科学家为基因表达实施快速拍照

http://www.100md.com 2006年10月31日 中国科学院网

     有越来越多的证据表明，基因表达的动力学特征较人们先前想象得更为复杂。对哺乳动物细胞中的mRNA表达实施灵敏的快照技术，揭示出了在外部刺激缺乏的情形下基因表达产生的显著的随机时间变化特征。

    活体检测具有很多优势，尤其是当你想了解实时的动态变化时。然而，有时侯要想获得详细的时间变化数据，通过进行极为精确的快照测量要比进行较少精确的活体记录更为容易些。

    来自美国纽约大学和公共卫生研究所的Arjun Raj、Sanjay Tyagi和他们的同事采用这种策略发现了哺乳动物细胞在大型的内在随机型脉冲状转录活动中发生了基因转录现象。在以前的研究中，人们使用绿荧光蛋白法(GFP)和荧光显微镜法，检验了活的细菌或酵母中基因表达的时间动力学特征。这些研究间接证实，转录现象呈脉冲状发生。取而代之的是，MS2的RNA束缚蛋白质的一系列束缚位点能够被添加到某一目标基因上。一种GFP-MS2融合蛋白可以稳定地在细胞中进行表达，目标mRNA水平上的变化可以通过查看GFP定位的改变来进行观测。这项技术为细菌中发生的适度脉冲状转录现象提供了证据。

    但是，这些方法也有缺点。“荧光蛋白存在着问题，它们对实际发生的转录过程并不提供一种很好的指示特征，”Raj评论说。因为GFP非常稳定，它实际上代表着转录水平的一种动态平均值。虽然GFP-MS2束缚方法能提供有关mRNA的实时信息，但它受到高背景值的干扰，也会影响试验的灵敏度。

    Raj及其同事认为，他们能通过放弃活细胞成像法，转而对整体混合的细胞中的mRNA分子进行精确而灵敏的测定，就可以克服上述缺点。他们在报告基因的3'端放置32条重复序列，然后把它们整合到哺乳动物细胞的基因组之中去。接着，他们运用包含有五种荧光团的探针，进行了RNA荧光原位杂交试验(FISH)。结果发现，他们能通过测量荧光显微快照中单个的点，检测到单个的mRNA。Raj设计出了软件，来对这些FISH点进行自动识别并对数据进行分析。

    也许有人会认为，这对于判定基因表达的时间变化并不是非常有用，但是，事实上它的功能相当强大。Raj说：“如果你假定，细胞种群中所有单个细胞的快照点代表着该细胞随时间而出现的实际情形的话，那么你就能从整个种群中推测出单个细胞的行为。”

    他们发现，对于不同细胞来说，FISH快照点变化很大，这表明基因激活呈现了特别不协调的脉冲特征。“活体成像对于这类研究来说，相比来说用途更少，”Raj评论说。“它的主要优点在于，相对于其它方法来说，它能发出更强的信号。”研究者应用统计分析方法，获得了转录脉冲的频率和它们的平均值。

    他们利用这种方法的高灵敏性，来检测一种内源基因的表达，该基因包含有天然重复的序列。由于把不同颜色的荧光团添加到FISH探针上很容易，他们甚至能够把mRNA从多重基因中立即检测出来。

    虽然，在那个能对活细胞中单个mRNA进行可靠检测的圣杯制造出来之前，在这一领域进行方法学上的改进仍有很大的想象空间，但这一研究工作表明，把一些过时的技术和精细分析方法紧密地结合起来进行应用，仍然能够产生很好的效果。

    注：夏雨译自2006年10月号的《自然-方法学》，版权为英国NPG出版集团所有。

    百拇医药网 http://www.100md.com/html/DirDu/2006/10/31/29/02/61.htm