基质金属蛋白酶与椎间盘退变
与椎间盘退行性病变相关的临床综合征包括原发性下背部疼痛、颈腰神经根病、脊髓型颈椎病、腰椎管狭窄等。椎间盘退变的特征性改变是髓核中蛋白聚糖含量的下降以及伴随的水份丢失。目前，启动和调节这一过程的生物机制仍不十分清楚。因而，在治疗手段和疗效上，缺乏明确的对应性和有效性。以往认为椎间盘退变只是一种生物力学现象，但新近的研究表明生物力学的作用是次要的，更强调生物化学机制发挥着至关重要的作用。椎间盘退变主要表现在细胞和细胞外基质(extracell matrix，ECM)成分的变化，而后者是椎间盘力学特征丧失的直接原因。基质合成与降解的失衡将导致基质成分的紊乱，在此调节过程中一些生化机制发挥着重要作用。其中基质金属蛋白酶(matrix metaloproteinases，MMPs)与金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitor of metal-loproteinases，TIMPs)两个酶系统在椎间盘退变中的作用越来越为人们所重视。
1 椎间盘的结构及生化特征
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椎间盘是由软骨终板、纤维环和髓核三部分构成。正常的椎间盘由该三部分共同构成了起着对抗压力和张力的闭合缓冲系统，使椎间盘既有弹性亦能稳定脊柱，还能参与构成椎管，保护其内走行的神经血管[1] 。
如同其他的结缔组织，椎间盘仅含有少量的细胞及丰富的细胞外基质，后者的主要成分为水、胶原和蛋白多糖、少量的弹性蛋白和年龄色素等[2] 。椎间盘退变将导致三种主要物质—胶原、蛋白多糖和水的改变[3] 。胶原如同绳索，蛋白多糖如同气球，三者的配布犹如在液体凝胶状态中拉紧的绳索网内充以无数的气球。椎间盘根据负荷大小、水分多少、绳索拉紧和彼此缠结的牢固程度以及气球充气状态的改变，其形态及各种生理功能也发生改变，包括变形、营养供给、代谢状况和溶质输送等。从力学上看，蛋白多糖能抵抗压应力，而胶原能抵抗张应力[4] ，两者相互配合，以保持椎间盘的良好力学性能。
椎间盘细胞分为脊索细胞和纤维样细胞、软骨细胞样的 结缔组织细胞。椎间盘细胞的密度小于其他结缔组织的细胞密度，约占组织的1%～5%。如关节软骨细胞的平均细胞密度为14000细胞/mm 3 ，而椎间盘细胞为5800细胞/mm 3 。椎间盘不同部位的细胞密度和类型也不一样[5] ，软骨终板的平均细胞密度为15000细胞/mm 3 ，纤维环为9000细胞/mm 3 ，髓核为4000细胞/mm 3 ，髓核内细胞在胚胎为脊索样细胞，在正常成人主要以软骨样细胞为主，合成Ⅱ型胶原和蛋白多糖。纤维环外层为梭形的类成纤维细胞，主要合成Ⅰ型胶原，内层为圆形的软骨样细胞。软骨终板细胞为典型的软骨细胞。
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蛋白多糖存在髓核的胶原网架上，分子结构与关节软骨的蛋白多糖相似，在液体中能进行可逆压缩，对维持髓核组织的粘弹性及对抗压力起着重要作用。蛋白多糖在椎间盘和软骨的ECM中主要以聚合体的形式存在。胶原网和蛋白多糖共同维持髓核的凝胶状态。蛋白多糖及核心蛋白的表达在髓核最高，由内向外逐渐减弱，且随着年龄的增长其表达出现降低趋势，蛋白多糖逐渐被富含胶原组织的纤维组织所替代，最后导致髓核纤维化，水分随之丧失。变形的髓核组织弹性消失，硬度增加，失去均匀传递压力的作用，髓核易于从纤维环薄弱处脱出。
椎间盘组织中含有多种胶原成分，现已发现有Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅵ型、Ⅸ型、Ⅺ型等[6] 。胶原纤维是椎间盘的主要结构单位之一，其中Ⅰ型、Ⅱ型胶原是椎间盘胶原的主要成分。Eyre等[7] 利用溴化氰裂解、磷酸纤维素层析，发现Ⅰ型、Ⅱ型胶原是椎间盘组织中规律性的分布。Ⅰ型胶原主要集中在纤维环的外层，占椎间盘Ⅰ型胶原总量的40%。能耐受牵张力，也是骨、肌腱、韧带、皮肤等组织的主要胶原成分。由外层向髓核方向，Ⅰ型胶原逐渐减少，Ⅱ型胶原逐渐增加，髓核则主要为Ⅱ型胶原构成。Ⅱ型胶原是软骨胶原，在软骨、玻璃体和椎间盘髓核中含量丰富，耐受压力。二者的共同存在和协同作用在维持椎间盘的力学特性中发挥重要作用[4] 。当其质和量发生变化时，必然引起椎间盘承受应力能力的降低和增加损伤的机会。
