中药注射剂长期毒性试验研究问题探讨
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2006年10月5日
马仁强1 王红星2 陈健文1
(1 中山大学药学院广州 510089 ) (2 四川省医学科学院实验动物研究所成都 610212)
摘要:近年来中药注射剂临床应用中不良反应的增加，引起人们对中药注射剂安全性的重视，中药新药研究技术要求对中药注射剂毒理学研究提出了严格的要求。本文提出中药注射剂长期毒性试验研究中常见问题——溶血性、刺激性、过敏反应等制剂安全性问题对毒理学试验研究的影响，长期毒性试验剂量与用药周期的设计、给药方法及对实验结果分析方面的问题，提出一些看法供同行们共同探讨。
关键词 中药注射剂 长期毒性 制剂安全性
随着中药现代化的进程、中药新剂型的研究逐年增加，中药注射剂的注册申请数目逐年增加，1998-2000年8个，而2001-2003年上升到60个。《中药新药研究技术要求》和新的《药品注册管理办法》的实施，对中药注射剂提出了新的毒理学要求；研究单位与委托单位的目的不完全一致或沟通不够等种种原因，致使中药注射剂的毒理学研究常常出现诸多问题。笔者就五年来所进行的实验体会和审阅过的数十个毒理学资料中存在的问题提出来与同行们共同探讨。
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一、中药注射剂制剂安全性的问题
中药注射剂不同于一般口服制剂，首先是要满足注射剂安全性的要求，对新药临床研究用药样品都要求进行全面的制剂安全性试验，但对用于毒理学研究样品往往没有进行相应的研究，或仅对溶血、热原关注较多。中药制剂毒性相对较小，长期毒性试验剂量往往可达临床用药剂量的几十倍，甚至百倍以上。而如此高的剂量，因限于给药体积，增加药物浓度成了提高剂量的常用方法。药物浓度的增加，可引起注射剂性质的改变，如渗透压、pH值、刺激性、溶血性等改变，对于溶解性差需采用助溶剂的药物更为明显。这些改变导致毒理学样品本身已不完全符合注射液的要求，如就此样品进行长期毒性研究往往出现各种问题。
1.溶血作用对临床用药样品必须进行溶血性试验，符合要求者方可应用于临床。毒理学用药样品因浓度增加易出现溶血反应，如未进行本项研究而直接进行长毒试验研究，很可能因溶血而致动物死亡。在犬静脉注射或大鼠腹腔注射预试验中对溶血作用较弱的受试药物，短时间内不易观察到溶血反应的影响，但在长期用药后势必引起体重下降、精神萎糜、RBC、HGB的降低、T-bil的升高等毒性反应。因此，对含有具有溶血作用的吐温、PEG-400等助溶剂，皂苷或其他可能引起溶血的成份者，应进行多个稀释度的溶血试验，以确证没有溶血作用的浓度。如确实需要提高药物剂量，在犬静脉给药时可考虑采用具有细胞膜稳定作用的葡萄糖注射液作为溶剂，或增加给药体积，同时控制给药速度。笔者进行过一枝黄花注射液的急性毒性预试，给小鼠iv 0.1ml/10g体重的2.0g生药/ml的受试验物(20g/kg)，给药后四小时内除活动减少外，未见其它异常改变，次日10只小鼠全部死亡。进行溶血试验后表明本2.0g生药/ml一枝黄花注射液有明显溶血作用，1.0g生药/ml有轻度溶血作用。再次采用1.0g生药/ml，给小鼠iv0.2ml/10g体重(20g/kg)，结果仅有30%动物出现死亡。因溶血作用，对于同是20g/kg的给药剂量，只因药物浓度的不同，结果可存在很大的差别。
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2.刺激性对于样品中存在皂苷、挥发油、具有刺激性的助溶剂等成份，在浓度增加时势必增加刺激性。具有刺激性的受试药物，长毒试验采用肌肉注射易出现肌肉组织变性、坏死，特别是用药周期较长者；对于一些大鼠腹腔注射中出现扭体反应或犬静脉注射处出现红肿的样品，在长毒试验中均要注意刺激性对最后试验结果的影响。具有刺激性的受试药物对大鼠的腹腔注射影响大于犬的静脉注射和滴注，原因是药物在腹腔内停留时间较长，对腹腔内各脏器有影响，长期反复刺激易出现腹腔内的脏器系数增加、腹腔粘膜粘连、甚至脏器变性坏死等病变，还有可能引起非腹腔内脏器炎变。中药注射剂的刺激性对试验结果影响较大，可直接影响到对药物安全性的评价。我们曾做过一个用40%PEG-400做溶剂的难溶性中药注射液的急性毒性试验，试验结果表明溶剂的LD50与含药物样品的LD50极为相近。另进行清开灵冻干粉急性毒性试验时发现给小鼠iv1.82g/ml可见明显的刺激反应，小鼠在给药过程即可死亡，解剖可见肺脏明显充血，进行稀释一倍后反应明显减轻，两倍稀释后未见动物死亡，原因可能是方中高浓度的去胆氧酸和胆酸引起。