滋养细胞肿瘤中MMP2，MMP9的表达与预后相关分析
Relationship between expressions of MMP2 and MMP9 in trophoblastic tumor and patients prognosis correlation analysis
WANG LiJuan, YANG XiaoFeng, ZONG Lu, GAO JiYong
Department of Obstetrics and Gynecology, First Affiliated Hospital, Medical College, Xian Jiaotong University, Xian 710061, China
【Abstract】 AIM： To study the relationship between the expressions of matrix metalloproteinase2， matrix metalloproteinase9 (MMP2， MMP9) and the therapeutic outcome in trophoblastic tumor. METHODS： The expressions of MMP2, MMP9 in trophoblastic tumors including 32 invasive hydatidiform moles and 16 choriocarcinomas were detected by immunohistochemical SP method, and the results were analyzed by referring to their clinical features. RESULTS: In highrisk cases and lowrisk cases of choriocarcinoma the positive rates were 100% and 40% respectively. The positive rates of MMP2 and MMP9 expressions in lowrisk cases of choriocarcinoma were significantly lower than those in highrisk cases of choriocarcinoma (P<0.05). In invasive hydatidiform mole groups without chemotherapy and with chemotherapy the positive rates of MMP2 expression were 91% and 46% respectively; the positive rates of MMP2 expression in invasive hydatidiform mole groups with chemotherapy were significantly lower than those without chemotherapy (P<0.05). The expression of MMP9 was not significantly different among the groups. CONCLUSION：The expression of MMP2 was correlated to the neoplastic prognosis, The detection of MMP2 expression may be a valuable marker for evaluating the prognosis of trophoblastic tumor.
【Keywords】 matalloproteinase; trophoblastic neoplasms； immunohistochemical SP method; prognostic
【摘要】 目的：研究滋养细胞肿瘤中基质金属蛋白酶2，基质金属蛋白酶 9(MMP2， MMP9)的表达，探讨MMP2，MMP9与滋养细胞肿瘤间的关系. 方法：用免疫组化SP法检测32例侵蚀性葡萄胎、16例绒毛膜癌组织中MMP2，MMP9的表达情况，并与临床特征相比较. 结果：绒毛膜癌低危组强表达率40%，高危组100%. 绒毛膜癌低危组强表达率明显低于高危组(P<0.05)；侵蚀性葡萄胎中化疗组MMP2阳性表达率46%，未化疗组91%. 侵蚀性葡萄胎中化疗组MMP2阳性表达率明显低于未化疗组(P<0.05)；MMP9强表达率在各组间无统计学意义. 结论：MMP2高表达与肿瘤预后密切相关，MMP2可能作为判断滋养细胞肿瘤患者预后的参考指标.
【关键词】 基质金属蛋白酶;滋养层肿瘤;免疫组化;预后
0引言
妊娠滋养细胞肿瘤的治愈率虽然达到85%~90%[1],但治疗后复发导致预后不良仍是目前妊娠滋养细胞肿瘤的研究热点. 我们以妊娠滋养细胞肿瘤患者为研究对象, 用免疫组化SP法检测MMP2，MMP9在肿瘤组织中的表达情况，结合临床特点分析MMP2，MMP9与妊娠滋养细胞肿瘤预后、复发的关系，为预测滋养细胞肿瘤复发提供参考指标.
1材料和方法
1.1材料
选取1990～2000年于我院行全子宫切除术加化疗治疗的绒癌患者16例、侵蚀性葡萄胎患者32例，以上述患者子宫切除标本为研究对象，根据临床资料分为化疗组与未化疗组. 根据改良FIGO预后评分标准，对所有患者进行预后评分: 小于等于6分为低危组， 大于等于7分为高危组. ②试剂：鼠抗人MMP2，MMP9单克隆抗体购自美国ZYMED公司.
1.2方法
标本经中性40 g/L甲醛固定，常规石蜡包埋，连续切片，采用复诊登记及电话、信件获取随访信息，以手术日期为随访开始时间，200512为随访截止时间. 以复发或因病死亡为随访截止事件，持续无瘤生存或失访视为截尾数据. 治愈标准：各项辅助检查均转阴,提示病灶消失, 血βHCG值连续3次阴性; 复发诊断标准：经规范治疗后获完全缓解，停药随诊3 mo后出现血人绒毛膜促性腺激素水平升高(再次妊娠除外)或影像学检查发现新的转移灶. 采用免疫组化SP法染色，按说明书操作. PBS代替一抗作阴性对照.