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2 基质金属蛋白酶家族
MMPs是参与降解全身各种组织ECM的蛋白酶家族，自1962年Gross和Lapiere首次报道胶原酶(Collagense)以来，作用于ECM其他成分的MMPs不断报道。到目前为止已发现和纯化的MMPs至少有20种。MMPs通常由纤维母细胞、中性粒细胞、巨噬细胞及肿瘤细胞产生，是一组锌离子依赖性蛋白酶，共同特征是其催化中心均需锌离子存在，其结构和氨基酸组成相似，分子结构中都含有1个17～29个氨基酸的单序列区、77～87个氨基酸的前肽、含有锌离子结合位点的催化区、5～50个氨基酸并富含脯氨酸的铰链区和约有200个氨基酸编码底物特异性的序列，其cDNA具有同源性，以非活性形式分泌，通过蛋白水解作用激活，可被一些特殊的TIMPs和乙烯二胺四醋酸(ethylene diaminete tracetic acid，EDTA)所抑制[8] 。MMPs有一些共同的生化特点:a)催化机制依赖于活化中心的锌离子;b)蛋白酶均以无活性的酶原形式分泌;c)酶原可被蛋白酶激活因子或有机汞制剂激活;d)激活过程伴随分子量的减少;e)不同细胞来源的MMPs有很高的同源性;f)激活后的酶可裂解一种或多种ECM成分;g)酶的活性可被MMPs的天然抑制剂TIMPs抑制;h)多数MMPs基因转录受到内源性生长因子和细胞因子调节，如白细胞介素(interleukin，IL)-1和IL-6、肿瘤坏死因子(tumor necrosing factor，TNF)-α和IFN-γ以及骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)等。
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根据表达的部位不同，MMPs分为胞浆型和膜型两大类，前者分布在胞浆中，后者表达在细胞膜上，胞浆型MMps有胶原酶、基质溶解酶、明胶酶;膜型MMPs即膜蛋白酶[9] 。胶原酶中MMP-1、8、13具有高度同源性，MMP-1(胶原酶-1/成纤维细胞胶原酶)分布广泛，主要由成纤维细胞分泌，主要降解Ⅲ型胶原。MMP-8主要来源于多形核中性粒细胞，主要降解Ⅰ型胶原。MMP-13主要来源于软骨细胞，主要降解Ⅱ型胶原。这三种胶原酶都在胶原分子α链的Gly-ile/leu键处降解胶原，产生3/4和1/4原长的片段。这些片段易被其他MMPs如明胶酶降解，故为降解胶原的关键酶[10] 。它们还能特异性地降解软骨内的Ⅵ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ型胶原，软骨内的糖胺聚糖也可被胶原酶裂解。明胶酶(gelatinases)也称Ⅸ型胶原酶，包括MMP-2(明胶酶A)[11] 、MMP-9(明胶酶B)[12] ，主要来源于多形核细胞、单核巨噬细胞、T细胞、软骨细胞、转移性肿瘤细胞。MMP-2主要作用于Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ、Ⅺ型胶原，以及纤维结合蛋白、弹性蛋白和蛋白多糖，所以能够有效地分解明胶，降解胶原溶解的初级产物。基质溶解酶包括MMP-3、10、11，基质溶解酶比胶原酶的作用底物范围广，其 作用底物主要是基质中蛋白多糖和糖蛋白，如纤维粘连蛋白、层粘连蛋白和明胶，它们还能降解Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ型胶原，MMP-3还可降解Ⅱ型胶原的非螺旋区。MMP-3、7还能降解软骨中蛋白多糖的核心蛋白，如可裂解糖胺聚糖分子的Asn341-Phe342部位，并能激活其他MMPs，故为基质降解的主要酶类。最近又确认了六种MMPs:MMP-12、19和四种膜蛋白酶类。MMPs可以用许多方法检测如免疫组化技术、酶联免疫吸附法、明胶酶谱学、RT-PCR分析及同位素标记胶原底物降解分析法等。