可见刺激性可明显影响毒理试验结果。对于含有人参、黄芪、三七等含皂苷成份药材或石昌蒲、金银花、柴胡等含有大量挥发油成份药材的受试药物在试验中应注重刺激性问题。我们实验室进行了注射用参麦冻干粉和参芪注射液长期毒性试验，大鼠长毒试验中高、中剂量组肝、脾等脏器系数明显增加，但未见明显病理改变，部分动物出现腹腔内脏器粘连，剂量相关性明显。在犬的静脉注射中未见脏器系数增加，但高、中剂量组犬肾小管出现浊肿、水样变、轻度坏死等病理改变。对具有刺激性的受试药，除考虑药物因素外还应考虑辅料原因，如同辅料有关试验应增加溶剂对照组，同时考虑增加给药体积或一日给药次数来减少药物刺激性对试验结果的评价。
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3.过敏反应在Beagle犬长毒试验中常出现呕吐、流涎、腹泻等消化道反应，部分试验还伴有皮肤潮红，眼睑、耳朵水肿增厚，皮疹等过敏症状，严重者会出现休克和死亡，轻者一般在停药30min-60min后可恢复正常。有上述反应的大部分受试药物在豚鼠全身过敏和大鼠被动皮肤过敏试验中均未表现出过敏反应。经了解这些样品中多数有采用助溶剂，以吐温-80用得最多。为确证助溶剂可否引起过敏反应，我们采用含0.5%的吐温-80的生理盐水注射液给Beagle犬进行滴注，在注射5-6min(滴速30d/min)后即可出现明显的过敏症状，随给药量的增加反应加重，在此停止滴注60min后一般可恢复正常。次日我们给同一批Beagle犬注射不含吐温的生理盐水注射液50ml，未见任何异常反应。第三日再次给于含吐温的生理盐水注射液，又出现上述症状，这肯定了Beagle犬对吐温非常敏感，与文献报道一致[1-2]，这也提示在人群中也会存在敏感个体。在2年以前的多个注射制剂长毒试验时均出现过敏现象，家犬结果相同，地塞米松也无法预防和解除过敏，过量后休克死亡，将助溶剂吐温-80从制剂中去除后，试验全过程中未出现上述过敏反应。我们也曾看见过KM小鼠灌胃吐温-80助溶的试药后，全身水肿发亮。故当出现过敏反应时，则应从药物处方、提取工艺、制剂处方等方面分析可能引起过敏原因。如是药物原因应建议委托者考虑改进工艺解决过敏问题；如是辅料引起异常，除考虑给药浓度因素外，应考虑更改辅料。
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上述三方面问题，在中药注射液长期毒性试验中是经常遇到的问题。因此对毒理学试验用药样品非常有必要进行制剂安全性(免疫毒性)研究，如在试验过程中发现异常者，应及时同样品提供者联系，了解样品的制备情况，分析具体原因。委托方经常会因保密处方或工艺而不愿告诉毒理试验者。提供符合毒理学研究的供试品，这对正确评价药物的安全性很重要。双方应共同考虑原因所在。
二、实验设计与实验过程中常见的问题
各类有关新药研究专著中均有长期毒性试验设计方面的内容，单从文献资料看长期毒性试验方案的设计较简单，实则是个很难的问题，因它不但关系到多方面专业知识，还同实践经验有着很大关系。对于首次进行毒理学研究或经验不足者易照搬书上内容，在测不出LD50时高剂量就设为临床用药的50倍或一味追求毒性剂量，而对药物的本身及将来临床用药的实际情况未加考虑，此类研究方案得出的研究结果不但达不到毒理学研究真正目的，且往往在试验中会出现各种各样的问题。《中药新药研究技术要求》对中药注射剂进行了专项要求；《药品注册管理办法》将中药注射剂单独归为七类，并在说明中强调大小水针、输液及冻干粉之间的剂量改进均纳入新药要求；新的指导原则即将出台等均增加了中药注射剂毒理学研究的难度。在实验设计与实验过程中更应考虑周全，以免投入大量的时间和费用后得出的结果却不能充分反应受试药物的毒性，为临床用药提供毒理学实验依据，而要从头再来。
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1.剂量设计长期毒性试验剂量设计一般原则[3]是高剂量组原则上要求动物产生明显的或严重的毒性反应，低剂量略高于药效学中的有效剂量但应不出现毒性反应，再设一个出现轻度毒性反应的中间剂量。在1993年卫生部药政局颁发的《中药新药研究指南》中对大鼠剂量设计方面的要求有一条是“如果急性毒性试验结果毒性很低，测不出LD50。也未见毒性应者，可设高、低两个剂量组，高剂量组一般为拟用于临床剂量的50倍以上(有因难时，可适当减少剂量)并应高于药效学试验之高剂量。”，对犬也有类似规定。