1.3结果判断MMP2，MMP9阳性呈黄色、棕黄色或棕褐色染色，定位于胞浆. 100倍光镜下随机观察10个视野，400倍光镜下计数100个肿瘤细胞，根据染色强度及阳性细胞数双评分法进行评分：0分为无色，1分为淡黄色，棕黄色为2分，棕褐色为3分. 阳性细胞所占的百分比评分：阴性为0分，阳性细胞≤29%为1分，30%~69%为2分， 70%~100%为3分. 两者乘积判断其阳性程度：评0分～4分为弱表达，评6～9分为强表达.
统计学处理： 应用SPSS 13.0统计分析软件进行χ2检验或fisher精确概率检验，Kaplanmeier法评估生存率，绘制生存曲线. 对数秩检验(logranktest)对比生存曲线，以P<0.05为有统计学意义.
2结果
2.1MMP2，MMP9在侵蚀性葡萄胎、绒毛膜癌组织中的表达侵蚀性葡萄胎组中，细胞胞浆内MMP2表达多为阳性或强阳性，胞浆着色不均或黄色颗粒布满胞浆，细胞间质着色不均，肌层内血管内皮细胞呈阳性表达，部分平滑肌组织也有表达；绒毛膜癌组胞浆MMP2为强表达，棕褐色颗粒布满胞浆，细胞间质呈强阳性着色(图1).
侵蚀性葡萄胎组中，MMP9表达在胞质内呈阳性，胞质着色均匀或胞浆布满黄色颗粒，细胞间质呈阳性或弱阳性着色，肌壁内血管内皮细胞呈阳性表达(图2). 绒毛膜癌组胞质中多呈弱阳性着色，细胞间质着色不均.
2.2MMP2，MMP9与侵蚀性葡萄胎、绒毛膜癌临床指标的关系侵蚀性葡萄胎中化疗组MMP2阳性表达率明显低于未化疗组(P<0.05)；绒毛膜癌低危组强表达率明显低于高危组(P<0.05)；MMP9强表达率在各组间无统计学意义(表1，2).表1MMP2, MMP9在侵蚀性葡萄胎组织中的表达情况(略)表2MMP2, MMP9在绒毛膜癌组织中的表达情况(略)
2.3MMP2表达与随访结果分析48例患者随访时间为10 d～180 mo，5例失访. MMP2弱表达组1例患者于子宫切除术后10 d死亡，其余随访期间无复发；MMP2强表达组复发5例，2例因复发性绒癌死亡. MMP2强表达与弱表达生存曲线如图3，结果表明，MMP2强表达组无瘤生存率91%，MMP2弱表达组无瘤生存率87%，二者无统计学意义(χ2=0.062， P>0.05)， 可能与样本量小有关.
3讨论
妊娠滋养细胞肿瘤是一种妊娠相关性肿瘤，其恶性度高，虽然可以通过化疗药物治愈，但由于肿瘤耐药、滋养细胞侵袭力强、不规范化疗等因素[2]，仍有复发存在. 国际妇产科联盟(FIGO)从患者年龄、前次妊娠、距前次妊娠时间、治疗前血βHCG值、最大肿瘤直径、转移部位、转移病灶数目、先前失败化疗几方面对滋养细胞肿瘤患者预后评分，预测复发危险度.
基质金属蛋白酶是一类依赖金属离子锌并以细胞外基质为水解底物的蛋白水解酶. 研究显示，滋养细胞侵袭力与MMP2，MMP9相关[3-4]，与MMP2关系更为密切[5]. 两者分泌时限不同，妊娠8 wk内及绒毛膜癌中MMP2起主要调节作用，9~12 wk以MMP9作用更为重要[6]，推测基质金属蛋白酶抑制物TIMP2分泌减少与肿瘤发生可能相关[7].
本研究结果显示化疗有使侵蚀性葡萄胎、绒毛膜癌组织中MMP2表达减弱的趋势，侵蚀性葡萄胎中化疗组MMP2阳性表达率明显低于未化疗组(P<0.05). 滋养细胞恶性程度与MMP2表达呈相同趋势，提示化疗可能通过某种机制抑制MMP2表达. 通过监测MMP2的表达情况，有助于了解滋养细胞肿瘤恶性程度、判断化疗疗效及预后. 对于化疗耐药细胞株，研发新型MMP2抑制剂可能成为新的治疗方向. 本研究显示绒毛膜癌低危组强表达率明显低于高危组(P<0.05)，提示滋养细胞肿瘤高危因素可能与MMP2调节滋养细胞侵袭能力有关， MMP2的高表达，尤其是化疗后高表达与预后不良有关.