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MMPs在许多生物过程中发挥重要作用，参与正常或病理条件下的组织重塑。ECM的完整性取决于其合成和降解之间的平衡，平衡的破坏将导致病理过程。MMPs与许多结缔组织疾病有关，如牙周病、肝脏纤维化、骨关节炎和类风湿关节炎等。此外在恶性肿瘤的侵袭转移过程中也起着关键性作用[13] 。
3 金属蛋白酶组织抑制剂家族
TIMPs是近年来发现的能特异性抑制MMPs活性的一组多功能因子家族。TIMPs家族是一个多基因家族的编码蛋白，可与MMps的酶原和其活化形式相结合，常常由分泌金属蛋白酶的同一细胞所合成。TIMPs家族由4个成员组成，依其被发现的先后顺序分别为TIMP-1[14] 、2、3、4，其中TIMP-1、2、4为可溶性分泌蛋白，TIMP-3是结合ECM的非可溶性蛋白。TIMP-1分子量为28.5KDa的糖蛋白，含有184个氨基酸和6个分子间二硫键，可与活化的间质胶原酶、活化的基质溶解素和MMP-3形成1∶1复合体[15] 。TIMP-2分子量为21KDa的非糖蛋白，有194个氨基酸残基，其氨基酸序列有65.6%与TIMP-1同源，37%完全相同，其中12个半胱氨酸残基及4个色氨酸中的3个位置是保守的，TIMP-2可以1∶1非共价键形式与活化的MMP-2形成复合物，有效地抑制MMP-2的胶原分解活性及明胶活性，与TIMP-1不同的是TIMP-2既能结合无活性的MMP-2酶原，又能结合激活状态下的MMP-2，而且可以终止MMPs家族中所有成员的水解活性。TIMP-3分子量为21KDa的TIMP家族新成员，其氨基酸序列与TIMP-1、TIMP-2的同源性分别为28%、42%[16] ，它只存在于ECM中，可以阻碍转化的纤维母细胞对ECM的粘附，促进非转化细胞的增殖及转化表型的表达[17] 。刚分离出的TIMP-4分子量为22.6Kda，有224个氨基酸，与TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3分别有37%、51%、51%相同[10] 。TIMPs与MMPs各成员之间存在相互调节的作用，使得MMPs和TIMPs在一定程度上保持协调平衡的关系。TIMPs主要从两个方面抑制MMPs的激活:a)在酶原活化阶段，可与proMMPs形成稳定的复合体，并阻碍其自我合成;b)在活化的MMPs阶段，可直接与活化的MMPs以1∶1分子比例非共价结合，进而抑制其活性，这种结合是不可逆且稳定的。关于TIMPs的作用机制尚不清楚，有人推测TIMPs可能通过其17、19位点的亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸与MMPs的S′1、S′2、S′3区结合，使MMPs第16位上的天冬氨酸残基的羟基作用于活性中心的锌离子，从而抑制其活性。尽管每种TIMPs都能抑制所有的MMPs，但目前的证据表明，TIMP-2对MMP-2的活性特别重要，而TIMP-1主要抑制MMP-1、MMP-3、MMP-9。
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4 基质金属蛋白酶与金属蛋白酶组织抑制剂在椎间盘退变中的作用
随着年龄的增加，椎间盘逐渐发生退行性变化。Ⅰ型胶原取代Ⅱ型胶原、出现Ⅲ型胶原及Ⅹ型胶原，非还原性共价交联累积，蛋白多糖特别是聚合体含量下降，髓核水化减少等是退变椎间盘基质成分的主要生化改变，异常或过量的MMPs的出现是其重要原因。其中MMP-3是降解ECM的主要酶，其作用底物广泛，蛋白多糖聚合体及椎间盘内多种基质成分，减少髓核的亲水作用。通过降解连接蛋白破坏核心蛋白的透明质酸结合区分解蛋白多糖聚合体，此外还可以降解多种胶原、层粘素、纤维连接素、明胶、基底膜和结缔组织，并且可以通过激活其他MMPs起作用[8，10，13] 。研究表明正常软骨内MMPs的生物活性明显升高、且mRNA的表达也增高，MMPs与TIMPs的平衡破坏引起软骨破坏[13，18] 。椎间盘的基质成分与关节软骨相似。椎间盘具有透明软骨的许多特性，故推测椎间盘的退变可伴有MMP-3的异常表达，MMP-3与TIMP-1的不平衡表达导致椎间盘退变。
