinar cells.
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【Key words】tetrandrine;lipopolysaccharide;pancreas;acinar cells;Ca2+
粉防己碱(tetrandrine,Tet)是中药防己的主要成分，是天然的非特异性钙通道拮抗剂(calcium channel blocker,CCB)。在体实验中发现，Tet可以通过抑制胰酶活化减轻组织过氧化损伤和炎症反应，改善去氧胆酸钠诱发胆源性急性胰腺炎(AP)动物胰腺和肺的病理损伤，降低动物死亡率〔1〕。但Tet是否对胰腺腺泡细胞有直接保护作用及其具体机制尚有待阐明。本实验中采用离体大鼠胰腺腺泡细胞，观察Tet对LPS诱发胰腺腺泡细胞损伤是否具有拮抗作用，并通过生化和激光共聚焦显微镜技术，检测相关指标变化，揭示Tet对LPS诱发胰腺腺泡细胞损伤发挥保护作用的机制。
1 材料与方法1.1 胰腺腺泡细胞分离：雄性SD大鼠，由中科院上海实验动物中心提供(SPF级，合格证号SYXK 20020023)，体重200~250 g，实验前禁食12 h。采用胶原酶法分离大鼠胰腺腺泡细胞〔2〕。将细胞接种于含体积分数为10%牛血清的羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液中孵育，细胞密度为1×108/L,胰腺腺泡细胞纯度>80%，存活率>90%。
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1.2 细胞培养和处理：将胰腺腺泡细胞分别接种于24孔、96 孔和35 cm培养板中，CO2 孵箱中37 ℃孵育4 h后，随机分为对照组(正常培养液)、LPS(10 mg/L)组、LPS+50 μmol/L Tet组和LPS+100 μmol/L Tet组(Tet组先用不同浓度的Tet处理15 min,再给予10 mg/L LPS)。各组胰腺腺泡细胞分别孵育0、1、4和10 h后进行指标检测。
1.3 细胞存活率测定：采用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)定量检测细胞存活情况。细胞活性与吸光度(A)值成正比。细胞存活率采用490 nm处LPS组与对照组(新鲜分离)的A值比值表示，即细胞存活率(%)=ALPS组/A对照组×100%。
1.4 单个胰腺腺泡细胞内钙离子浓度(〔Ca2+〕i)测定：将胰腺腺泡细胞接种于35 cm培养皿中的载玻片上，加入10 μmol/L Fluo3/AM荧光探针负载，将有细胞贴壁的载玻片安装固定于灌流装置上，于灌流管中准备好待测的刺激剂，以1 ml/min的速度灌流，488 nm波长激光激发样品，530 nm检测发射的荧光，用Lasersharp软件收集荧光图像，首先观测100 s静息状态下〔Ca2+〕i水平，然后于相应时间点采用灌流方式给予不同浓度Tet(50 μmol/L和100 μmol/L)、LPS(10 mg/L)或正常培养液，动态观测细胞内荧光图像变化5 min以上。荧光变化的相对值采用Microsoft Excel 2000进行处理分析。〔Ca2+〕i变化以荧光强度的相对变化值表示〔3〕，即荧光强度变化相对值(%)=刺激后胞浆荧光强度变化值(ΔF)/静息状态荧光强度值(F0)×100%。
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1.5 细胞培养上清液中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和磷脂酶A2(PLA2)活性检测：各组胰腺腺泡细胞经刺激剂作用至相应时间后，采集培养上清液，用硫代巴比妥酸法检测MDA含量；邻苯三酚法检测SOD活性；参照文献〔4〕方法测定PLA2活性。
1.6数据收集及统计学处理：实验数据按完全随机对照的要求收集、整理、建立数据库，以均数±标准差(x±s)表示，采用Microsoft Excel 2000软件包，单因素方差分析，P<005为差异有统计学意义。
2 结果2.1 Tet对LPS致胰腺腺泡细胞损伤的保护作用(图1)：随着LPS作用时间的延长，细胞存活率逐渐下降，与对照组同时间点比较差异均有显著性(P均<001)。LPS+50 μmol/L Tet组细胞存活率明显增加，LPS+100 μmol/L Tet组细胞存活率增加更明显，与LPS组同时间点比较差异均有显著性(P<0.05或P<0.01)。