本研究中所有患者随访满5 a，高危组复发率16%，低危组复发率4.3%. 侵葡患者观察中无死亡，绒癌死亡率18.8%，复发患者均为MMP2高表达. 用KaplanMeier法对MMP2高表达、低表达组生存分析研究表明MMP2强表达组无瘤生存率(91%)虽高于MMP2弱表达组(87%)，但无统计学意义. 可能与样本量太小有关. 有待扩大样本量进一步研究.
本研究结果表明高表达的MMP2与肿瘤复发相关，MMP2的检测有望作为滋养细胞肿瘤患者预后判断的一个有价值的指标.
【参考文献】
[1]宋鸿钊,杨秀玉,向阳. 滋养细胞肿瘤的诊断和治疗[M].北京:人民卫生出版社，2004,240-247.
[2]杨隽钧，向阳，万希润，等. 妊娠滋养细胞肿瘤复发的相关因素分析和治疗[J]. 中华医学杂志, 2006,86(1):52-55.
[3]Mahameed S, Goldman S, Gabarin D, et al. The effect of serum from women with preeclampsia on JAR (trophoblastlike) cell line[J]. J Soc Gynecol Investig， 2005,12(6):45-50.
[4]Karmakar S, Dhar R. Das CInhibition of cytotrophoblastic (JEG3) cell invasion by interleukin 12 involves an interferon gammamediated pathway[J]. J Biol Chem， 2004,279(53): 297-307.
[5]Isaka K, Usuda S, Ito H, et al. Expression and activity of matrix metalloproteinase 2 and MMP9 in human trophoblasts[J]. Placenta， 2003,(1):53-64.
[6]StaunRam E, Goldman S, Gabarin D, et al. Expression and importance of matrix metalloproteinase 2 and MMP9 (MMP2 and MMP9) in human trophoblast invasion[J]. Reprod Biol Endocrinol， 2004,2:59.
[7]Okamoto T, Niu R, Yamada S, et al. Reduced expression of tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP)2 in gestational trophoblastic diseases[J]. Mol Hum Reprod, 2002,(4):392-398.
西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，陕西 西安 710061, 百拇医药(王利娟，杨筱凤，宗璐，高积勇)
WANG LiJuan, YANG XiaoFeng, ZONG Lu, GAO JiYong
Department of Obstetrics and Gynecology, First Affiliated Hospital, Medical College, Xian Jiaotong University, Xian 710061, China
【Abstract】 AIM： To study the relationship between the expressions of matrix metalloproteinase2， matrix metalloproteinase9 (MMP2， MMP9) and the therapeutic outcome in trophoblastic tumor. METHODS： The expressions of MMP2, MMP9 in trophoblastic tumors including 32 invasive hydatidiform moles and 16 choriocarcinomas were detected by immunohistochemical SP method, and the results were analyzed by referring to their clinical features. RESULTS: In highrisk cases and lowrisk cases of choriocarcinoma the positive rates were 100% and 40% respectively. The positive rates of MMP2 and MMP9 expressions in lowrisk cases of choriocarcinoma were significantly lower than those in highrisk cases of choriocarcinoma (P<0.05). In invasive hydatidiform mole groups without chemotherapy and with chemotherapy the positive rates of MMP2 expression were 91% and 46% respectively; the positive rates of MMP2 expression in invasive hydatidiform mole groups with chemotherapy were significantly lower than those without chemotherapy (P<0.05). The expression of MMP9 was not significantly different among the groups. CONCLUSION：The expression of MMP2 was correlated to the neoplastic prognosis, The detection of MMP2 expression may be a valuable marker for evaluating the prognosis of trophoblastic tumor.
【Keywords】 matalloproteinase; trophoblastic neoplasms； immunohistochemical SP method; prognostic
【摘要】 目的：研究滋养细胞肿瘤中基质金属蛋白酶2，基质金属蛋白酶 9(MMP2， MMP9)的表达，探讨MMP2，MMP9与滋养细胞肿瘤间的关系. 方法：用免疫组化SP法检测32例侵蚀性葡萄胎、16例绒毛膜癌组织中MMP2，MMP9的表达情况，并与临床特征相比较. 结果：绒毛膜癌低危组强表达率40%，高危组100%. 绒毛膜癌低危组强表达率明显低于高危组(P<0.05)；侵蚀性葡萄胎中化疗组MMP2阳性表达率46%，未化疗组91%. 侵蚀性葡萄胎中化疗组MMP2阳性表达率明显低于未化疗组(P<0.05)；MMP9强表达率在各组间无统计学意义. 结论：MMP2高表达与肿瘤预后密切相关，MMP2可能作为判断滋养细胞肿瘤患者预后的参考指标.
