莪术油注射液静脉滴注用药时的细菌内毒素检查
摘要：目的建立莪术油注射液静脉滴注用药时细菌内毒素的检查方法。方法根据《中国药典》2005年版Ⅱ部收载的细菌内毒素检查法的要求进行实验。结果莪术油注射液的内毒素限值应定为4.38EU·ml-1，该药稀释至1.25mg·ml-1浓度时对细菌内毒素检查无干扰,用标示灵敏度为0.5EU·ml-1 的鲎试剂进行细菌内毒素检查是有效的。结论鲎试剂可用于莪术油注射液静脉滴注用药时的细菌内毒素检查。
关键词：莪术油注射液 ； 静脉滴注； 细菌内毒素 ； 干扰实验
Bacterial Endotoxins Test of Zedoray Turmeric Oil Injection for Intravenous Injection
MENG Lili, LIU Jun, YE Lin, GONG Wenming, ZHAO Shanshan
(The First People's Hospital of Xiangfan， Hubei 441000,China)
Abstract：ObjectiveTo establish a test method for bacterial endotoxins in Zedoary Turmeric Oil Injection for intravenous injection。MethodsThe experiment was implemented according to the loacterial test endotoxins in China Pharmacopoeia (Ⅱ,2005ed)。ResultsThe delimitation of bacterial endotoxins of this medicament should be fixed less than 4.38 EU·ml-1. The concentration 1.25mg·ml-1 of Zedoary Turmeric Oil Injection for intravenous injection should not interfere the test ,and be effective that the baterial endotoxins could be tested by amebocyte lysate with accuracy of 0.5EU ml-1。ConclusionThe bacterial endotoxins test can be used for Zedoary Turmeric Oil Injection。
Key words：Zedoray Turmeric Oil Injection； Intravenous injection； Bacterial endotoxins； Interference experiment
莪术油注射液(Zedoray Turmeric Oil Injection ，简称ZTO)是从姜科植物蓬莪术、温郁金、广西莪术中提取的挥发油，其主要成分为多种倍半萜类，具有多种药理作用及广泛的临床应用，可抑制多种细菌生长，并对一些病毒有直接灭活作用。本文根据静脉用药时细菌内毒素总限量来确定ZTO细菌内毒素限值，建立ZTO静脉用药时的细菌内毒素检查方法。
1 器材
1.1 试药鲎试剂(TAL)：灵敏度0.5EU·ml-1，规格：0.1 ml/支，批号：050515， 厦门鲎试剂厂；灵敏度0.5 EU·ml-1，规格：0.1 ml/支，批号：050720，湛江安度斯生物有限公司。细菌内毒素工作标准品：10 EU/支，批号：050411， 厦门鲎试剂厂。细菌内毒素检查用水(BET水)：2 ml/支，批号：050110，厦门鲎试剂厂。ZTO ：0.2 g/20 ml，批号：051201，051008，051123， 黑龙江瑞格制药有限公司。5%葡萄糖注射液：250 ml：12 .5 g，批号：051009，051112，051118，四川科伦药业有限公司。
1.2 仪器电热恒温水浴箱(江苏沙洲医疗器械厂)；旋涡混合器(上海沪西分析仪器厂)。实验用玻璃器皿经180℃烘烤2h 以上。
2 方法与结果[1]
2.1 样品细菌内毒素理论限值确定