有的研究者怕做出毒性或为了满足委托者的要求，特别是在受试药物价格较高时，就根据这条高剂量仅进行相当于临床用量的50倍，或略高于50倍的剂量(以60倍为高剂量居多)。笔者认为此条规定是基于两方面原因，一方面是对于毒性较小的中药制剂，长毒剂量设计过高没有实际意义；另一方面是一些原三、四类口服制剂中有些药材不经提取直接打粉入药或只是粗提，限于溶解度或给药体积，无法做到较高剂量给药。对于中药注射剂，特别是进行过多次处理，提取有效部位或有效成份的，剂量要达到高于拟用临床剂量的50倍或上百倍多数情况下是可以做到的。对此，长毒试验中高剂量一般以出现明显毒性反应为宜，如药物毒性确实很小，如银杏叶注射剂，高剂量可设为有效剂量的10-15倍。如果高剂量设计较低，即便出现一些轻度毒性反应，也不能为临床用药提供充分的毒理学信息。中药注射液以用于急、重症者为多，且临床适应症较多。临床上对不同症候的疾病用药剂量差别较大，如用于治疗休克的参麦注射液[4-6]临床上对不同原因的休克与休克的不同时期用量相差很大，可以从一次用量20ml至100ml。如在临床前是按20ml进行剂量设计，则不能支持临床的100ml用量。
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不同研究者对剂量设计原则理解不同，另有些研究者为了做出毒性结果，一味增加剂量，高剂量达到临床拟用量的两三百倍，组间剂量比又不大，如高、中、低三个剂量组采用4:2:1进行递减，则低剂量为临床拟用量的四五十倍大有可能。结果三个剂量均出现毒性反应，试验结果难以为临床提供安全用药剂量。无论是剂量过高，还是偏低均不能达到长期毒性试验目的。为了真正达到毒理学试验目的，在剂量设计时，要综合考虑急性毒性试验结果，药物已有的其它研究结果及处方相近药物的临床用药情况，确定合理的用药剂量，长期毒性开始前必须进行预试验。对毒性较大的受试药物，预试验显得尤为重要；对于毒性较小的受试药物高剂量可采用最大给药量或采用药效学同种动物有效剂量的10-15倍进行。低剂量可参照药效学试验，而中剂量可采用高剂量的1/3-1/5或采用高、低剂量的几何均数。也可借鉴于袁伯俊等人[7]归纳的半数致死量法、最大给药量法，等效剂量法等几种方法。
2.用药周期中药新药研究技术要求规定中药注射剂长期毒性用药周期为临床疗程的3-4倍，啮齿类一般不超过6个月，非啮齿类不超过9个月。临床上需反复长期用药者按最长周期进行。对于中药注射剂一般人第一反应是试验进行6个月或9个月难以做到或不可能做到。为减少研究难度往往按较低的要求进行设计，特别是对于一些长疗程的药物，如癌症、肝炎方面的注射剂。笔者认为不能仅根据临床研究方案中的疗程来设计试验周期，如用于治疗冠心病的药物，临床疗程定一般为2周，如仅按三倍周期进行为期6周的试验是达到临床实验用药要求的。而新药上市后临床常会用到3周或更长一些，如复方丹参注射液、香丹注射液、血栓通注射液等，临床用药3周者大有所在。因此，我们认为应结合临床实际应用情况考虑试验周期，如对于中风、胸痹的药物，以进行3个月长毒为宜。笔者见过北京某单位完成一中药抗肿瘤注射液的长期毒性试验，根据研究单位最初提供的临床疗程为一个月而设三个月，但在最后临床方案中是连续用药两个疗程为一个观察期(中药临床研究指导原则规定抗肿瘤治疗药一般疗程不少于两个月)，这样临床试验实际上用药时间是两个月。可见三个月的长期毒性资料不能支持用药两个月的临床试验的。为此，作为一项毒理学研究的方案设计者应结合药物实际情况从多方面考虑长毒用药周期的设计是十分重要的。
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3.给药方法一般进行大鼠尾静脉连续注射给药2个月，在技术上是没有多大问题，时间再长一些较难实施，而肌肉注射又有限于用药体积(0.1-0.2ml/次)，多数采用腹腔注射途径替代，但在具体实验中存着用药体积、给药浓度、每周用药次数，以及不符合临床拟采用滴注用药等问题。研究者为了减少工作量，减小给药体积，缩短单次给药时间，腹腔给药所得结果不能完全代表静脉给药结果。
犬长期静脉滴注给药，长达6个月或更长时间是没有问题的，只要操作熟练，动物顺从性好。笔者近五年来共进行30余个中药注射剂品种的Beagle犬静脉滴注给药试验有一定的体会。正式试验开始的3-7天内，应采用适应性给药，单次给药剂量酌减，当日剂量可不减，逐渐使动物机体适应，给药初期因为动物对受试药敏感，可减弱和减少流涎，呕心，呕吐等过敏反应症状。初次给药掌握好剂量和速度很重要。对于药理作用较强的受试药物，特别是作用于心脑血管的药物，如不注意给药体积和速度，给药后就会出现恶心、呕吐、血压下降、心律失常、大小便失禁，四肢发软或休克等过敏反应症状。笔者曾进行一用于脑出血的注射液长毒试验，第一次预试验时采用2ml/kg进行推注，给药还未进行到一半时，Beagle犬已进入休克状态，心率明显减慢至每80多次、出现早搏，后改为8ml/kg进行滴注，结果未出现异常，同等剂量推注和滴注出现明显不同反应。以笔者实践经验，犬对连续静脉滴注给药很强的适应性，有许多药初期动物有非常明显的毒性反应，随时间延长反尔不明显了，即使体积增加，滴速加快也不明显，一般情况10ml/kg，滴速 30-60滴/min为宜。
