1 材料与方法
1.1 仪器
ADVANTEC培养箱CI410，TOMY蒸汽高压灭菌仪BS245，TOMY高速冷冻小型离心机MX100，ASTEC PCR仪，OLYMPUS显微镜。
1.2 试剂
壬基酚(NP)，购自日本和晃公司。
1.3 实验动物及染毒方法
实验中所有遗传学雌性日本比目鱼是用遗传学雌性和表型雄性比目鱼人工交配得来的[5]。幼鱼孵化后饲养在18℃低水温中直到染毒开始时为止。NP染毒方法是将NP按 100μg/g饲料的比例拌入人工饲料，在27℃水温下于幼鱼性分化时期喂食NP，即从鱼卵孵化后第30天到第100天对其染毒。另设18℃水温组、27℃水温组和1μg/g雌二醇
(E2)阳性组。
1.4性别判断
将比目鱼生殖腺固定于Bouin’s溶液里，置于4℃过夜，用乙醇脱水和石蜡包埋，连续切片5 μm厚，最后H.E.染色，镜检。表型性别的判断是通过对它们生殖腺的组织学观察来决定的[6]。
1.5 原位杂交法检测基因的表达
在RNA酶灭活条件下，将第100天的青年期小鱼的组织切片用1μg/mL的蛋白酶K磷酸缓冲液处理5 min，室温下，加入2 mg/mL氨基乙酸终止此反应5 min。组织玻片在磷酸缓冲液中漂洗2次后，用4%多聚甲醛磷酸缓冲液固定10 min，再漂洗2次后，组织切片与1μg/mL DIG标记的反义RNA探针杂交，此探针包含日本比目鱼P450arom和MIS的cDNA[7]。在DIG Easy Hyb溶液中于55℃反应。杂交后的组织切片在50%甲酰胺溶液中漂洗2次，每次30 min。再用RNase A 于37℃下反应30 min，使用DIG核酸检测试剂盒(罗氏公司)测试mRNA的表达信号。
1.6 RT-PCR法检测基因的表达
总RNA是通过ISOGEN从第100天的青年期比目鱼的生殖腺中提取的：生殖腺在100 μL ISOGEN中被均质化，在均质液中加入20 μL氯仿，螺旋振荡5s，15000转/min离心15 min，移去上清液，转入新离心管内，加40 μL异丙醇，15000转/min离心30 min。移去上清液后
1.1 仪器
ADVANTEC培养箱CI410，TOMY蒸汽高压灭菌仪BS245，TOMY高速冷冻小型离心机MX100，ASTEC PCR仪，OLYMPUS显微镜。
1.2 试剂
壬基酚(NP)，购自日本和晃公司。
1.3 实验动物及染毒方法
实验中所有遗传学雌性日本比目鱼是用遗传学雌性和表型雄性比目鱼人工交配得来的[5]。幼鱼孵化后饲养在18℃低水温中直到染毒开始时为止。NP染毒方法是将NP按 100μg/g饲料的比例拌入人工饲料，在27℃水温下于幼鱼性分化时期喂食NP，即从鱼卵孵化后第30天到第100天对其染毒。另设18℃水温组、27℃水温组和1μg/g雌二醇
(E2)阳性组。
1.4性别判断
将比目鱼生殖腺固定于Bouin’s溶液里，置于4℃过夜，用乙醇脱水和石蜡包埋，连续切片5 μm厚，最后H.E.染色，镜检。表型性别的判断是通过对它们生殖腺的组织学观察来决定的[6]。
1.5 原位杂交法检测基因的表达
在RNA酶灭活条件下，将第100天的青年期小鱼的组织切片用1μg/mL的蛋白酶K磷酸缓冲液处理5 min，室温下，加入2 mg/mL氨基乙酸终止此反应5 min。组织玻片在磷酸缓冲液中漂洗2次后，用4%多聚甲醛磷酸缓冲液固定10 min，再漂洗2次后，组织切片与1μg/mL DIG标记的反义RNA探针杂交，此探针包含日本比目鱼P450arom和MIS的cDNA[7]。在DIG Easy Hyb溶液中于55℃反应。杂交后的组织切片在50%甲酰胺溶液中漂洗2次，每次30 min。再用RNase A 于37℃下反应30 min，使用DIG核酸检测试剂盒(罗氏公司)测试mRNA的表达信号。
1.6 RT-PCR法检测基因的表达
总RNA是通过ISOGEN从第100天的青年期比目鱼的生殖腺中提取的：生殖腺在100 μL ISOGEN中被均质化，在均质液中加入20 μL氯仿，螺旋振荡5s，15000转/min离心15 min，移去上清液，转入新离心管内，加40 μL异丙醇，15000转/min离心30 min。移去上清液后