2.1.1 按人用最大剂量确定[2]参照ZTO 药品说明书规定的用法用量，静脉用药时 ZTO一次应用最大剂量为400 mg·(60kg)-1·h-1，即一次应用最大剂量为40 ml·(60kg)-1·h-1。根据公式L′=K∕f·M ，其中K=5.0EU·(kg·h)-1，它是细菌内毒素的致热阈；M 为成人每kg体重每h最大剂量；f 为安全系数，取值范围 3～10，本法取 6。经计算得细菌内毒素理论限值L′为1.25EU·ml-1。
2.1.2 按静脉用药时内毒素总限量确定 按400 mg样品即40 ml ZTO与250 ml输液静滴作为1 h 最大剂量计算，人每公斤体重每小时接受细菌内毒素可能达到的理论总量K′为2.91EU·(kg·h)-1。K′值小于标准[1]给定内毒素阈剂量5.0 EU·(kg·h)-1，故在静脉用药时应按混合液内毒素总量K′与人用阈剂量 K值之间关系,来确定样品的内毒素限值，即(40ml×L+250ml×0.5 EU·ml-1)/60 kg·h≤K，其中 0.5 EU·ml-1为 葡萄糖注射液的细菌内毒素限值，计算得样品在静脉滴注用药时的细菌内毒素理论限值L≤4.38EU·ml-1。
2.2 样品最大有效稀释倍数的确定市售TAL常用灵敏度(λ)在0.5 ～0.03 EU·ml-1范围内，根据MVD=λ/L得MVD0.5为8倍，MVD0.03为146倍，相应ZTO的C0.5为 1.25 mg·ml-1，C0.03为 0.068 mg·ml-1 。实验拟选用 0.5 EU·ml-1的TAL。
2.3 TAL灵敏度复核实验按《中国药典》2005年版Ⅱ部附录操作，对标示灵敏度为0.5 EU·ml-1的两批TAL进行复核。结果见表1。
表1 TAL 灵敏度复核结果(略)
表1结果表明，两批TAL灵敏度复核结果λc均在0.5～2.0λ(即0.25～1.0 EU·ml-1)间，符合规定，可用于实验。
2.4 样品干扰预实验以样品(批号：051201)原液为起点，用BET水等倍稀释成1∶1，1∶2，1∶4，1∶8即10，5，2.5 ，1.25mg·ml-1共4种浓度，用其将内毒素工作标准品制成2.0，1.0，0.5，0.25λ 4 个浓度的溶液；用TAL(λ=0.5EU·ml-1，批号：050515，050720)按“2，3”法进行实验。结果见表2。
表2 样品干扰预实验结果(略)
表 2 结果表明，将样品稀释 8 倍，浓度为1.25 mg·ml-1使用λ=0.5 EU·ml-1的 TAL进行实验无干扰。
2.5 样品干扰实验经预试，本品1.25 mg·ml-1对实验无干扰作用，故以1.25mg·ml-1样品稀释液进行干扰实验。本实验采用2个厂家的TAL，观察3批样品对实验有无干扰作用。按标准[1]规定，用BET水和1.25mg·ml-1的样品稀释液将同一支细菌内毒素工作标准品分别制成含细菌内毒素2.0，1.0，0.5，0.25λ 4 种浓度的内毒素溶液，分别用上述两个厂家的 TAL 观察样品在 1.25mg·ml-1浓度时对实验的干扰情况，每一浓度平行做 4 管，同时另取BET水和浓度为1.25mg·ml-1样品稀释液各做两支阴性对照。实验结果见表3。
表3 样品(1.25 mg·ml-1)干扰实验结果(略)
表3结果表明，Es，Et 均在0.5 ～2.0λ范围内且 Es 与 Et 的比值在 0.5～2.0范围内，说明3批样品经8倍稀释浓度在1.25 mg·ml-1对不同厂家的 TAL 均无干扰作用。
2.6 模拟样品静滴状态时的细菌内毒素检查选用标示灵敏度为0.5 EU·ml-1TAL(批号：050515，050720)，取样品1.25mg·ml-1浓度的稀释液(批号：051201，051008，051123)、5% 葡萄糖注射液(批号：051009 051112 051118)，样品葡萄糖溶液(通过一次性输液器后的滤液)，分别进行内毒素检查，结果均为阴性。
3 讨论
本实验充分考虑了药物在使用过程中内毒素叠加(溶解介质、输液管道)作用，确定 ZTO在静脉滴注用药时内毒素限值为4.38EU·ml-1。药物能否采用细菌内毒素检查的先决条件是证明其在满足限度检查要求浓度下对细菌内毒素不产生干扰作用。如果药品在高浓度对细菌内毒素实验无干扰，则在低浓度时也不会产生干扰[3] 。实验结果表明，将 ZTO稀释8倍，浓度为1.25mg·ml-1对进行细菌内毒素检查时对灵敏度为0.5 EU·ml-1TAL进行细菌内毒素实验不产生干扰。TAL可用于 ZTO的细菌内毒素检查。
参考文献：
[1] 国家药典委员会.中国药典，Ⅱ部[S].北京：化学工业出版社，2005：.附录 85.
[2] 王晨，张霞.注射用草酸铂细菌内毒素检查法的建立[J].中国药师，2005，8(7)：611.