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4.检测指标长期毒性试验中一般观察，血液学和血液生化指标，系统解剖和病理学检查，对于非啮齿类动物心电图、尿常规等常规指标检测我们一般不会遗漏。对作用靶器管和注射部分的观察往往易被忽略。笔者曾看过一治疗糖尿病视网膜与神经病变的药物的毒理申报资料，在病理学检查中未进行胰腺、视神经及视网膜的观察。不少注射剂长期毒性资料中没有注射部位的描述或病理结果，其实这部分结果可作为观察连续给药刺激性的数据。除对一些常规指标的检测外，对试验中出现异常的应增加相应指标的测定，以便分析出现异常的真正原因，如对在犬试验中其发现血细胞下降时，应增加骨髓细胞分析。新指导原则将增加检测指标，很有必要，在进行方案设计时应充分理解各项技术要求同时考虑受试药物的作用特点，确定合理的检测指标。
三、对试验结果的分析描述
在一些新药申报资料或毒理学文献报告中可见以简单描述试验结果为多，对出现变化指标未加分析而是留给看资料人自行分析。还有对于体重、进食量、血液检查等变化雌雄动物未分开统计；对发生变化的指标只写有无统计学意义与标明增加还是降低，对于变化原因未做进一步的分析讨论，或是增加一句均在正常范围之内，但并未提供本单位的正常值范围。大体解剖和病理学检查是存在问题最多的地方，目前我国实验动物质量存在一定的不足，特别是一些单位还是采用一级动物进行或二级动物在一级动物房中饲养，在此条件下进行长期注射给药，即使是不给药以也难以保证不出现异常改变，如出现异常改变是否因药物引起未进行详细分析。
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上述结果均不利于委托单位、临床医生和审评人员对药物安全性进行全面客观评价。单从申报资料上难以确定问题所在，具体试验研究人员才能清楚明白问题所在，如一大鼠长毒资料可见中剂量组AST明显高于对照组，但高、低剂量组及其它肝功能指标ALT、ALP等均未见改变，是否可因此得出本品对肝脏有一定毒性呢，如没有进行分析只看申报资料是难以得出结论，因发生溶血也可引起AST升高。另一资料中发现大鼠血糖值四个组差异很大，小的1.05 mmol/L，高的也只是3.25 mmol/L，显然偏低，经了解，是标本没有在取血的当天测定，而是在一般冰箱中放了三十多小时，血糖已发生酵解。因此，如实验中各指标同对照组比较出现明显的改变，应结合实验具体情况，详细分析发生改变的原因并在资料中详加说明，得出明确的结论。
四、结语
长期毒性试验是一个难度大、费时、费力、耗资且复杂的工作，中药注射剂的特殊性更加增大了实验的难度。想成功地完成一项中药注射液长期毒性试验，应充分做好各项准备工作，从试验的目的着手，充分了解新药处方、功能主治，参考多方面文献资料，并结合新药研究技术要求拟定合乎要求的研究方案与计划。从处方药物的毒性出发，结合预试验结果确定恰当的给药剂量与给药方法，严密观察给药过程的各种变化，做好详细记录。严格按《药物非临床研究质量管理规范》要求进行。合理分析实验结果，提供真实性、完整性、可靠性的研究报告。
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参考文献
[1] 钟静芬主编. 表面活性剂在药学中的应用. 北京:人民卫生出版社,1999年,444
[2] 王红星. 用Beagle犬观察中药注射剂过敏反应的体会.中药药理与临床，2002，18(2)：8
[3] 中华人民共和国卫生部药政管理局. 中药新药研究指南. 205-208
[4] 张悦柯，陈宗喜，高明. 参麦注射液用于感染性休克临床作用评价. 中西医结合实用临床急救，1998，5(7)：329
[5] 严首春，闫凌，宁祖军等. 参麦注射液救治过敏性休克的临床研究. 第三军医大学学报，2003，25(13)：1197-1198
[6] 丁培琳. 参麦注射液治疗心律失常及休克279例临床总结. 中国中医急症，1997，6(6)：263-264
