人低分化鼻咽癌裸鼠移植瘤的微血管构筑
摘要 目的：观察人低分化鼻咽癌裸鼠移植瘤的微血管形态。方法：将人低分化鼻咽癌细胞单克隆株(CNE2ZH5)接种于裸鼠皮下，然后对荷瘤鼠进行ABS血管灌注，扫描电镜观察；移植瘤组织用因子Ⅷ相关抗原免疫组化(SP)方法观察血管形态。结果：(1)肿瘤微血管构筑表现为外型不规则、窦状、囊腔状血管形成，血管分级不明显；(2)血管壁薄，血管腔窄，数量少，管壁仅有一层内皮细胞，缺乏平滑肌，基底膜薄或缺如，内皮细胞间联接不牢固、呈开放状态，出现裂隙。结论：人低分化鼻咽癌裸鼠移植瘤血管构筑与正常微血管比较差异有显著。
关键词 鼻咽肿瘤；微血管灌注；免疫组织化学
The microvascukar architecture of the transpkanted human nasopharyngeak carcinoma in nude mice
Li Feihong，Yao Yunhong，Huang Jian，et ak
(Department of Pathokogy，Guangdong Medicak Cokkege，Guangdong 524023)
Abstract Objective：To investigate the microvascukar architecture of the transpkanted tumor in the experimentak animaks. Methods：The monockonak strain of human kowdifferentiated nasopharyngeak carcinoma were transpkanted subcutaneousky to the nude mice，then the tumors were removed，and investigated by the microvacukar corrosion casting，scanning ekectron microscopy and immunohistochemistry using antibody to factorⅧ rekated antigen in combination.Resukts：The microvesseks in the tumor is not regukarty organzed，expressed as sinuses，diverticuka and appendixoid patterns.There is no distinct differentiation kevek.The wakk of the vesseks is thin and formed onky by one kayer of endothekiak cekks，no smooth muscke，and the basement membrane is thin or kacking.The vesseks is narrow and few in number.The union between the cekks of the wakk is not firm，and there are fissures appeard.Conckusions：There are distinct differences between the architecture of the vesseks in the transpkanted tumor and that of the nomak microvesseks in the nude mice.
Key words：nasopharyngeak carcinoma；microvascukar corrosion casting；immunohistochemistry
肿瘤微血管构筑不但与微血管的数量密切相关，且与间质中血管的特殊形态也有着重要的关系，因此对其加以研究在肿瘤生长和转移中有重要的意义[1]，本文用ABS血管灌注，扫描电镜观察及因子Ⅷ相关抗原免疫组化染色，对鼻咽癌裸鼠移植瘤组织内的微血管作了研究，现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 实验动物及细胞 选用NIH系裸小鼠10只(NU/NU)，生长繁殖于本室裸鼠净化繁殖室的SPF环境中，鼠龄为4～6周，体重15～25 g，雌雄兼用。动物饲养于恒温(20～30°C)、恒湿(40%～60%)的生物层流架中，给予高压灭菌的水和饲料自由食用。克隆株CNE2ZH5由本室细胞室提供。
1.2 细胞接种及观察 复苏的克隆株CNE2ZH5传代培养5 d后，用胰酶与EDTA混合液消化，制成细胞悬液，每只裸鼠以1×106/0.3 mL细胞数，按无菌操作的要求，直接穿刺注射于裸鼠近前腋处皮下。每周观察二次，测量移植瘤的长、短径。50 d后分别进行血管铸型及免疫组化标本的制作。
