重组人干扰素γ对球后成纤维细胞CD40 mRNA表达的影响
摘要: 目的 探讨在重组人干扰素γ(rhIFNγ)作用下，正常人和甲状腺相关眼病(TAO)患者球后成纤维细胞(RF)CD40 mRNA的表达情况。方法 用RTPCR法，对不同浓度rhIFNγ及400 U/mL rhIFNγ作用不同时间诱导体外培养的正常人和TAO患者RF CD40 mRNA进行半定量分析。结果 经100，200，400，1000 U/mL rhIFNγ作用48 h后，正常人和TAO患者RF CD40的光密度比值与各自对照组比较，差别有统计学意义(P<0.01)；两者同一浓度比较差别无统计学意义(P>0.05)。经400 U/mL rhIFNγ作用12，24，48，72 h后，正常人和TAO患者RF CD40的光密度比值与各自对照组比较差别有统计学意义(P<0.05)，两者同一时间比较差别无统计学意义(P>0.05)。结论 正常人和TAO患者RF均表达CD40 mRNA。rhIFNγ可上调正常人和TAO患者RF CD40 mRNA的水平，呈浓度和时间依赖。
关键词: 成纤维细胞； 甲状腺相关眼病； 干扰素，重组； 抗原，CD40； 细胞，培养的
The Effects of rhIFNγ Induced CD40 mRNA Expression
in Cultured Human Retroocular Fibroblasts
Fu Desheng, Xu Xueliang
1.Department of Ophathalmology, The Affiliated Union Hospital, Fujian Medical University, Fuzhou 350001, China
2.Department of Ophthalmology, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, China
ABSTRACT: Objective To quantify the mRNA expression of CD40 induced by recombinant human interferon gamma(rhIFNγ) in cultured human retroocular fibroblast(RF) from normal subjects and thyriod associated ophthalmophy(TAO) patients. Methods Half quantifying the mRNA expression of CD40 induced by different concentration and time rhIFNγ in cultured human RF from normal subjects and TAO patients. Results The absorbency values of 100, 200, 400, 1000 U/mL rhIFNγ in RF from normal subjects and TAO patients were increased significantly than negative control and 50 U/mL rhIFNγ group(P<0.01). Both not difference in same concentration. The absorbency values of 12,24,48,72 h of 400 U/mL rhIFNγ in RF from normal subjects and TAO patients， showed significantly different compared with negative control group(P<0.01)，and no difference in same time. Conclusions The cultured human RF from normal subjects and patients with TAO all express CD40 mRNA. The rhIFNγ could upregulate CD40 gene mRNA expression with dosedependence and timedependent in both human RF.
KEY WORDS: fibroblasts; Graves' disease;
甲状腺相关眼病(thyroid associated ophthalmopathy，TAO)在病理组织学特征性表现为眼眶组织内大量亲水性糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)聚集和免疫活性细胞浸润\[1\]。免疫活性细胞产生的炎症介质能上调球后成纤维细胞(retroocular fibroblast，RF)的目的基因，进而改变其生物合成活性，引起TAO的发生、发展，但免疫活性细胞浸润眼眶、免疫活性细胞和RF相互作用最终激活RF的分子机制尚不明确。RF与球后浸润的免疫活性细胞能否通过CD40/CD40L共刺激通路而相互作用，取决于RF是否表达CD40及球后局部微环境对CD40表达的影响；同时组织学证实TAO患者球后组织存在细胞因子γ(interferon gamma，IFNγ) \[2\]。笔者探讨体外培养的正常人和TAO患者RF是否有CD40 mRNA的表达，同时了解重组人干扰素γ(rhIFNγ)对它们表达的影响及两者的差异，探索TAO发病的可能机制。
1 材料与方法
1.1 试剂和仪器
RPMI 1640，DHanks液，胰蛋白酶，EDTA，青霉素，链霉素(均由中南大学分析测试中心、湘雅医学院中心实验室提供)。rhIFNγ(美国Peprotech EC LTD)。MTT(美国Sigma公司)。胎牛血清(武汉丽欣生物公司)。DMSO(美国Sigma公司)。Trizol提取液(美国Invitrogen公司)。DNA100标准物，RTPCR试剂盒，PCR引物，DEPC(北京鼎国生物技术发展中心)。琼脂糖(北京鼎国生物技术发展中心)。