【关键词】 基质金属蛋白酶;滋养层肿瘤;免疫组化;预后
0引言
妊娠滋养细胞肿瘤的治愈率虽然达到85%~90%[1],但治疗后复发导致预后不良仍是目前妊娠滋养细胞肿瘤的研究热点. 我们以妊娠滋养细胞肿瘤患者为研究对象, 用免疫组化SP法检测MMP2，MMP9在肿瘤组织中的表达情况，结合临床特点分析MMP2，MMP9与妊娠滋养细胞肿瘤预后、复发的关系，为预测滋养细胞肿瘤复发提供参考指标.
1材料和方法
1.1材料
选取1990～2000年于我院行全子宫切除术加化疗治疗的绒癌患者16例、侵蚀性葡萄胎患者32例，以上述患者子宫切除标本为研究对象，根据临床资料分为化疗组与未化疗组. 根据改良FIGO预后评分标准，对所有患者进行预后评分: 小于等于6分为低危组， 大于等于7分为高危组. ②试剂：鼠抗人MMP2，MMP9单克隆抗体购自美国ZYMED公司.
1.2方法
标本经中性40 g/L甲醛固定，常规石蜡包埋，连续切片，采用复诊登记及电话、信件获取随访信息，以手术日期为随访开始时间，200512为随访截止时间. 以复发或因病死亡为随访截止事件，持续无瘤生存或失访视为截尾数据. 治愈标准：各项辅助检查均转阴,提示病灶消失, 血βHCG值连续3次阴性; 复发诊断标准：经规范治疗后获完全缓解，停药随诊3 mo后出现血人绒毛膜促性腺激素水平升高(再次妊娠除外)或影像学检查发现新的转移灶. 采用免疫组化SP法染色，按说明书操作. PBS代替一抗作阴性对照.
1.3结果判断MMP2，MMP9阳性呈黄色、棕黄色或棕褐色染色，定位于胞浆. 100倍光镜下随机观察10个视野，400倍光镜下计数100个肿瘤细胞，根据染色强度及阳性细胞数双评分法进行评分：0分为无色，1分为淡黄色，棕黄色为2分，棕褐色为3分. 阳性细胞所占的百分比评分：阴性为0分，阳性细胞≤29%为1分，30%~69%为2分， 70%~100%为3分. 两者乘积判断其阳性程度：评0分～4分为弱表达，评6～9分为强表达.
统计学处理： 应用SPSS 13.0统计分析软件进行χ2检验或fisher精确概率检验，Kaplanmeier法评估生存率，绘制生存曲线. 对数秩检验(logranktest)对比生存曲线，以P<0.05为有统计学意义.
2结果
2.1MMP2，MMP9在侵蚀性葡萄胎、绒毛膜癌组织中的表达侵蚀性葡萄胎组中，细胞胞浆内MMP2表达多为阳性或强阳性，胞浆着色不均或黄色颗粒布满胞浆，细胞间质着色不均，肌层内血管内皮细胞呈阳性表达，部分平滑肌组织也有表达；绒毛膜癌组胞浆MMP2为强表达，棕褐色颗粒布满胞浆，细胞间质呈强阳性着色(图1).
侵蚀性葡萄胎组中，MMP9表达在胞质内呈阳性，胞质着色均匀或胞浆布满黄色颗粒，细胞间质呈阳性或弱阳性着色，肌壁内血管内皮细胞呈阳性表达(图2). 绒毛膜癌组胞质中多呈弱阳性着色，细胞间质着色不均.
2.2MMP2，MMP9与侵蚀性葡萄胎、绒毛膜癌临床指标的关系侵蚀性葡萄胎中化疗组MMP2阳性表达率明显低于未化疗组(P<0.05)；绒毛膜癌低危组强表达率明显低于高危组(P<0.05)；MMP9强表达率在各组间无统计学意义(表1，2).表1MMP2, MMP9在侵蚀性葡萄胎组织中的表达情况(略)表2MMP2, MMP9在绒毛膜癌组织中的表达情况(略)
2.3MMP2表达与随访结果分析48例患者随访时间为10 d～180 mo，5例失访. MMP2弱表达组1例患者于子宫切除术后10 d死亡，其余随访期间无复发；MMP2强表达组复发5例，2例因复发性绒癌死亡. MMP2强表达与弱表达生存曲线如图3，结果表明，MMP2强表达组无瘤生存率91%，MMP2弱表达组无瘤生存率87%，二者无统计学意义(χ2=0.062， P>0.05)， 可能与样本量小有关.
