溶胶凝胶膜包埋的胰蛋白酶用于高通量蛋白质肽谱分析
溶胶凝胶膜,,溶胶凝胶，固定化胰蛋白酶，蛋白质酶解，肽谱分析,1引言,2实验部分,3结果与讨论,References
摘要 采用溶胶凝胶包埋法在96孔板中固定胰蛋白酶，制备高通量的酶解反应器。考察了四乙氧基硅烷(TEOS)与甲基三甲氧基硅烷(MTMS)的不同比例对凝胶膜的成胶速度、机械强度、透明度、固定酶的活性及稳定性的影响。以牛血清白蛋白(BSA)为目标蛋白,比较了溶胶凝胶固定化酶与溶液态酶的稳定性和催化活性，用HPLC对BSA的酶解产物进行了肽谱分析，比较了二者的酶解效率。结果表明，TEOS与MTMS比例为1∶1时，凝胶膜有很好的成胶速度、机械强度、透明度；包埋态酶有很高的活性和稳定性。HPLC对肽段的分析结果表明，固定化酶的酶解效率优于溶液态酶。关键词 溶胶凝胶，固定化胰蛋白酶，蛋白质酶解，肽谱分析1 引言
蛋白质的肽谱分析是快速鉴定蛋白一级结构的技术之一[1]。蛋白质可被特异性的酶，如胰蛋白酶(trypsin), LysC酶等切断后得到一系列的肽片断。通过HPLC或MALDITOF对肽片断进行分离与鉴定，可得到一套具有特征性的肽谱数据。蛋白质的肽谱鉴定技术被广泛应用于监测蛋白质的病理变化、筛选靶标药物、基因突变、翻译后修饰等[[2，3]。最常用的蛋白水解酶是胰蛋白酶，可以有两种方式进行酶切反应：(1)在溶液状态均相条件下进行酶解反应。均相酶解过程中胰蛋白酶可能会进行自身酶解反应，产生的肽段极有可能干扰目标蛋白的肽谱分析；(2)利用固定化的胰蛋白酶对目标蛋白进行酶切反应。这种方法克服了均相条件下胰蛋白酶自降解产物对目标蛋白肽谱分析的影响[4，5]，同时酶的稳定性得到提高。此外，固定化的胰蛋白酶还能够重复使用。酶的固定化方法有吸附法、交联法、共价结合法及包埋法。吸附法虽然方法简便，条件温和 [6],但由于酶与载体之间结合力不强易导致固定化酶的释放。交联法与共价结合法都是利用化学共价键将酶固定化，酶与载体之间连接较牢固，稳定性好，但反应条件激烈。共价修饰还会导致酶丧失部分活力[7，8]。包埋法条件温和，不会造成酶的氨基酸残基化学修饰, 基本不会改变酶的结构。研究表明，被包埋的酶活性的变化在很大程度上取决于包埋材料与酶分子之间的相互作用及所提供的微环境。有机高分子材料与酶之间的强疏水作用极有可能导致酶活性的改变[9]。因而亲水性的无机凝胶体系作为酶的包埋材料已经成为近年来的研究热点。以烷氧化硅试剂为原料制备具有OSiO网络结构的SiO2凝胶，进行蛋白质的固定化已经应用于亲和色谱和酶催化反应[10，11]。由于条件温和，固定化的蛋白仍能够保持原有的分子结构，具有很高的生物活性和稳定性[12，13]。凝胶包埋法固定蛋白的一个很突出的优点是能够把凝胶膜制备成薄膜、球型或颗粒型等各种形状 ......
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