[3] 黄清泉，夏振民.药品细菌内毒素检查的实验设计[J].中国药学杂志，1997，32(2)：72.
(湖北省襄樊市第一人民医院 441000), http://www.100md.com(孟丽丽， 刘军， 叶琳， 龚文明， 赵珊珊)
关键词：莪术油注射液 ； 静脉滴注； 细菌内毒素 ； 干扰实验
Bacterial Endotoxins Test of Zedoray Turmeric Oil Injection for Intravenous Injection
MENG Lili, LIU Jun, YE Lin, GONG Wenming, ZHAO Shanshan
(The First People's Hospital of Xiangfan， Hubei 441000,China)
Abstract：ObjectiveTo establish a test method for bacterial endotoxins in Zedoary Turmeric Oil Injection for intravenous injection。MethodsThe experiment was implemented according to the loacterial test endotoxins in China Pharmacopoeia (Ⅱ,2005ed)。ResultsThe delimitation of bacterial endotoxins of this medicament should be fixed less than 4.38 EU·ml-1. The concentration 1.25mg·ml-1 of Zedoary Turmeric Oil Injection for intravenous injection should not interfere the test ,and be effective that the baterial endotoxins could be tested by amebocyte lysate with accuracy of 0.5EU ml-1。ConclusionThe bacterial endotoxins test can be used for Zedoary Turmeric Oil Injection。
Key words：Zedoray Turmeric Oil Injection； Intravenous injection； Bacterial endotoxins； Interference experiment
莪术油注射液(Zedoray Turmeric Oil Injection ，简称ZTO)是从姜科植物蓬莪术、温郁金、广西莪术中提取的挥发油，其主要成分为多种倍半萜类，具有多种药理作用及广泛的临床应用，可抑制多种细菌生长，并对一些病毒有直接灭活作用。本文根据静脉用药时细菌内毒素总限量来确定ZTO细菌内毒素限值，建立ZTO静脉用药时的细菌内毒素检查方法。
1 器材
1.1 试药鲎试剂(TAL)：灵敏度0.5EU·ml-1，规格：0.1 ml/支，批号：050515， 厦门鲎试剂厂；灵敏度0.5 EU·ml-1，规格：0.1 ml/支，批号：050720，湛江安度斯生物有限公司。细菌内毒素工作标准品：10 EU/支，批号：050411， 厦门鲎试剂厂。细菌内毒素检查用水(BET水)：2 ml/支，批号：050110，厦门鲎试剂厂。ZTO ：0.2 g/20 ml，批号：051201，051008，051123， 黑龙江瑞格制药有限公司。5%葡萄糖注射液：250 ml：12 .5 g，批号：051009，051112，051118，四川科伦药业有限公司。
1.2 仪器电热恒温水浴箱(江苏沙洲医疗器械厂)；旋涡混合器(上海沪西分析仪器厂)。实验用玻璃器皿经180℃烘烤2h 以上。
2 方法与结果[1]
2.1 样品细菌内毒素理论限值确定
2.1.1 按人用最大剂量确定[2]参照ZTO 药品说明书规定的用法用量，静脉用药时 ZTO一次应用最大剂量为400 mg·(60kg)-1·h-1，即一次应用最大剂量为40 ml·(60kg)-1·h-1。根据公式L′=K∕f·M ，其中K=5.0EU·(kg·h)-1，它是细菌内毒素的致热阈；M 为成人每kg体重每h最大剂量；f 为安全系数，取值范围 3～10，本法取 6。经计算得细菌内毒素理论限值L′为1.25EU·ml-1。