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2.2 Tet对胰腺腺泡细胞钙稳态的影响：基础状态下胰腺腺泡〔Ca2+〕i呈现很小的波动。LPS可引起胞浆〔Ca2+〕i显著增加， 〔Ca2+〕i峰值出现在LPS 10 mg/L刺激后150 s内，此时胞浆荧光强度变化相对值可达(17.64±20.85)%,与对照组(69.89±21.51)%比较差异有显著性(P<0.01)。在正常培养液中加入50 μmol/L和100 μmol/L Tet,对胰腺腺泡细胞胞浆荧光强度无明显影响，但与LPS共孵育的体系中，50 μmol/L和100 μmol/L Tet均可降低胰腺腺泡细胞胞浆荧光强度，荧光强度变化相对值分别为(13943±495)%和(12743±766)%，与LPS组比较，差异均有显著性(P均<0.05)。
2.3 Tet对LPS刺激胰腺腺泡细胞培养上清液中MDA含量的影响(图2)：10 mg/L LPS作用1 h可致胰腺腺泡细胞培养上清液中MDA含量明显增加，且随作用时间延长而进一步增加，与对照组同时间点比较差异均有显著性(P均<0.01)。而LPS+50 μmol/L或100 μmol/L Tet组上清液中MDA含量明显低于LPS组，于4 h和10 h与LPS组同时间点比较差异均有显著性(P<0.05或P<0.01)。
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2.4 Tet对LPS刺激胰腺腺泡细胞培养上清液中SOD活性的影响(图3)：10 mg/L LPS作用后可致胰腺腺泡细胞培养上清液中SOD活性明显下降，与对照组同时间点比较差异均有显著性(P<0.05或P<0.01)。而LPS+50 μmol/L或100 μmol/L Tet组上清液中SOD活性高于LPS组同时间点，差异均有显著性(P<0.05或P<0.01)。
2.5 Tet对LPS刺激胰腺腺泡细胞培养上清液中PLA2活性的影响(图4)：10 mg/L的LPS作用后可导致胰腺腺泡细胞培养上清液中PLA2活性明显增加，与对照组同时间点比较差异均有显著性(P均<0.01)。而LPS+50 μmol/L或100 μmol/L Tet组细胞培养上清液中PLA2活性明显下降，与LPS组同时间点比较差异均有显著性(P均<0.01)。
3 讨论
AP的发病机制错综复杂，有多个病理环节参与。胰腺腺泡细胞钙超载在AP发病机制中的作用日益受到人们的重视〔5，6〕。钙超载不仅是AP的多个发病环节之一，而且作为AP发病机制中的枢纽，通过作用于其他诸个发病环节而促进AP的进程。钙超载与氧自由基、炎症介质、细胞因子的过度生成等也有着密切关系〔7，8〕。我们在本实验中发现，将胰腺腺泡细胞暴露于LPS刺激体系中，最先观察到的变化是刺激后几百秒内即出现的细胞胞浆〔Ca2+〕i增加，这一变化早于它们所引发细胞损伤中的其他病理变化。
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本次实验中采用离体大鼠胰腺腺泡细胞，发现Tet可减轻LPS所致的细胞损伤，对LPS作用下的离体胰腺腺泡细胞有直接保护作用，其机制主要为：①Tet可以抑制LPS诱发的胰腺腺泡〔Ca2+〕i 升高，防止细胞内钙超载发生。LPS既可以引起细胞内贮钙的释放，又可以引起胞外钙内流，导致胰腺腺泡胞浆内钙超载〔9〕。Tet作为一种天然的非特异性CCB,能阻滞质膜电压或受体依赖性钙通道，抑制细胞外钙内流和细胞内钙动员〔10〕，所以抑制LPS诱发胰腺腺泡〔Ca2+〕i升高，从而防止钙超载发生，维持胰腺腺泡细胞内的钙稳态，有效阻止了由细胞钙稳态失衡引起细胞不可逆性损伤的发生。②Tet可以增加胰腺腺泡细胞培养上清液中SOD活性，降低MDA含量。在LPS作用下，胰腺腺泡细胞培养上清液中SOD活性降低、MDA含量增加。提示此时胰腺腺泡细胞的氧自由基清除系统受损，清除氧自由基能力下降，造成脂质过氧化反应增强。Tet可降低细胞内钙超载，使钙依赖性蛋白水解酶活性降低，黄嘌呤氧化酶生成减少，次黄嘌呤产物氧自由基产生亦降低。另外，减少线粒体内钙超载可以防止刺激剂所引发的SOD生成减少，保持细胞清除自由基的能力〔10〕，减弱细胞脂质过氧化反应，减轻细胞的损伤。③Tet可以降低胰腺腺泡细胞培养上清液中PLA2活性。AP时钙依赖性PLA2活性升高，可能会通过分解细胞膜磷脂，导致胰腺腺泡细胞膜的溶解和破坏，引起细胞损伤，甚至导致肺损伤〔11〕。LPS可增强胰腺腺泡细胞培养上清液中PLA2活性。Tet可能通过阻止胰腺腺泡细胞钙超载而抑制钙依赖性PLA2的活化，减轻其对细胞膜磷脂的水解作用，减少细胞损伤，同时可减少膜磷脂降解产物生成，阻断其所引发胰腺组织的进一步损伤，有效遏制AP的进展〔12，13〕。
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参考文献：
1 张红，李永渝，白君丽，等.汉防己甲素对大鼠急性胰腺炎治疗作用及机制的研究〔J〕.中国中西医结合杂志，2002，22：125127.