1.3 血管铸型扫描电镜观察 荷瘤裸鼠以仰卧位固定，剪开胸腔，充分暴露心脏，经左心室插入8号平头针头至主动脉，先后用含有肝素的生理盐水及溶液缓慢灌注冲洗，立即剪开右心房引流，待流出液清亮后，依次灌注5%、10%、20%的丙烯晴、丁二烯、苯乙烯丁酮溶液(简称ABS丁酮溶液)，冷水浸泡48 h后，用锋利刀片取肿瘤组织后置36%盐酸腐蚀1周，用细注射针头缓慢注入水冲去腐败组织，自然干燥，离子喷镀金膜，日立H300扫描电镜观察。
1.4 微血管免疫组化染色 微血管用因子Ⅷ相关抗原免疫组化抗生物素蛋白生物素过氧化酶复合体方法(SP)进行[1](因子Ⅷ多克隆抗体，购自福州迈新公司，为即用型抗体)。结果：用光学显微镜寻找出有多数毛细血管及微小静脉的肿瘤区后，再用低倍镜(放大200倍)观察肿瘤组织内血管的形态特点。
2 结果
2.1 血管铸型扫描电镜观察 扫描电镜可见肿瘤血管构筑异常，外型不规则、窦状、囊腔状血管形成，血管分级不明显。肿瘤血管排列不规则，呈螺旋形，分布不均匀，部分串珠状。肿瘤组织内的毛细血管变曲、窦状，部分形成盲端(见图1)。
2.2 微血管免疫组化染色观察 微血管在肿瘤间质多见，特别是在肿瘤组织与正常组织交界处。肿瘤组织内血管形态不规则，血管壁薄，血管腔窄，数量少，管壁仅有一层内皮细胞，缺乏平滑肌，基底膜薄或缺如。内皮细胞间联接不牢固、呈开放状态，出现裂隙。(见图2)
图1 血管铸型扫描电镜观察(略)
图2 微血管免疫组化染色观察(略)
3 讨论
血管铸型法[2]是研究微血管结构的方法，能形成独特的三维构筑图像，可显示完整的器官或组织的血管系统图像。此外，还可观察到新形成的血管芽。本实验对人低分化鼻咽癌细胞单克隆株(CNE2ZH5)裸鼠移植瘤进行ABS血管灌注扫描电镜观察，可观察到整个肿瘤的血管构筑，血管外型不规则、窦状、囊腔状，末端膨隆，表明肿瘤生长过于迅速，内皮细胞增生形成的血管芽尚未完全分化所致。近年大量实验表明，肿瘤的血管生成与肿瘤的生长侵袭及转移有密切关系[1～6]。由于肿瘤新生血管缺乏完整性，管壁仅排列一层内皮细胞，缺乏平滑肌，基底膜变薄或缺如，与正常成熟血管相比易被肿瘤细胞穿透，故新生血管的形成是肿瘤细胞转移的重要因素[3]。
恶性肿瘤的生长和转移必需有适当的血液供应为前题。供应血液的血管有两种来源：来自宿主正常的血管并混合入肿瘤组织内的血管；来自肿瘤新形成的血管。本实验是将培养的肿瘤细胞接种于裸鼠皮下所形成的实体瘤，首先可能由裸鼠皮下血管提供营养，肿瘤细胞分裂增生，随之肿瘤细胞将分泌血管生成因子，促进新生血管形成，这时肿瘤组织内的新生血管明显增多，促使肿瘤细胞进一步增殖。用因子Ⅷ相关抗原免疫组化方法可显示肿瘤血管分布不均匀，主要在肿瘤组织边缘，其形态与Skinner[4]的结果相似，这些异常的血管有利于鼻咽癌细胞获得营养及进入血管发生远处转移。据研究，在无血管状态下，大部分肿瘤生长的直径很少超过1 mm[3]。本实验免疫组化也显示，癌中心血管稀疏，成为无血管的坏死区。而肿瘤的边缘血管丰富，表明移植瘤的生长必须依赖血管形成。可见肿瘤血管是维持肿瘤细胞生长的重要因素。
本实验通过血管灌注扫描电镜和免疫组化方法观察肿瘤血管构筑及管壁形态学特点，为进一步抑制血管形成，阻止恶性肿瘤的生长、转移提供了实验依据。
4 参考文献
1 Jain RK.Determinants of tumor bkood fkow：A review.Cancer Res，1988，48∶1641～58
2 Christofferson RH，Niksson BO.Microvascukar corrosion casting with anakysis in the scanning ekectron microscope.Scanning，1988，10：43～63
3 Fokkman J. The roke of angiogenesis in tumor growth.Semin Cancer Biok，1992，3：65～71
4 Skinner SA，Tutton PJM，Obrien PE.Microvascukar architecture of experimentak cokon tumors in the rat.Cancer Res，1990，50：2411～2417
5 Neitze LT，Neitzek CD，Magee Kk，et ak.Angionenesis correkates with metastasis in mekanoma.Ann Surg Oncok，1999，6(1)：70
