肝癌细胞_细胞收集_蛋白提取_二维差异凝胶电泳

肝癌细胞蛋白差异凝胶电泳技术系统评估方法

http://www.100md.com 《分析化学》(新) 2006年第11期

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     摘要利用二维差异凝胶电泳技术(twodimensional differential ingel electrophoresis, 2DDIGE)研究肝癌细胞与正常细胞的差异时应先对其蛋白样品进行标记系统评估，以确保正式实验的成功。在细胞水平上展开蛋白质组研究应尽可能提取到细胞的所有蛋白，为此本研究先比较了机械刮除法、胰酶消化法和PBSE消化法收获肝癌细胞后的细胞形态与蛋白得率，结果显示PBSE消化法收集肝癌细胞时细胞形态完整，提取的蛋白得率最高。然后将提取的细胞蛋白经DIGETM试剂盒的3重荧光(Cy2、Cy3、Cy5)标记后再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)和双向电泳(2DE， twodimensional electrophoresis)。前者图像使用ImageQuant软件进行分析，结果说明肝癌细胞蛋白提取液与该染料能相互兼容，样品得到了有效的标记。2DE的扫描图像使用DeCyder 5.0软件的胶内分析(differential ingel analysis，DIA)和胶间分析(biological variation analysis，BVA)模式，结果表明，Cy3和Cy5标记的蛋白质定量结果基本一致，但该染料标记肝癌细胞蛋白后会造成极少量蛋白出现位置偏差，给蛋白定量带来一定的误差影响，而BVA中的反标策略能够有效纠正这种由于不同荧光标记带来的定量误差。总之，本研究首次报道了用同一肝癌样品进行不同荧光标记后进行2DE的评估方法，该方法支持了DIGE体系定量的可靠性，而且能给出定量的误差范围，完善了评估体系，为DIGE技术平台的质量控制提供了参考。

    关键词肝癌细胞,细胞收集,蛋白提取,二维差异凝胶电泳,系统评估

     1 引言

    随着后基因组时代的来临，蛋白质组学技术被广泛应用于整体水平上的复杂蛋白样品中，如白血病[1]、胰腺癌[2]、前列腺癌[3]、乳腺癌 [4]等，并鉴定了一批肿瘤相关蛋白。该技术在肝癌方面也开展了一系列研究，为肝癌的早期诊断、药靶的发现、疗效判断和预后提供了重要依据[5，6]。目前，二维凝胶电泳质谱(2DEMS)仍是蛋白质组研究中的经典技术路线，技术的不断改进，提高了效率。更重要的是提高了重现性，避免了手工操作易产生的污染。但2DE仍存在一定的局限性，如对极端分子量、极酸、极碱性蛋白质的歧视效应。在此基础上发展了稳定同位素标记技术及荧光标记技术，如Stable isotope labeling with amino acide in cell culture(SILAC)[7]、ITRAQ[8]、Isotop coded affinity tages(ICAT)[9]和differential ingel electrophoresis(DIGE)[10] ......

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