2 Kitagawa M,Williams J A,Lisle R C.Amylase release from strptolysin Opermeabilized pancreatic acini〔J〕.Am J Physiol,1990,259:G157164.
3 Wang L Z,Zhang Q Z,Hu X Z.Verapamil,cyproheptadine,and anisodamine antagonized 〔Ca2+〕i elevation induced by TNFα in a single endothelial cell〔J〕.Acta Pharmacol Sin,2001,22:918922.
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4 陈思锋，吴中立.体液和组织匀浆磷脂酶A2的简便快速测定法〔J〕.第二军医大学学报，1989，10：254256.
5 张红，李永渝，吴咸中.核因子κB及钙超载与急性胰腺炎〔J〕.中国危重病急救医学，2004，16：764767.
6 张红，李永渝.急性胰腺炎的发病机制研究进展〔J〕.中国危重病急救医学,2000,12:121125.
7 Hughes C B,El din A B,Kotb M.Calcium channel blockade inhibits release of TNF alpha and improves survival in rat model of pancreatitis〔J〕.Pancreas,1996,13:2229.
8 Weber H,Roesner J P,Nebe B,et al.Increased cytosolic Ca2+ amplifies oxygen radical induced alterations of the ultrastructure and the energy metabolism of isolated rat pancreatitis〔J〕.Digestion,1998,59:175185.
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9 ZHANG Hong,LI Yongyu,WANG Shengnian,et al.Effects of Lipopolysaccharide on calcium homeostasis in isolated rat pancreatic acinar cells〔J〕.Acta Pharmacol Sin,2003,24:790795.
10 王志荣，李定国，陆汉明.粉防己碱药理作用研究进展〔J〕.中国药理学通报,2000,16:488492.
11 张红，李永渝.磷脂酶A2在大鼠急性胰腺炎并发肺损伤中的作用及维拉帕米的治疗效应〔J〕.中国危重病急救医学，2003，15：418421.
12 Pu Q F,Yan L N,Liu X B,et al.Disturbance of calcium homeostasis and PG during the development of acute pancreatitis from edema to necrosis〔J〕.Chin J Exp Surg,1998,15:391392.
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13 Laine V J O,Nyman K M,Peuravouri H J,et al.Lipopolysaccharide incuced apoptosis of rat pancreatic acinar cells〔J〕.Gut,1996,38:747759
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30370643)
作者单位：712046咸阳，陕西中医学院(张红)；200092上海，同济大学医学院(李永渝)；300070天津医科大学(吴咸中)
作者简介：张红，女，医学博士，副教授，主要研究方向为急性胰腺炎发病机制, http://www.100md.com
【摘要】 目的 探讨粉防己碱(Tet)对脂多糖(LPS)诱发大鼠胰腺腺泡细胞损伤的保护作用及其机制。方法 胶原酶法分离雄性SD大鼠胰腺腺泡细胞，预先经Tet(50 μmol/L、100 μmol/L) 处理15 min后,再经LPS (10 mg/L)或正常培养液处理，在0、1、4和10 h采集上清液，检测其中丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)、磷脂酶A2(PLA2)活性；采用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)检测胰腺腺泡细胞存活情况；部分胰腺腺泡细胞经Fluo3/AM荧光探针负载后，于相应时间点采用灌流方式给予Tet或LPS，激光共聚焦显微镜观察单个胰腺腺泡细胞内钙离子浓度(〔Ca2+〕i)。结果 Tet可减轻LPS所致的细胞损伤(P均<005)，抑制LPS诱发的胰腺腺泡细胞 〔Ca2+〕i 升高(P均<005)，降低细胞培养上清液中MDA含量和PLA2活性、增加SOD活性。结论 Tet可能通过抑制钙超载、增强抗氧化能力以及减少胰酶活化，减少LPS所致胰腺腺泡细胞损伤，从而发挥对胰腺腺泡细胞的保护作用。