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近几年，国外有报道在椎间盘的培养体系和组织提取物中有MMP-3的存在，在退变或突出的间盘组织和培养体系中有MMP-3的异常表达。Liu等[18] 证实人椎间盘能释放一种没有活性的导致酪蛋白水解的MMPs，可被IL-1β激活，这种酶在免疫学上与基质蛋白酶相同，这提示椎间盘细胞能够分泌基质水解酶的前体，然后被激活。Cole[19] 在犬椎间盘中确认了94KDa蛋白酶能够导致明胶退变，该酶作用于蛋白多糖单体与透明质酸酶的连接区，消减了它与透明质酸聚合的能力。Kang等[20] 发现突出的颈、腰椎间盘自发地产生MMPs、NO、IL-6和前列腺素2(prostaglandin2，PGE2)，MMPs促进ECM降解。NO作为炎症介质具有扩血管作用并抑制IL-6和蛋白多糖合成，IL-6促进TIMP-1表达。Haro等[21，22] 通过RT-PCR技术发现软骨细胞单独培养只产生极少量的MMP-3，而与巨噬细胞共同培养后MMP-3的表达显著增加，MMP-3除了直接降解蛋白多糖外，还诱导产生巨噬细胞趋化因子，使具有蛋白溶解活性的巨噬细胞浸润，导 致突出椎间盘组织的吸收。Kang等[20，23] 发现退变或突出的椎间盘及患者血中MMP-3水平升高。Kanemoto等[10] 发现家兔退变椎间盘中MMP-3表达阳性而TIMP-1表达阴性，MMP-3表达阳性率与MRI显示的椎间盘退变程度呈正相关，而且突出椎间盘中MMP-3表达阳性率高于未突出的椎间盘。
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5 基质金属蛋白酶的调节
正常椎间盘中MMPs多由软骨细胞产生，以酶原形式分泌，MMPs受多种方式调节。IL-1、TNFα等可诱导MMPs基因高水平表达[24] ，使金属蛋白酶合成增加。正常软骨在IL-1的作用下，MMP-1和MMP-3的表达增加，细胞以酶原形式分泌MMPs，在胞浆素的作用下被激活，IL-1对胞浆素具有激活作用，从而促进MMPs的活化。MMPs成员可以相互激活，尤其是MMP-3活化的MMPs被TIMPs抑制，此外还受四环素、强力霉素、α2巨球蛋白等抑制。
MMPs在椎间盘内的调节:正常椎间盘中MMPs多由软骨细胞产生，以酶原形式分泌，多种细胞因子在MMPs激活中起重要作用。有研究表明，突出椎间盘组织中存在IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2。而IL-1α可激活酪蛋白酶的活性。Liu等[18] 证实人椎间盘释放的一种能导致酪蛋白水解的MMP酶原可被IL-1β激活，此酶在髓核中的水平高于纤维环。研究发现IL-1使培养的椎间盘细胞中MMP-3增多，可使正常人关节软骨(类似椎间盘软骨终板)中MMP-1、3、9的表达增加，成纤维细胞生长因子在退变椎间盘组织中可以调节蛋白酶水解活性。Haro等[25，26] 在体外培养的椎间盘软骨细胞和巨噬细胞体系中发现巨噬细胞能诱导椎间盘软骨细胞产生MMP-3，而MMP-3参与巨噬细胞趋化因子的产生，此趋化因子反过来又能促进具有蛋白水解活性的巨噬细胞对椎间盘的浸润;巨噬细胞产生的MMP-7参与巨噬细胞释放TNF-α，而TNF-α能促进椎间盘细胞产生MMP-3。有研究提示，激活的巨噬细胞还可产生MMP-1、2、9、12、13等。Sedowofia等[2] 发现椎间盘中的明胶酶和弹性蛋白酶可激活胶原酶。TIMPs则可抑制MMPs的活性。Knight等[27] 从人椎间盘内分离出中性蛋白酶的抑制因子，该因子集中在髓核，向纤维环外层逐渐减少;Jacoby等[28] 也发现人椎间盘纤维环中的纤维软骨细胞能合成分泌性蛋白酶抑制因子。有研究表明，TIMP-1和TIMP-2可与MMPs按1∶1的比例以非共价键形成有高度亲和力的复合物，从而抑制MMPs的活性。
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综上所述，MMPs和TIMPs的表达失衡引起椎间盘基质降解，从而可导致椎间盘的退变，当然椎间盘的退变还包括其他细胞因子和炎症介质的参与，MMPs也被认为与突出髓核的吸收有关。椎间盘退变的研究进展为临床治疗颈椎病和腰椎间盘突出症提供了新的探索途径，即以MMPs作为治疗靶点设计并寻找针对MMPs的拮抗药物，通过调节MMPs和TIMPs的表达水平来控制椎间盘基质代谢的平衡。包括抑制MMPs的转录和合成，降低MMP-3的酶活性，增加TIMPs表达等。随着基础研究的不断深入，生物制剂可能会成为治疗的新方向。