[7] 袁伯俊，顾长虹. 新药长期毒性实验的剂量设计. 国外医学药学分册，1997，24(3)：98-99, 百拇医药(马仁强 王红星 陈健文)
(1 中山大学药学院广州 510089 ) (2 四川省医学科学院实验动物研究所成都 610212)
摘要:近年来中药注射剂临床应用中不良反应的增加，引起人们对中药注射剂安全性的重视，中药新药研究技术要求对中药注射剂毒理学研究提出了严格的要求。本文提出中药注射剂长期毒性试验研究中常见问题——溶血性、刺激性、过敏反应等制剂安全性问题对毒理学试验研究的影响，长期毒性试验剂量与用药周期的设计、给药方法及对实验结果分析方面的问题，提出一些看法供同行们共同探讨。
关键词 中药注射剂 长期毒性 制剂安全性
随着中药现代化的进程、中药新剂型的研究逐年增加，中药注射剂的注册申请数目逐年增加，1998-2000年8个，而2001-2003年上升到60个。《中药新药研究技术要求》和新的《药品注册管理办法》的实施，对中药注射剂提出了新的毒理学要求；研究单位与委托单位的目的不完全一致或沟通不够等种种原因，致使中药注射剂的毒理学研究常常出现诸多问题。笔者就五年来所进行的实验体会和审阅过的数十个毒理学资料中存在的问题提出来与同行们共同探讨。
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一、中药注射剂制剂安全性的问题
中药注射剂不同于一般口服制剂，首先是要满足注射剂安全性的要求，对新药临床研究用药样品都要求进行全面的制剂安全性试验，但对用于毒理学研究样品往往没有进行相应的研究，或仅对溶血、热原关注较多。中药制剂毒性相对较小，长期毒性试验剂量往往可达临床用药剂量的几十倍，甚至百倍以上。而如此高的剂量，因限于给药体积，增加药物浓度成了提高剂量的常用方法。药物浓度的增加，可引起注射剂性质的改变，如渗透压、pH值、刺激性、溶血性等改变，对于溶解性差需采用助溶剂的药物更为明显。这些改变导致毒理学样品本身已不完全符合注射液的要求，如就此样品进行长期毒性研究往往出现各种问题。
1.溶血作用对临床用药样品必须进行溶血性试验，符合要求者方可应用于临床。毒理学用药样品因浓度增加易出现溶血反应，如未进行本项研究而直接进行长毒试验研究，很可能因溶血而致动物死亡。在犬静脉注射或大鼠腹腔注射预试验中对溶血作用较弱的受试药物，短时间内不易观察到溶血反应的影响，但在长期用药后势必引起体重下降、精神萎糜、RBC、HGB的降低、T-bil的升高等毒性反应。因此，对含有具有溶血作用的吐温、PEG-400等助溶剂，皂苷或其他可能引起溶血的成份者，应进行多个稀释度的溶血试验，以确证没有溶血作用的浓度。如确实需要提高药物剂量，在犬静脉给药时可考虑采用具有细胞膜稳定作用的葡萄糖注射液作为溶剂，或增加给药体积，同时控制给药速度。笔者进行过一枝黄花注射液的急性毒性预试，给小鼠iv 0.1ml/10g体重的2.0g生药/ml的受试验物(20g/kg)，给药后四小时内除活动减少外，未见其它异常改变，次日10只小鼠全部死亡。进行溶血试验后表明本2.0g生药/ml一枝黄花注射液有明显溶血作用，1.0g生药/ml有轻度溶血作用。再次采用1.0g生药/ml，给小鼠iv0.2ml/10g体重(20g/kg)，结果仅有30%动物出现死亡。因溶血作用，对于同是20g/kg的给药剂量，只因药物浓度的不同，结果可存在很大的差别。
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2.刺激性对于样品中存在皂苷、挥发油、具有刺激性的助溶剂等成份，在浓度增加时势必增加刺激性。具有刺激性的受试药物，长毒试验采用肌肉注射易出现肌肉组织变性、坏死，特别是用药周期较长者；对于一些大鼠腹腔注射中出现扭体反应或犬静脉注射处出现红肿的样品，在长毒试验中均要注意刺激性对最后试验结果的影响。具有刺激性的受试药物对大鼠的腹腔注射影响大于犬的静脉注射和滴注，原因是药物在腹腔内停留时间较长，对腹腔内各脏器有影响，长期反复刺激易出现腹腔内的脏器系数增加、腹腔粘膜粘连、甚至脏器变性坏死等病变，还有可能引起非腹腔内脏器炎变。中药注射剂的刺激性对试验结果影响较大，可直接影响到对药物安全性的评价。我们曾做过一个用40%PEG-400做溶剂的难溶性中药注射液的急性毒性试验，试验结果表明溶剂的LD50与含药物样品的LD50极为相近。另进行清开灵冻干粉急性毒性试验时发现给小鼠iv1.82g/ml可见明显的刺激反应，小鼠在给药过程即可死亡，解剖可见肺脏明显充血，进行稀释一倍后反应明显减轻，两倍稀释后未见动物死亡，原因可能是方中高浓度的去胆氧酸和胆酸引起。可见刺激性可明显影响毒理试验结果。对于含有人参、黄芪、三七等含皂苷成份药材或石昌蒲、金银花、柴胡等含有大量挥发油成份药材的受试药物在试验中应注重刺激性问题。我们实验室进行了注射用参麦冻干粉和参芪注射液长期毒性试验，大鼠长毒试验中高、中剂量组肝、脾等脏器系数明显增加，但未见明显病理改变，部分动物出现腹腔内脏器粘连，剂量相关性明显。在犬的静脉注射中未见脏器系数增加，但高、中剂量组犬肾小管出现浊肿、水样变、轻度坏死等病理改变。对具有刺激性的受试药，除考虑药物因素外还应考虑辅料原因，如同辅料有关试验应增加溶剂对照组，同时考虑增加给药体积或一日给药次数来减少药物刺激性对试验结果的评价。