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【关键词】 粉防己碱；脂多糖；胰腺；腺泡细胞；钙
Study on protective effect of tetrandrine on lipopolysaccharide induced pancreatic acinar cell damage and its mechanism ZHANG Hong， LI Yongyu， WU Xianzhong.Department of Pathophysiology, Shanxi College of Traditional Chinese Medicine, Xianyang 712046, Shanxi, China
【Abstract】Objective To evaluate the protective effect of tetrandrine (Tet) on lipopolysaccharide (LPS) induced pancreatic acinar cell damage and to explore its mechanism. Methods SD male rat′s pancreatic acinar cells were isolated by collagenase digestion and they were pretreated with Tet (50 μmol/L and 100 μmol/L), then exposed to LPS (10 mg/L) or conventional culture medium respectively. At 0, 1, 4, 10 hours after treatment with the agents, cell viability was determined by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT), and the supernatant supernate of cells was collected for determination of the content of malondialdehyde (MDA) and the activity of superoxide dismutase (SOD) and phospholipase A2 (PLA2). Some cells were loaded with Fluo3/AM, and the dynamic change in intracellular Ca2+ (〔Ca2+〕i) in single pancreatic acinar cell was determined by laser scanning confocal microscopy. ResultsTet attenuated LPSinduced cell damage (P<005 and P<001) and inhibited the elevation of cytosolic free calcium of rat pancreatic acinar cells. In the supernatant, Tet pretreatment decreased the content of MDA and the activity of PLA2 and increased the activity of SOD (all P<005). Conclusion Tet attenuates LPSinduced cell damage by blocking 〔Ca2+〕ioverload, inhibiting superoxidative response，decreasing activity of pancreatic enzyme, thus it shows a protective effect on pancreatic acinar cells.
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【Key words】tetrandrine;lipopolysaccharide;pancreas;acinar cells;Ca2+
粉防己碱(tetrandrine,Tet)是中药防己的主要成分，是天然的非特异性钙通道拮抗剂(calcium channel blocker,CCB)。在体实验中发现，Tet可以通过抑制胰酶活化减轻组织过氧化损伤和炎症反应，改善去氧胆酸钠诱发胆源性急性胰腺炎(AP)动物胰腺和肺的病理损伤，降低动物死亡率〔1〕。但Tet是否对胰腺腺泡细胞有直接保护作用及其具体机制尚有待阐明。本实验中采用离体大鼠胰腺腺泡细胞，观察Tet对LPS诱发胰腺腺泡细胞损伤是否具有拮抗作用，并通过生化和激光共聚焦显微镜技术，检测相关指标变化，揭示Tet对LPS诱发胰腺腺泡细胞损伤发挥保护作用的机制。