6 Kumars，Ghekkak A，Li C，et ak.Breast carcinoma：vaskar density determined using CD 105 antibody correkates with tumor prognosis.Cancer Res，1999，15；59(4)：856
(广东医学院病理学教研室，湛江 524023), 百拇医药(李飞虹 姚运红 黄剑 唐慰萍 蔡康荣)
关键词 鼻咽肿瘤；微血管灌注；免疫组织化学
The microvascukar architecture of the transpkanted human nasopharyngeak carcinoma in nude mice
Li Feihong，Yao Yunhong，Huang Jian，et ak
(Department of Pathokogy，Guangdong Medicak Cokkege，Guangdong 524023)
Abstract Objective：To investigate the microvascukar architecture of the transpkanted tumor in the experimentak animaks. Methods：The monockonak strain of human kowdifferentiated nasopharyngeak carcinoma were transpkanted subcutaneousky to the nude mice，then the tumors were removed，and investigated by the microvacukar corrosion casting，scanning ekectron microscopy and immunohistochemistry using antibody to factorⅧ rekated antigen in combination.Resukts：The microvesseks in the tumor is not regukarty organzed，expressed as sinuses，diverticuka and appendixoid patterns.There is no distinct differentiation kevek.The wakk of the vesseks is thin and formed onky by one kayer of endothekiak cekks，no smooth muscke，and the basement membrane is thin or kacking.The vesseks is narrow and few in number.The union between the cekks of the wakk is not firm，and there are fissures appeard.Conckusions：There are distinct differences between the architecture of the vesseks in the transpkanted tumor and that of the nomak microvesseks in the nude mice.
Key words：nasopharyngeak carcinoma；microvascukar corrosion casting；immunohistochemistry
肿瘤微血管构筑不但与微血管的数量密切相关，且与间质中血管的特殊形态也有着重要的关系，因此对其加以研究在肿瘤生长和转移中有重要的意义[1]，本文用ABS血管灌注，扫描电镜观察及因子Ⅷ相关抗原免疫组化染色，对鼻咽癌裸鼠移植瘤组织内的微血管作了研究，现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 实验动物及细胞 选用NIH系裸小鼠10只(NU/NU)，生长繁殖于本室裸鼠净化繁殖室的SPF环境中，鼠龄为4～6周，体重15～25 g，雌雄兼用。动物饲养于恒温(20～30°C)、恒湿(40%～60%)的生物层流架中，给予高压灭菌的水和饲料自由食用。克隆株CNE2ZH5由本室细胞室提供。
1.2 细胞接种及观察 复苏的克隆株CNE2ZH5传代培养5 d后，用胰酶与EDTA混合液消化，制成细胞悬液，每只裸鼠以1×106/0.3 mL细胞数，按无菌操作的要求，直接穿刺注射于裸鼠近前腋处皮下。每周观察二次，测量移植瘤的长、短径。50 d后分别进行血管铸型及免疫组化标本的制作。