2.1.2 按静脉用药时内毒素总限量确定 按400 mg样品即40 ml ZTO与250 ml输液静滴作为1 h 最大剂量计算，人每公斤体重每小时接受细菌内毒素可能达到的理论总量K′为2.91EU·(kg·h)-1。K′值小于标准[1]给定内毒素阈剂量5.0 EU·(kg·h)-1，故在静脉用药时应按混合液内毒素总量K′与人用阈剂量 K值之间关系,来确定样品的内毒素限值，即(40ml×L+250ml×0.5 EU·ml-1)/60 kg·h≤K，其中 0.5 EU·ml-1为 葡萄糖注射液的细菌内毒素限值，计算得样品在静脉滴注用药时的细菌内毒素理论限值L≤4.38EU·ml-1。
2.2 样品最大有效稀释倍数的确定市售TAL常用灵敏度(λ)在0.5 ～0.03 EU·ml-1范围内，根据MVD=λ/L得MVD0.5为8倍，MVD0.03为146倍，相应ZTO的C0.5为 1.25 mg·ml-1，C0.03为 0.068 mg·ml-1 。实验拟选用 0.5 EU·ml-1的TAL。
2.3 TAL灵敏度复核实验按《中国药典》2005年版Ⅱ部附录操作，对标示灵敏度为0.5 EU·ml-1的两批TAL进行复核。结果见表1。
表1 TAL 灵敏度复核结果(略)
表1结果表明，两批TAL灵敏度复核结果λc均在0.5～2.0λ(即0.25～1.0 EU·ml-1)间，符合规定，可用于实验。
2.4 样品干扰预实验以样品(批号：051201)原液为起点，用BET水等倍稀释成1∶1，1∶2，1∶4，1∶8即10，5，2.5 ，1.25mg·ml-1共4种浓度，用其将内毒素工作标准品制成2.0，1.0，0.5，0.25λ 4 个浓度的溶液；用TAL(λ=0.5EU·ml-1，批号：050515，050720)按“2，3”法进行实验。结果见表2。
表2 样品干扰预实验结果(略)
表 2 结果表明，将样品稀释 8 倍，浓度为1.25 mg·ml-1使用λ=0.5 EU·ml-1的 TAL进行实验无干扰。
2.5 样品干扰实验经预试，本品1.25 mg·ml-1对实验无干扰作用，故以1.25mg·ml-1样品稀释液进行干扰实验。本实验采用2个厂家的TAL，观察3批样品对实验有无干扰作用。按标准[1]规定，用BET水和1.25mg·ml-1的样品稀释液将同一支细菌内毒素工作标准品分别制成含细菌内毒素2.0，1.0，0.5，0.25λ 4 种浓度的内毒素溶液，分别用上述两个厂家的 TAL 观察样品在 1.25mg·ml-1浓度时对实验的干扰情况，每一浓度平行做 4 管，同时另取BET水和浓度为1.25mg·ml-1样品稀释液各做两支阴性对照。实验结果见表3。
表3 样品(1.25 mg·ml-1)干扰实验结果(略)
表3结果表明，Es，Et 均在0.5 ～2.0λ范围内且 Es 与 Et 的比值在 0.5～2.0范围内，说明3批样品经8倍稀释浓度在1.25 mg·ml-1对不同厂家的 TAL 均无干扰作用。
2.6 模拟样品静滴状态时的细菌内毒素检查选用标示灵敏度为0.5 EU·ml-1TAL(批号：050515，050720)，取样品1.25mg·ml-1浓度的稀释液(批号：051201，051008，051123)、5% 葡萄糖注射液(批号：051009 051112 051118)，样品葡萄糖溶液(通过一次性输液器后的滤液)，分别进行内毒素检查，结果均为阴性。
3 讨论
本实验充分考虑了药物在使用过程中内毒素叠加(溶解介质、输液管道)作用，确定 ZTO在静脉滴注用药时内毒素限值为4.38EU·ml-1。药物能否采用细菌内毒素检查的先决条件是证明其在满足限度检查要求浓度下对细菌内毒素不产生干扰作用。如果药品在高浓度对细菌内毒素实验无干扰，则在低浓度时也不会产生干扰[3] 。实验结果表明，将 ZTO稀释8倍，浓度为1.25mg·ml-1对进行细菌内毒素检查时对灵敏度为0.5 EU·ml-1TAL进行细菌内毒素实验不产生干扰。TAL可用于 ZTO的细菌内毒素检查。
参考文献：
[1] 国家药典委员会.中国药典，Ⅱ部[S].北京：化学工业出版社，2005：.附录 85.
[2] 王晨，张霞.注射用草酸铂细菌内毒素检查法的建立[J].中国药师，2005，8(7)：611.
[3] 黄清泉，夏振民.药品细菌内毒素检查的实验设计[J].中国药学杂志，1997，32(2)：72.
(湖北省襄樊市第一人民医院 441000), http://www.100md.com(孟丽丽， 刘军， 叶琳， 龚文明， 赵珊珊)