1 材料与方法1.1 胰腺腺泡细胞分离：雄性SD大鼠，由中科院上海实验动物中心提供(SPF级，合格证号SYXK 20020023)，体重200~250 g，实验前禁食12 h。采用胶原酶法分离大鼠胰腺腺泡细胞〔2〕。将细胞接种于含体积分数为10%牛血清的羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液中孵育，细胞密度为1×108/L,胰腺腺泡细胞纯度>80%，存活率>90%。
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1.2 细胞培养和处理：将胰腺腺泡细胞分别接种于24孔、96 孔和35 cm培养板中，CO2 孵箱中37 ℃孵育4 h后，随机分为对照组(正常培养液)、LPS(10 mg/L)组、LPS+50 μmol/L Tet组和LPS+100 μmol/L Tet组(Tet组先用不同浓度的Tet处理15 min,再给予10 mg/L LPS)。各组胰腺腺泡细胞分别孵育0、1、4和10 h后进行指标检测。
1.3 细胞存活率测定：采用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)定量检测细胞存活情况。细胞活性与吸光度(A)值成正比。细胞存活率采用490 nm处LPS组与对照组(新鲜分离)的A值比值表示，即细胞存活率(%)=ALPS组/A对照组×100%。
1.4 单个胰腺腺泡细胞内钙离子浓度(〔Ca2+〕i)测定：将胰腺腺泡细胞接种于35 cm培养皿中的载玻片上，加入10 μmol/L Fluo3/AM荧光探针负载，将有细胞贴壁的载玻片安装固定于灌流装置上，于灌流管中准备好待测的刺激剂，以1 ml/min的速度灌流，488 nm波长激光激发样品，530 nm检测发射的荧光，用Lasersharp软件收集荧光图像，首先观测100 s静息状态下〔Ca2+〕i水平，然后于相应时间点采用灌流方式给予不同浓度Tet(50 μmol/L和100 μmol/L)、LPS(10 mg/L)或正常培养液，动态观测细胞内荧光图像变化5 min以上。荧光变化的相对值采用Microsoft Excel 2000进行处理分析。〔Ca2+〕i变化以荧光强度的相对变化值表示〔3〕，即荧光强度变化相对值(%)=刺激后胞浆荧光强度变化值(ΔF)/静息状态荧光强度值(F0)×100%。
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1.5 细胞培养上清液中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和磷脂酶A2(PLA2)活性检测：各组胰腺腺泡细胞经刺激剂作用至相应时间后，采集培养上清液，用硫代巴比妥酸法检测MDA含量；邻苯三酚法检测SOD活性；参照文献〔4〕方法测定PLA2活性。
1.6数据收集及统计学处理：实验数据按完全随机对照的要求收集、整理、建立数据库，以均数±标准差(x±s)表示，采用Microsoft Excel 2000软件包，单因素方差分析，P<005为差异有统计学意义。
2 结果2.1 Tet对LPS致胰腺腺泡细胞损伤的保护作用(图1)：随着LPS作用时间的延长，细胞存活率逐渐下降，与对照组同时间点比较差异均有显著性(P均<001)。LPS+50 μmol/L Tet组细胞存活率明显增加，LPS+100 μmol/L Tet组细胞存活率增加更明显，与LPS组同时间点比较差异均有显著性(P<0.05或P<0.01)。
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2.2 Tet对胰腺腺泡细胞钙稳态的影响：基础状态下胰腺腺泡〔Ca2+〕i呈现很小的波动。LPS可引起胞浆〔Ca2+〕i显著增加， 〔Ca2+〕i峰值出现在LPS 10 mg/L刺激后150 s内，此时胞浆荧光强度变化相对值可达(17.64±20.85)%,与对照组(69.89±21.51)%比较差异有显著性(P<0.01)。在正常培养液中加入50 μmol/L和100 μmol/L Tet,对胰腺腺泡细胞胞浆荧光强度无明显影响，但与LPS共孵育的体系中，50 μmol/L和100 μmol/L Tet均可降低胰腺腺泡细胞胞浆荧光强度，荧光强度变化相对值分别为(13943±495)%和(12743±766)%，与LPS组比较，差异均有显著性(P均<0.05)。
2.3 Tet对LPS刺激胰腺腺泡细胞培养上清液中MDA含量的影响(图2)：10 mg/L LPS作用1 h可致胰腺腺泡细胞培养上清液中MDA含量明显增加，且随作用时间延长而进一步增加，与对照组同时间点比较差异均有显著性(P均<0.01)。而LPS+50 μmol/L或100 μmol/L Tet组上清液中MDA含量明显低于LPS组，于4 h和10 h与LPS组同时间点比较差异均有显著性(P<0.05或P<0.01)。
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2.4 Tet对LPS刺激胰腺腺泡细胞培养上清液中SOD活性的影响(图3)：10 mg/L LPS作用后可致胰腺腺泡细胞培养上清液中SOD活性明显下降，与对照组同时间点比较差异均有显著性(P<0.05或P<0.01)。而LPS+50 μmol/L或100 μmol/L Tet组上清液中SOD活性高于LPS组同时间点，差异均有显著性(P<0.05或P<0.01)。