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3.过敏反应在Beagle犬长毒试验中常出现呕吐、流涎、腹泻等消化道反应，部分试验还伴有皮肤潮红，眼睑、耳朵水肿增厚，皮疹等过敏症状，严重者会出现休克和死亡，轻者一般在停药30min-60min后可恢复正常。有上述反应的大部分受试药物在豚鼠全身过敏和大鼠被动皮肤过敏试验中均未表现出过敏反应。经了解这些样品中多数有采用助溶剂，以吐温-80用得最多。为确证助溶剂可否引起过敏反应，我们采用含0.5%的吐温-80的生理盐水注射液给Beagle犬进行滴注，在注射5-6min(滴速30d/min)后即可出现明显的过敏症状，随给药量的增加反应加重，在此停止滴注60min后一般可恢复正常。次日我们给同一批Beagle犬注射不含吐温的生理盐水注射液50ml，未见任何异常反应。第三日再次给于含吐温的生理盐水注射液，又出现上述症状，这肯定了Beagle犬对吐温非常敏感，与文献报道一致[1-2]，这也提示在人群中也会存在敏感个体。在2年以前的多个注射制剂长毒试验时均出现过敏现象，家犬结果相同，地塞米松也无法预防和解除过敏，过量后休克死亡，将助溶剂吐温-80从制剂中去除后，试验全过程中未出现上述过敏反应。我们也曾看见过KM小鼠灌胃吐温-80助溶的试药后，全身水肿发亮。故当出现过敏反应时，则应从药物处方、提取工艺、制剂处方等方面分析可能引起过敏原因。如是药物原因应建议委托者考虑改进工艺解决过敏问题；如是辅料引起异常，除考虑给药浓度因素外，应考虑更改辅料。
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上述三方面问题，在中药注射液长期毒性试验中是经常遇到的问题。因此对毒理学试验用药样品非常有必要进行制剂安全性(免疫毒性)研究，如在试验过程中发现异常者，应及时同样品提供者联系，了解样品的制备情况，分析具体原因。委托方经常会因保密处方或工艺而不愿告诉毒理试验者。提供符合毒理学研究的供试品，这对正确评价药物的安全性很重要。双方应共同考虑原因所在。
二、实验设计与实验过程中常见的问题
各类有关新药研究专著中均有长期毒性试验设计方面的内容，单从文献资料看长期毒性试验方案的设计较简单，实则是个很难的问题，因它不但关系到多方面专业知识，还同实践经验有着很大关系。对于首次进行毒理学研究或经验不足者易照搬书上内容，在测不出LD50时高剂量就设为临床用药的50倍或一味追求毒性剂量，而对药物的本身及将来临床用药的实际情况未加考虑，此类研究方案得出的研究结果不但达不到毒理学研究真正目的，且往往在试验中会出现各种各样的问题。《中药新药研究技术要求》对中药注射剂进行了专项要求；《药品注册管理办法》将中药注射剂单独归为七类，并在说明中强调大小水针、输液及冻干粉之间的剂量改进均纳入新药要求；新的指导原则即将出台等均增加了中药注射剂毒理学研究的难度。在实验设计与实验过程中更应考虑周全，以免投入大量的时间和费用后得出的结果却不能充分反应受试药物的毒性，为临床用药提供毒理学实验依据，而要从头再来。
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1.剂量设计长期毒性试验剂量设计一般原则[3]是高剂量组原则上要求动物产生明显的或严重的毒性反应，低剂量略高于药效学中的有效剂量但应不出现毒性反应，再设一个出现轻度毒性反应的中间剂量。在1993年卫生部药政局颁发的《中药新药研究指南》中对大鼠剂量设计方面的要求有一条是“如果急性毒性试验结果毒性很低，测不出LD50。也未见毒性应者，可设高、低两个剂量组，高剂量组一般为拟用于临床剂量的50倍以上(有因难时，可适当减少剂量)并应高于药效学试验之高剂量。”，对犬也有类似规定。有的研究者怕做出毒性或为了满足委托者的要求，特别是在受试药物价格较高时，就根据这条高剂量仅进行相当于临床用量的50倍，或略高于50倍的剂量(以60倍为高剂量居多)。