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(东南大学附属徐州医院骨科，江苏徐州 221009;徐州医学院附属医院骨科，江苏徐州 221009), http://www.100md.com(吴继彬，龚维成)
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椎间盘是由软骨终板、纤维环和髓核三部分构成。正常的椎间盘由该三部分共同构成了起着对抗压力和张力的闭合缓冲系统，使椎间盘既有弹性亦能稳定脊柱，还能参与构成椎管，保护其内走行的神经血管[1] 。
如同其他的结缔组织，椎间盘仅含有少量的细胞及丰富的细胞外基质，后者的主要成分为水、胶原和蛋白多糖、少量的弹性蛋白和年龄色素等[2] 。椎间盘退变将导致三种主要物质—胶原、蛋白多糖和水的改变[3] 。胶原如同绳索，蛋白多糖如同气球，三者的配布犹如在液体凝胶状态中拉紧的绳索网内充以无数的气球。椎间盘根据负荷大小、水分多少、绳索拉紧和彼此缠结的牢固程度以及气球充气状态的改变，其形态及各种生理功能也发生改变，包括变形、营养供给、代谢状况和溶质输送等。从力学上看，蛋白多糖能抵抗压应力，而胶原能抵抗张应力[4] ，两者相互配合，以保持椎间盘的良好力学性能。
椎间盘细胞分为脊索细胞和纤维样细胞、软骨细胞样的 结缔组织细胞。椎间盘细胞的密度小于其他结缔组织的细胞密度，约占组织的1%～5%。如关节软骨细胞的平均细胞密度为14000细胞/mm 3 ，而椎间盘细胞为5800细胞/mm 3 。椎间盘不同部位的细胞密度和类型也不一样[5] ，软骨终板的平均细胞密度为15000细胞/mm 3 ，纤维环为9000细胞/mm 3 ，髓核为4000细胞/mm 3 ，髓核内细胞在胚胎为脊索样细胞，在正常成人主要以软骨样细胞为主，合成Ⅱ型胶原和蛋白多糖。纤维环外层为梭形的类成纤维细胞，主要合成Ⅰ型胶原，内层为圆形的软骨样细胞。软骨终板细胞为典型的软骨细胞。
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蛋白多糖存在髓核的胶原网架上，分子结构与关节软骨的蛋白多糖相似，在液体中能进行可逆压缩，对维持髓核组织的粘弹性及对抗压力起着重要作用。蛋白多糖在椎间盘和软骨的ECM中主要以聚合体的形式存在。胶原网和蛋白多糖共同维持髓核的凝胶状态。蛋白多糖及核心蛋白的表达在髓核最高，由内向外逐渐减弱，且随着年龄的增长其表达出现降低趋势，蛋白多糖逐渐被富含胶原组织的纤维组织所替代，最后导致髓核纤维化，水分随之丧失。变形的髓核组织弹性消失，硬度增加，失去均匀传递压力的作用，髓核易于从纤维环薄弱处脱出。
椎间盘组织中含有多种胶原成分，现已发现有Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅵ型、Ⅸ型、Ⅺ型等[6] 。胶原纤维是椎间盘的主要结构单位之一，其中Ⅰ型、Ⅱ型胶原是椎间盘胶原的主要成分。Eyre等[7] 利用溴化氰裂解、磷酸纤维素层析，发现Ⅰ型、Ⅱ型胶原是椎间盘组织中规律性的分布。Ⅰ型胶原主要集中在纤维环的外层，占椎间盘Ⅰ型胶原总量的40%。能耐受牵张力，也是骨、肌腱、韧带、皮肤等组织的主要胶原成分。由外层向髓核方向，Ⅰ型胶原逐渐减少，Ⅱ型胶原逐渐增加，髓核则主要为Ⅱ型胶原构成。Ⅱ型胶原是软骨胶原，在软骨、玻璃体和椎间盘髓核中含量丰富，耐受压力。二者的共同存在和协同作用在维持椎间盘的力学特性中发挥重要作用[4] 。当其质和量发生变化时，必然引起椎间盘承受应力能力的降低和增加损伤的机会。