2.5 Tet对LPS刺激胰腺腺泡细胞培养上清液中PLA2活性的影响(图4)：10 mg/L的LPS作用后可导致胰腺腺泡细胞培养上清液中PLA2活性明显增加，与对照组同时间点比较差异均有显著性(P均<0.01)。而LPS+50 μmol/L或100 μmol/L Tet组细胞培养上清液中PLA2活性明显下降，与LPS组同时间点比较差异均有显著性(P均<0.01)。
3 讨论
AP的发病机制错综复杂，有多个病理环节参与。胰腺腺泡细胞钙超载在AP发病机制中的作用日益受到人们的重视〔5，6〕。钙超载不仅是AP的多个发病环节之一，而且作为AP发病机制中的枢纽，通过作用于其他诸个发病环节而促进AP的进程。钙超载与氧自由基、炎症介质、细胞因子的过度生成等也有着密切关系〔7，8〕。我们在本实验中发现，将胰腺腺泡细胞暴露于LPS刺激体系中，最先观察到的变化是刺激后几百秒内即出现的细胞胞浆〔Ca2+〕i增加，这一变化早于它们所引发细胞损伤中的其他病理变化。
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本次实验中采用离体大鼠胰腺腺泡细胞，发现Tet可减轻LPS所致的细胞损伤，对LPS作用下的离体胰腺腺泡细胞有直接保护作用，其机制主要为：①Tet可以抑制LPS诱发的胰腺腺泡〔Ca2+〕i 升高，防止细胞内钙超载发生。LPS既可以引起细胞内贮钙的释放，又可以引起胞外钙内流，导致胰腺腺泡胞浆内钙超载〔9〕。Tet作为一种天然的非特异性CCB,能阻滞质膜电压或受体依赖性钙通道，抑制细胞外钙内流和细胞内钙动员〔10〕，所以抑制LPS诱发胰腺腺泡〔Ca2+〕i升高，从而防止钙超载发生，维持胰腺腺泡细胞内的钙稳态，有效阻止了由细胞钙稳态失衡引起细胞不可逆性损伤的发生。②Tet可以增加胰腺腺泡细胞培养上清液中SOD活性，降低MDA含量。在LPS作用下，胰腺腺泡细胞培养上清液中SOD活性降低、MDA含量增加。提示此时胰腺腺泡细胞的氧自由基清除系统受损，清除氧自由基能力下降，造成脂质过氧化反应增强。Tet可降低细胞内钙超载，使钙依赖性蛋白水解酶活性降低，黄嘌呤氧化酶生成减少，次黄嘌呤产物氧自由基产生亦降低。另外，减少线粒体内钙超载可以防止刺激剂所引发的SOD生成减少，保持细胞清除自由基的能力〔10〕，减弱细胞脂质过氧化反应，减轻细胞的损伤。③Tet可以降低胰腺腺泡细胞培养上清液中PLA2活性。AP时钙依赖性PLA2活性升高，可能会通过分解细胞膜磷脂，导致胰腺腺泡细胞膜的溶解和破坏，引起细胞损伤，甚至导致肺损伤〔11〕。LPS可增强胰腺腺泡细胞培养上清液中PLA2活性。Tet可能通过阻止胰腺腺泡细胞钙超载而抑制钙依赖性PLA2的活化，减轻其对细胞膜磷脂的水解作用，减少细胞损伤，同时可减少膜磷脂降解产物生成，阻断其所引发胰腺组织的进一步损伤，有效遏制AP的进展〔12，13〕。
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参考文献：
1 张红，李永渝，白君丽，等.汉防己甲素对大鼠急性胰腺炎治疗作用及机制的研究〔J〕.中国中西医结合杂志，2002，22：125127.
2 Kitagawa M,Williams J A,Lisle R C.Amylase release from strptolysin Opermeabilized pancreatic acini〔J〕.Am J Physiol,1990,259:G157164.
3 Wang L Z,Zhang Q Z,Hu X Z.Verapamil,cyproheptadine,and anisodamine antagonized 〔Ca2+〕i elevation induced by TNFα in a single endothelial cell〔J〕.Acta Pharmacol Sin,2001,22:918922.
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4 陈思锋，吴中立.体液和组织匀浆磷脂酶A2的简便快速测定法〔J〕.第二军医大学学报，1989，10：254256.
5 张红，李永渝，吴咸中.核因子κB及钙超载与急性胰腺炎〔J〕.中国危重病急救医学，2004，16：764767.
6 张红，李永渝.急性胰腺炎的发病机制研究进展〔J〕.中国危重病急救医学,2000,12:121125.
7 Hughes C B,El din A B,Kotb M.Calcium channel blockade inhibits release of TNF alpha and improves survival in rat model of pancreatitis〔J〕.Pancreas,1996,13:2229.
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(30370643)
作者单位：712046咸阳，陕西中医学院(张红)；200092上海，同济大学医学院(李永渝)；300070天津医科大学(吴咸中)
作者简介：张红，女，医学博士，副教授，主要研究方向为急性胰腺炎发病机制, http://www.100md.com