笔者认为此条规定是基于两方面原因，一方面是对于毒性较小的中药制剂，长毒剂量设计过高没有实际意义；另一方面是一些原三、四类口服制剂中有些药材不经提取直接打粉入药或只是粗提，限于溶解度或给药体积，无法做到较高剂量给药。对于中药注射剂，特别是进行过多次处理，提取有效部位或有效成份的，剂量要达到高于拟用临床剂量的50倍或上百倍多数情况下是可以做到的。对此，长毒试验中高剂量一般以出现明显毒性反应为宜，如药物毒性确实很小，如银杏叶注射剂，高剂量可设为有效剂量的10-15倍。如果高剂量设计较低，即便出现一些轻度毒性反应，也不能为临床用药提供充分的毒理学信息。中药注射液以用于急、重症者为多，且临床适应症较多。临床上对不同症候的疾病用药剂量差别较大，如用于治疗休克的参麦注射液[4-6]临床上对不同原因的休克与休克的不同时期用量相差很大，可以从一次用量20ml至100ml。如在临床前是按20ml进行剂量设计，则不能支持临床的100ml用量。
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不同研究者对剂量设计原则理解不同，另有些研究者为了做出毒性结果，一味增加剂量，高剂量达到临床拟用量的两三百倍，组间剂量比又不大，如高、中、低三个剂量组采用4:2:1进行递减，则低剂量为临床拟用量的四五十倍大有可能。结果三个剂量均出现毒性反应，试验结果难以为临床提供安全用药剂量。无论是剂量过高，还是偏低均不能达到长期毒性试验目的。为了真正达到毒理学试验目的，在剂量设计时，要综合考虑急性毒性试验结果，药物已有的其它研究结果及处方相近药物的临床用药情况，确定合理的用药剂量，长期毒性开始前必须进行预试验。对毒性较大的受试药物，预试验显得尤为重要；对于毒性较小的受试药物高剂量可采用最大给药量或采用药效学同种动物有效剂量的10-15倍进行。低剂量可参照药效学试验，而中剂量可采用高剂量的1/3-1/5或采用高、低剂量的几何均数。也可借鉴于袁伯俊等人[7]归纳的半数致死量法、最大给药量法，等效剂量法等几种方法。
2.用药周期中药新药研究技术要求规定中药注射剂长期毒性用药周期为临床疗程的3-4倍，啮齿类一般不超过6个月，非啮齿类不超过9个月。临床上需反复长期用药者按最长周期进行。对于中药注射剂一般人第一反应是试验进行6个月或9个月难以做到或不可能做到。为减少研究难度往往按较低的要求进行设计，特别是对于一些长疗程的药物，如癌症、肝炎方面的注射剂。笔者认为不能仅根据临床研究方案中的疗程来设计试验周期，如用于治疗冠心病的药物，临床疗程定一般为2周，如仅按三倍周期进行为期6周的试验是达到临床实验用药要求的。而新药上市后临床常会用到3周或更长一些，如复方丹参注射液、香丹注射液、血栓通注射液等，临床用药3周者大有所在。因此，我们认为应结合临床实际应用情况考虑试验周期，如对于中风、胸痹的药物，以进行3个月长毒为宜。笔者见过北京某单位完成一中药抗肿瘤注射液的长期毒性试验，根据研究单位最初提供的临床疗程为一个月而设三个月，但在最后临床方案中是连续用药两个疗程为一个观察期(中药临床研究指导原则规定抗肿瘤治疗药一般疗程不少于两个月)，这样临床试验实际上用药时间是两个月。可见三个月的长期毒性资料不能支持用药两个月的临床试验的。为此，作为一项毒理学研究的方案设计者应结合药物实际情况从多方面考虑长毒用药周期的设计是十分重要的。
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3.给药方法一般进行大鼠尾静脉连续注射给药2个月，在技术上是没有多大问题，时间再长一些较难实施，而肌肉注射又有限于用药体积(0.1-0.2ml/次)，多数采用腹腔注射途径替代，但在具体实验中存着用药体积、给药浓度、每周用药次数，以及不符合临床拟采用滴注用药等问题。研究者为了减少工作量，减小给药体积，缩短单次给药时间，腹腔给药所得结果不能完全代表静脉给药结果。
犬长期静脉滴注给药，长达6个月或更长时间是没有问题的，只要操作熟练，动物顺从性好。笔者近五年来共进行30余个中药注射剂品种的Beagle犬静脉滴注给药试验有一定的体会。正式试验开始的3-7天内，应采用适应性给药，单次给药剂量酌减，当日剂量可不减，逐渐使动物机体适应，给药初期因为动物对受试药敏感，可减弱和减少流涎，呕心，呕吐等过敏反应症状。初次给药掌握好剂量和速度很重要。对于药理作用较强的受试药物，特别是作用于心脑血管的药物，如不注意给药体积和速度，给药后就会出现恶心、呕吐、血压下降、心律失常、大小便失禁，四肢发软或休克等过敏反应症状。笔者曾进行一用于脑出血的注射液长毒试验，第一次预试验时采用2ml/kg进行推注，给药还未进行到一半时，Beagle犬已进入休克状态，心率明显减慢至每80多次、出现早搏，后改为8ml/kg进行滴注，结果未出现异常，同等剂量推注和滴注出现明显不同反应。以笔者实践经验，犬对连续静脉滴注给药很强的适应性，有许多药初期动物有非常明显的毒性反应，随时间延长反尔不明显了，即使体积增加，滴速加快也不明显，一般情况10ml/kg，滴速 30-60滴/min为宜。