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MMPs是参与降解全身各种组织ECM的蛋白酶家族，自1962年Gross和Lapiere首次报道胶原酶(Collagense)以来，作用于ECM其他成分的MMPs不断报道。到目前为止已发现和纯化的MMPs至少有20种。MMPs通常由纤维母细胞、中性粒细胞、巨噬细胞及肿瘤细胞产生，是一组锌离子依赖性蛋白酶，共同特征是其催化中心均需锌离子存在，其结构和氨基酸组成相似，分子结构中都含有1个17～29个氨基酸的单序列区、77～87个氨基酸的前肽、含有锌离子结合位点的催化区、5～50个氨基酸并富含脯氨酸的铰链区和约有200个氨基酸编码底物特异性的序列，其cDNA具有同源性，以非活性形式分泌，通过蛋白水解作用激活，可被一些特殊的TIMPs和乙烯二胺四醋酸(ethylene diaminete tracetic acid，EDTA)所抑制[8] 。MMPs有一些共同的生化特点:a)催化机制依赖于活化中心的锌离子;b)蛋白酶均以无活性的酶原形式分泌;c)酶原可被蛋白酶激活因子或有机汞制剂激活;d)激活过程伴随分子量的减少;e)不同细胞来源的MMPs有很高的同源性;f)激活后的酶可裂解一种或多种ECM成分;g)酶的活性可被MMPs的天然抑制剂TIMPs抑制;h)多数MMPs基因转录受到内源性生长因子和细胞因子调节，如白细胞介素(interleukin，IL)-1和IL-6、肿瘤坏死因子(tumor necrosing factor，TNF)-α和IFN-γ以及骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)等。
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根据表达的部位不同，MMPs分为胞浆型和膜型两大类，前者分布在胞浆中，后者表达在细胞膜上，胞浆型MMps有胶原酶、基质溶解酶、明胶酶;膜型MMPs即膜蛋白酶[9] 。胶原酶中MMP-1、8、13具有高度同源性，MMP-1(胶原酶-1/成纤维细胞胶原酶)分布广泛，主要由成纤维细胞分泌，主要降解Ⅲ型胶原。MMP-8主要来源于多形核中性粒细胞，主要降解Ⅰ型胶原。MMP-13主要来源于软骨细胞，主要降解Ⅱ型胶原。这三种胶原酶都在胶原分子α链的Gly-ile/leu键处降解胶原，产生3/4和1/4原长的片段。这些片段易被其他MMPs如明胶酶降解，故为降解胶原的关键酶[10] 。它们还能特异性地降解软骨内的Ⅵ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ型胶原，软骨内的糖胺聚糖也可被胶原酶裂解。明胶酶(gelatinases)也称Ⅸ型胶原酶，包括MMP-2(明胶酶A)[11] 、MMP-9(明胶酶B)[12] ，主要来源于多形核细胞、单核巨噬细胞、T细胞、软骨细胞、转移性肿瘤细胞。MMP-2主要作用于Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ、Ⅺ型胶原，以及纤维结合蛋白、弹性蛋白和蛋白多糖，所以能够有效地分解明胶，降解胶原溶解的初级产物。基质溶解酶包括MMP-3、10、11，基质溶解酶比胶原酶的作用底物范围广，其 作用底物主要是基质中蛋白多糖和糖蛋白，如纤维粘连蛋白、层粘连蛋白和明胶，它们还能降解Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ型胶原，MMP-3还可降解Ⅱ型胶原的非螺旋区。MMP-3、7还能降解软骨中蛋白多糖的核心蛋白，如可裂解糖胺聚糖分子的Asn341-Phe342部位，并能激活其他MMPs，故为基质降解的主要酶类。最近又确认了六种MMPs:MMP-12、19和四种膜蛋白酶类。MMPs可以用许多方法检测如免疫组化技术、酶联免疫吸附法、明胶酶谱学、RT-PCR分析及同位素标记胶原底物降解分析法等。
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MMPs在许多生物过程中发挥重要作用，参与正常或病理条件下的组织重塑。ECM的完整性取决于其合成和降解之间的平衡，平衡的破坏将导致病理过程。MMPs与许多结缔组织疾病有关，如牙周病、肝脏纤维化、骨关节炎和类风湿关节炎等。此外在恶性肿瘤的侵袭转移过程中也起着关键性作用[13] 。
3 金属蛋白酶组织抑制剂家族