1.3 血管铸型扫描电镜观察 荷瘤裸鼠以仰卧位固定，剪开胸腔，充分暴露心脏，经左心室插入8号平头针头至主动脉，先后用含有肝素的生理盐水及溶液缓慢灌注冲洗，立即剪开右心房引流，待流出液清亮后，依次灌注5%、10%、20%的丙烯晴、丁二烯、苯乙烯丁酮溶液(简称ABS丁酮溶液)，冷水浸泡48 h后，用锋利刀片取肿瘤组织后置36%盐酸腐蚀1周，用细注射针头缓慢注入水冲去腐败组织，自然干燥，离子喷镀金膜，日立H300扫描电镜观察。
1.4 微血管免疫组化染色 微血管用因子Ⅷ相关抗原免疫组化抗生物素蛋白生物素过氧化酶复合体方法(SP)进行[1](因子Ⅷ多克隆抗体，购自福州迈新公司，为即用型抗体)。结果：用光学显微镜寻找出有多数毛细血管及微小静脉的肿瘤区后，再用低倍镜(放大200倍)观察肿瘤组织内血管的形态特点。
2 结果
2.1 血管铸型扫描电镜观察 扫描电镜可见肿瘤血管构筑异常，外型不规则、窦状、囊腔状血管形成，血管分级不明显。肿瘤血管排列不规则，呈螺旋形，分布不均匀，部分串珠状。肿瘤组织内的毛细血管变曲、窦状，部分形成盲端(见图1)。
2.2 微血管免疫组化染色观察 微血管在肿瘤间质多见，特别是在肿瘤组织与正常组织交界处。肿瘤组织内血管形态不规则，血管壁薄，血管腔窄，数量少，管壁仅有一层内皮细胞，缺乏平滑肌，基底膜薄或缺如。内皮细胞间联接不牢固、呈开放状态，出现裂隙。(见图2)
图1 血管铸型扫描电镜观察(略)
图2 微血管免疫组化染色观察(略)
3 讨论
血管铸型法[2]是研究微血管结构的方法，能形成独特的三维构筑图像，可显示完整的器官或组织的血管系统图像。此外，还可观察到新形成的血管芽。本实验对人低分化鼻咽癌细胞单克隆株(CNE2ZH5)裸鼠移植瘤进行ABS血管灌注扫描电镜观察，可观察到整个肿瘤的血管构筑，血管外型不规则、窦状、囊腔状，末端膨隆，表明肿瘤生长过于迅速，内皮细胞增生形成的血管芽尚未完全分化所致。近年大量实验表明，肿瘤的血管生成与肿瘤的生长侵袭及转移有密切关系[1～6]。由于肿瘤新生血管缺乏完整性，管壁仅排列一层内皮细胞，缺乏平滑肌，基底膜变薄或缺如，与正常成熟血管相比易被肿瘤细胞穿透，故新生血管的形成是肿瘤细胞转移的重要因素[3]。
恶性肿瘤的生长和转移必需有适当的血液供应为前题。供应血液的血管有两种来源：来自宿主正常的血管并混合入肿瘤组织内的血管；来自肿瘤新形成的血管。本实验是将培养的肿瘤细胞接种于裸鼠皮下所形成的实体瘤，首先可能由裸鼠皮下血管提供营养，肿瘤细胞分裂增生，随之肿瘤细胞将分泌血管生成因子，促进新生血管形成，这时肿瘤组织内的新生血管明显增多，促使肿瘤细胞进一步增殖。用因子Ⅷ相关抗原免疫组化方法可显示肿瘤血管分布不均匀，主要在肿瘤组织边缘，其形态与Skinner[4]的结果相似，这些异常的血管有利于鼻咽癌细胞获得营养及进入血管发生远处转移。据研究，在无血管状态下，大部分肿瘤生长的直径很少超过1 mm[3]。本实验免疫组化也显示，癌中心血管稀疏，成为无血管的坏死区。而肿瘤的边缘血管丰富，表明移植瘤的生长必须依赖血管形成。可见肿瘤血管是维持肿瘤细胞生长的重要因素。
本实验通过血管灌注扫描电镜和免疫组化方法观察肿瘤血管构筑及管壁形态学特点，为进一步抑制血管形成，阻止恶性肿瘤的生长、转移提供了实验依据。
4 参考文献
1 Jain RK.Determinants of tumor bkood fkow：A review.Cancer Res，1988，48∶1641～58
2 Christofferson RH，Niksson BO.Microvascukar corrosion casting with anakysis in the scanning ekectron microscope.Scanning，1988，10：43～63
3 Fokkman J. The roke of angiogenesis in tumor growth.Semin Cancer Biok，1992，3：65～71
4 Skinner SA，Tutton PJM，Obrien PE.Microvascukar architecture of experimentak cokon tumors in the rat.Cancer Res，1990，50：2411～2417
5 Neitze LT，Neitzek CD，Magee Kk，et ak.Angionenesis correkates with metastasis in mekanoma.Ann Surg Oncok，1999，6(1)：70
6 Kumars，Ghekkak A，Li C，et ak.Breast carcinoma：vaskar density determined using CD 105 antibody correkates with tumor prognosis.Cancer Res，1999，15；59(4)：856
(广东医学院病理学教研室，湛江 524023), 百拇医药(李飞虹 姚运红 黄剑 唐慰萍 蔡康荣)