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4.检测指标长期毒性试验中一般观察，血液学和血液生化指标，系统解剖和病理学检查，对于非啮齿类动物心电图、尿常规等常规指标检测我们一般不会遗漏。对作用靶器管和注射部分的观察往往易被忽略。笔者曾看过一治疗糖尿病视网膜与神经病变的药物的毒理申报资料，在病理学检查中未进行胰腺、视神经及视网膜的观察。不少注射剂长期毒性资料中没有注射部位的描述或病理结果，其实这部分结果可作为观察连续给药刺激性的数据。除对一些常规指标的检测外，对试验中出现异常的应增加相应指标的测定，以便分析出现异常的真正原因，如对在犬试验中其发现血细胞下降时，应增加骨髓细胞分析。新指导原则将增加检测指标，很有必要，在进行方案设计时应充分理解各项技术要求同时考虑受试药物的作用特点，确定合理的检测指标。
三、对试验结果的分析描述
在一些新药申报资料或毒理学文献报告中可见以简单描述试验结果为多，对出现变化指标未加分析而是留给看资料人自行分析。还有对于体重、进食量、血液检查等变化雌雄动物未分开统计；对发生变化的指标只写有无统计学意义与标明增加还是降低，对于变化原因未做进一步的分析讨论，或是增加一句均在正常范围之内，但并未提供本单位的正常值范围。大体解剖和病理学检查是存在问题最多的地方，目前我国实验动物质量存在一定的不足，特别是一些单位还是采用一级动物进行或二级动物在一级动物房中饲养，在此条件下进行长期注射给药，即使是不给药以也难以保证不出现异常改变，如出现异常改变是否因药物引起未进行详细分析。
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上述结果均不利于委托单位、临床医生和审评人员对药物安全性进行全面客观评价。单从申报资料上难以确定问题所在，具体试验研究人员才能清楚明白问题所在，如一大鼠长毒资料可见中剂量组AST明显高于对照组，但高、低剂量组及其它肝功能指标ALT、ALP等均未见改变，是否可因此得出本品对肝脏有一定毒性呢，如没有进行分析只看申报资料是难以得出结论，因发生溶血也可引起AST升高。另一资料中发现大鼠血糖值四个组差异很大，小的1.05 mmol/L，高的也只是3.25 mmol/L，显然偏低，经了解，是标本没有在取血的当天测定，而是在一般冰箱中放了三十多小时，血糖已发生酵解。因此，如实验中各指标同对照组比较出现明显的改变，应结合实验具体情况，详细分析发生改变的原因并在资料中详加说明，得出明确的结论。
四、结语
长期毒性试验是一个难度大、费时、费力、耗资且复杂的工作，中药注射剂的特殊性更加增大了实验的难度。想成功地完成一项中药注射液长期毒性试验，应充分做好各项准备工作，从试验的目的着手，充分了解新药处方、功能主治，参考多方面文献资料，并结合新药研究技术要求拟定合乎要求的研究方案与计划。从处方药物的毒性出发，结合预试验结果确定恰当的给药剂量与给药方法，严密观察给药过程的各种变化，做好详细记录。严格按《药物非临床研究质量管理规范》要求进行。合理分析实验结果，提供真实性、完整性、可靠性的研究报告。
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参考文献
[1] 钟静芬主编. 表面活性剂在药学中的应用. 北京:人民卫生出版社,1999年,444
[2] 王红星. 用Beagle犬观察中药注射剂过敏反应的体会.中药药理与临床，2002，18(2)：8
[3] 中华人民共和国卫生部药政管理局. 中药新药研究指南. 205-208
[4] 张悦柯，陈宗喜，高明. 参麦注射液用于感染性休克临床作用评价. 中西医结合实用临床急救，1998，5(7)：329
[5] 严首春，闫凌，宁祖军等. 参麦注射液救治过敏性休克的临床研究. 第三军医大学学报，2003，25(13)：1197-1198
[6] 丁培琳. 参麦注射液治疗心律失常及休克279例临床总结. 中国中医急症，1997，6(6)：263-264
[7] 袁伯俊，顾长虹. 新药长期毒性实验的剂量设计. 国外医学药学分册，1997，24(3)：98-99, 百拇医药(马仁强 王红星 陈健文)