TIMPs是近年来发现的能特异性抑制MMPs活性的一组多功能因子家族。TIMPs家族是一个多基因家族的编码蛋白，可与MMps的酶原和其活化形式相结合，常常由分泌金属蛋白酶的同一细胞所合成。TIMPs家族由4个成员组成，依其被发现的先后顺序分别为TIMP-1[14] 、2、3、4，其中TIMP-1、2、4为可溶性分泌蛋白，TIMP-3是结合ECM的非可溶性蛋白。TIMP-1分子量为28.5KDa的糖蛋白，含有184个氨基酸和6个分子间二硫键，可与活化的间质胶原酶、活化的基质溶解素和MMP-3形成1∶1复合体[15] 。TIMP-2分子量为21KDa的非糖蛋白，有194个氨基酸残基，其氨基酸序列有65.6%与TIMP-1同源，37%完全相同，其中12个半胱氨酸残基及4个色氨酸中的3个位置是保守的，TIMP-2可以1∶1非共价键形式与活化的MMP-2形成复合物，有效地抑制MMP-2的胶原分解活性及明胶活性，与TIMP-1不同的是TIMP-2既能结合无活性的MMP-2酶原，又能结合激活状态下的MMP-2，而且可以终止MMPs家族中所有成员的水解活性。TIMP-3分子量为21KDa的TIMP家族新成员，其氨基酸序列与TIMP-1、TIMP-2的同源性分别为28%、42%[16] ，它只存在于ECM中，可以阻碍转化的纤维母细胞对ECM的粘附，促进非转化细胞的增殖及转化表型的表达[17] 。刚分离出的TIMP-4分子量为22.6Kda，有224个氨基酸，与TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3分别有37%、51%、51%相同[10] 。TIMPs与MMPs各成员之间存在相互调节的作用，使得MMPs和TIMPs在一定程度上保持协调平衡的关系。TIMPs主要从两个方面抑制MMPs的激活:a)在酶原活化阶段，可与proMMPs形成稳定的复合体，并阻碍其自我合成;b)在活化的MMPs阶段，可直接与活化的MMPs以1∶1分子比例非共价结合，进而抑制其活性，这种结合是不可逆且稳定的。关于TIMPs的作用机制尚不清楚，有人推测TIMPs可能通过其17、19位点的亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸与MMPs的S′1、S′2、S′3区结合，使MMPs第16位上的天冬氨酸残基的羟基作用于活性中心的锌离子，从而抑制其活性。尽管每种TIMPs都能抑制所有的MMPs，但目前的证据表明，TIMP-2对MMP-2的活性特别重要，而TIMP-1主要抑制MMP-1、MMP-3、MMP-9。
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4 基质金属蛋白酶与金属蛋白酶组织抑制剂在椎间盘退变中的作用
随着年龄的增加，椎间盘逐渐发生退行性变化。Ⅰ型胶原取代Ⅱ型胶原、出现Ⅲ型胶原及Ⅹ型胶原，非还原性共价交联累积，蛋白多糖特别是聚合体含量下降，髓核水化减少等是退变椎间盘基质成分的主要生化改变，异常或过量的MMPs的出现是其重要原因。其中MMP-3是降解ECM的主要酶，其作用底物广泛，蛋白多糖聚合体及椎间盘内多种基质成分，减少髓核的亲水作用。通过降解连接蛋白破坏核心蛋白的透明质酸结合区分解蛋白多糖聚合体，此外还可以降解多种胶原、层粘素、纤维连接素、明胶、基底膜和结缔组织，并且可以通过激活其他MMPs起作用[8，10，13] 。研究表明正常软骨内MMPs的生物活性明显升高、且mRNA的表达也增高，MMPs与TIMPs的平衡破坏引起软骨破坏[13，18] 。椎间盘的基质成分与关节软骨相似。椎间盘具有透明软骨的许多特性，故推测椎间盘的退变可伴有MMP-3的异常表达，MMP-3与TIMP-1的不平衡表达导致椎间盘退变。
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近几年，国外有报道在椎间盘的培养体系和组织提取物中有MMP-3的存在，在退变或突出的间盘组织和培养体系中有MMP-3的异常表达。Liu等[18] 证实人椎间盘能释放一种没有活性的导致酪蛋白水解的MMPs，可被IL-1β激活，这种酶在免疫学上与基质蛋白酶相同，这提示椎间盘细胞能够分泌基质水解酶的前体，然后被激活。Cole[19] 在犬椎间盘中确认了94KDa蛋白酶能够导致明胶退变，该酶作用于蛋白多糖单体与透明质酸酶的连接区，消减了它与透明质酸聚合的能力。