3讨论
妊娠滋养细胞肿瘤是一种妊娠相关性肿瘤，其恶性度高，虽然可以通过化疗药物治愈，但由于肿瘤耐药、滋养细胞侵袭力强、不规范化疗等因素[2]，仍有复发存在. 国际妇产科联盟(FIGO)从患者年龄、前次妊娠、距前次妊娠时间、治疗前血βHCG值、最大肿瘤直径、转移部位、转移病灶数目、先前失败化疗几方面对滋养细胞肿瘤患者预后评分，预测复发危险度.
基质金属蛋白酶是一类依赖金属离子锌并以细胞外基质为水解底物的蛋白水解酶. 研究显示，滋养细胞侵袭力与MMP2，MMP9相关[3-4]，与MMP2关系更为密切[5]. 两者分泌时限不同，妊娠8 wk内及绒毛膜癌中MMP2起主要调节作用，9~12 wk以MMP9作用更为重要[6]，推测基质金属蛋白酶抑制物TIMP2分泌减少与肿瘤发生可能相关[7].
本研究结果显示化疗有使侵蚀性葡萄胎、绒毛膜癌组织中MMP2表达减弱的趋势，侵蚀性葡萄胎中化疗组MMP2阳性表达率明显低于未化疗组(P<0.05). 滋养细胞恶性程度与MMP2表达呈相同趋势，提示化疗可能通过某种机制抑制MMP2表达. 通过监测MMP2的表达情况，有助于了解滋养细胞肿瘤恶性程度、判断化疗疗效及预后. 对于化疗耐药细胞株，研发新型MMP2抑制剂可能成为新的治疗方向. 本研究显示绒毛膜癌低危组强表达率明显低于高危组(P<0.05)，提示滋养细胞肿瘤高危因素可能与MMP2调节滋养细胞侵袭能力有关， MMP2的高表达，尤其是化疗后高表达与预后不良有关.
本研究中所有患者随访满5 a，高危组复发率16%，低危组复发率4.3%. 侵葡患者观察中无死亡，绒癌死亡率18.8%，复发患者均为MMP2高表达. 用KaplanMeier法对MMP2高表达、低表达组生存分析研究表明MMP2强表达组无瘤生存率(91%)虽高于MMP2弱表达组(87%)，但无统计学意义. 可能与样本量太小有关. 有待扩大样本量进一步研究.
本研究结果表明高表达的MMP2与肿瘤复发相关，MMP2的检测有望作为滋养细胞肿瘤患者预后判断的一个有价值的指标.
【参考文献】
[1]宋鸿钊,杨秀玉,向阳. 滋养细胞肿瘤的诊断和治疗[M].北京:人民卫生出版社，2004,240-247.
[2]杨隽钧，向阳，万希润，等. 妊娠滋养细胞肿瘤复发的相关因素分析和治疗[J]. 中华医学杂志, 2006,86(1):52-55.
[3]Mahameed S, Goldman S, Gabarin D, et al. The effect of serum from women with preeclampsia on JAR (trophoblastlike) cell line[J]. J Soc Gynecol Investig， 2005,12(6):45-50.
[4]Karmakar S, Dhar R. Das CInhibition of cytotrophoblastic (JEG3) cell invasion by interleukin 12 involves an interferon gammamediated pathway[J]. J Biol Chem， 2004,279(53): 297-307.
[5]Isaka K, Usuda S, Ito H, et al. Expression and activity of matrix metalloproteinase 2 and MMP9 in human trophoblasts[J]. Placenta， 2003,(1):53-64.
[6]StaunRam E, Goldman S, Gabarin D, et al. Expression and importance of matrix metalloproteinase 2 and MMP9 (MMP2 and MMP9) in human trophoblast invasion[J]. Reprod Biol Endocrinol， 2004,2:59.
[7]Okamoto T, Niu R, Yamada S, et al. Reduced expression of tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP)2 in gestational trophoblastic diseases[J]. Mol Hum Reprod, 2002,(4):392-398.
西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，陕西 西安 710061, 百拇医药(王利娟，杨筱凤，宗璐，高积勇)