Kang等[20] 发现突出的颈、腰椎间盘自发地产生MMPs、NO、IL-6和前列腺素2(prostaglandin2，PGE2)，MMPs促进ECM降解。NO作为炎症介质具有扩血管作用并抑制IL-6和蛋白多糖合成，IL-6促进TIMP-1表达。Haro等[21，22] 通过RT-PCR技术发现软骨细胞单独培养只产生极少量的MMP-3，而与巨噬细胞共同培养后MMP-3的表达显著增加，MMP-3除了直接降解蛋白多糖外，还诱导产生巨噬细胞趋化因子，使具有蛋白溶解活性的巨噬细胞浸润，导 致突出椎间盘组织的吸收。Kang等[20，23] 发现退变或突出的椎间盘及患者血中MMP-3水平升高。Kanemoto等[10] 发现家兔退变椎间盘中MMP-3表达阳性而TIMP-1表达阴性，MMP-3表达阳性率与MRI显示的椎间盘退变程度呈正相关，而且突出椎间盘中MMP-3表达阳性率高于未突出的椎间盘。
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5 基质金属蛋白酶的调节
正常椎间盘中MMPs多由软骨细胞产生，以酶原形式分泌，MMPs受多种方式调节。IL-1、TNFα等可诱导MMPs基因高水平表达[24] ，使金属蛋白酶合成增加。正常软骨在IL-1的作用下，MMP-1和MMP-3的表达增加，细胞以酶原形式分泌MMPs，在胞浆素的作用下被激活，IL-1对胞浆素具有激活作用，从而促进MMPs的活化。MMPs成员可以相互激活，尤其是MMP-3活化的MMPs被TIMPs抑制，此外还受四环素、强力霉素、α2巨球蛋白等抑制。
MMPs在椎间盘内的调节:正常椎间盘中MMPs多由软骨细胞产生，以酶原形式分泌，多种细胞因子在MMPs激活中起重要作用。有研究表明，突出椎间盘组织中存在IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2。而IL-1α可激活酪蛋白酶的活性。Liu等[18] 证实人椎间盘释放的一种能导致酪蛋白水解的MMP酶原可被IL-1β激活，此酶在髓核中的水平高于纤维环。研究发现IL-1使培养的椎间盘细胞中MMP-3增多，可使正常人关节软骨(类似椎间盘软骨终板)中MMP-1、3、9的表达增加，成纤维细胞生长因子在退变椎间盘组织中可以调节蛋白酶水解活性。Haro等[25，26] 在体外培养的椎间盘软骨细胞和巨噬细胞体系中发现巨噬细胞能诱导椎间盘软骨细胞产生MMP-3，而MMP-3参与巨噬细胞趋化因子的产生，此趋化因子反过来又能促进具有蛋白水解活性的巨噬细胞对椎间盘的浸润;巨噬细胞产生的MMP-7参与巨噬细胞释放TNF-α，而TNF-α能促进椎间盘细胞产生MMP-3。有研究提示，激活的巨噬细胞还可产生MMP-1、2、9、12、13等。Sedowofia等[2] 发现椎间盘中的明胶酶和弹性蛋白酶可激活胶原酶。TIMPs则可抑制MMPs的活性。Knight等[27] 从人椎间盘内分离出中性蛋白酶的抑制因子，该因子集中在髓核，向纤维环外层逐渐减少;Jacoby等[28] 也发现人椎间盘纤维环中的纤维软骨细胞能合成分泌性蛋白酶抑制因子。有研究表明，TIMP-1和TIMP-2可与MMPs按1∶1的比例以非共价键形成有高度亲和力的复合物，从而抑制MMPs的活性。
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综上所述，MMPs和TIMPs的表达失衡引起椎间盘基质降解，从而可导致椎间盘的退变，当然椎间盘的退变还包括其他细胞因子和炎症介质的参与，MMPs也被认为与突出髓核的吸收有关。椎间盘退变的研究进展为临床治疗颈椎病和腰椎间盘突出症提供了新的探索途径，即以MMPs作为治疗靶点设计并寻找针对MMPs的拮抗药物，通过调节MMPs和TIMPs的表达水平来控制椎间盘基质代谢的平衡。包括抑制MMPs的转录和合成，降低MMP-3的酶活性，增加TIMPs表达等。随着基础研究的不断深入，生物制剂可能会成为治疗的新方向。
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(东南大学附属徐州医院骨科，江苏徐州 221009;徐州医学院附属医院骨科，江苏徐州 221009), http://www.100md.com(吴继彬，龚维成)