二氧化碳培养箱(BNA321D型，美国Toabai Espec公司)。低速离心机(北京医用离心机厂)。-70 ℃冰箱(美国Forma公司)。PCR仪(美国Perkin Elmer公司)。核酸纯度分析仪和低温离心机(美国Beckman公司)。电泳仪(北京六一仪器厂)。图像分析仪(美国Stratagene Eagle eyeⅡ)。
1.2 方法
1.2.1 人RF的原代培养
4例TAO患者，均为男性，年龄分别为44，46，52，54岁。按TAO眼部病变分级(NOSPECS)：5级2例，6级2例。患者行眼眶减压术时，取球后结缔组织(患者知情同意)。正常对照取自眼球萎缩半年内无任何眶内、眼内炎症及TAO表现，行眼球摘除义眼座植入术患者3例，男性1例(50岁)，女性2例(43和45岁)；与TAO患者年龄比较差别无统计学意义(P<0.05)。在手术过程中取球后结缔组织(患者知情同意)。
无菌条件下用含有加抗生素培养基的带盖无菌瓶收集标本，在超净工作台内进行操作，取标本放入平皿，用无菌眼科剪剪下所需组织，去除上面的脂肪组织及凝血块，用无菌生理盐水反复冲洗，直至无血迹为止；将组织转到另一无菌平皿，并用DHanks液冲洗3次，剪成1 mm×1 mm×1 mm组织小块，将组织小块均匀分布铺于培养瓶的底壁上，加入20%小牛血清的RPMI 1640培养基(青霉素10 μg/mL、链霉素100 μg/mL)，使液面刚能盖住组织块而又不致使组织块浮起。放置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中孵育，>48 h 加培养基，以后每隔2～3 d换培养基1次。原代培养经透射电镜证实为RF。
1.2.2 分组
(1)浓度效应：分成6组，为不含rhIFNγ的10% RPMI 1640阴性对照组及含rhIFNγ 50，100，200，400，1000 U/mL的5组。孵育48 h。(2)时间效应：分成5组，为不含rhIFNγ的10% RPMI 1640的阴性对照组，含400 U/mL rhIFNγ的10% RPMI 1640组，分别孵育12，24，48，72 h。
1.2.3 一步法半定量RTPCR
1.2.3.1 总RNA的提取
取2～6代正常人或TAO患者RF按上述分组培养后，用胰酶消化离心，PBS洗涤后再次离心去上清，收集细胞。在含有细胞的Eppendorf管中加入0.5 mL Trizol试剂，振荡混匀，室温放置5 min。加氯仿0.2 mL，振荡混匀，室温放置10 min。4 ℃、12000 r/min 离心15 min，小心吸取上层水相，移入另一Eppendorf管中。加入等体积的异丙醇，振荡混匀，室温放置10 min。4 ℃、12000 r/min离心10 min，弃上清。冰预冷的75%乙醇漂洗沉淀；4 ℃、12000 r/min离心5 min，弃上清。室温干燥10 min，用适量的DEPC处理水溶解沉淀，1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，并测定D(260 nm)、D(280 nm)，计算RNA含量和纯度。
1.2.3.2 RTPCR
CD40引物 Forward Primer：5'CTT CTT CCG ACC GTG ACA TGC3' Reverse Primer：5'ATG GTT CGT CTG CCT CTG CAG3'
扩增后DNA片段长330 bp。
GAPDH引物Forward Primer：5' ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC3'Reverse Primer：5' TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA3'
扩增后DNA片段长452 bp。
RTPCR反应体系及反应条件：总反应体系为25 μL。模板1.0 μL，CD40上游引物1.0 μL，CD40下游引物1.0 μL，GAPDH上游引物1.5 μL，GAPDH下游引物1.5 μL， dNTP 2.5 μL， MgCl2 5.0 μL，RNA buffer 2.5 μL， RNase Inhibiter 0.5 μL， AMVRTase 0.5 μL，Taq DNA Polymerase 0.5 μL，DEPC水7.5 μL。反应条件：50 ℃→30 min→94 ℃→2 min；变性94 ℃→30 s→退火58 ℃→30 s→延伸72 ℃→60 s，30个循环；最后延伸72 ℃ 5 min。
1.3 琼脂糖凝胶电泳
取扩增产物6 μL与6×上样缓冲液1 μL混合，加样。在含有0.005 mL-1溴化乙锭(EB)的1.5%琼脂糖凝胶中电泳，电泳缓冲液为0.5×TBE溶液，时间20～30 min，电压为5 V/cm。与标准分子量比较，鉴定扩增产物。
1.4 图像分析
PCR产物采用图像分析仪进行半定量分析，计算单位为积分光密度。所应用GAPDH的积分光密度作为内对照，得出CD40 mRNA表达的相对比值。本研究以CD40基因表达的相对比值进行统计学分析。
1.5 统计学处理
计量资料用x±s表示，运用SPSS 11.0 for windows统计软件包进行方差分析，在此基础上进行单因素组方差分析，两两比较用LSD法检验。P<0.05为差别有统计学意义。
2 结果
2.1 RNA的提取
可见清晰的28S、18S、5S 3条带。各组细胞总RNA的D(260 nm)/D(280 nm)比值在1.8～2.0，说明提取的总RNA质量好，无明显降解，也无明显的DNA污染，可用于RTPCR等进一步的研究见图1。
2.2 RTPCR半定量分析
2.2.1 CD40浓度效应
不同浓度rhIFNγ作用48 h对正常人和TAO患者的RF CD40的光密度比值的影响见表1和图2。表1 不同浓度重组人干扰素γ作用48 h CD40的光密度比值的比较(略)
3 讨论
CD40是相对分子质量为45～50 kD的Ⅰ型跨膜蛋白，属于TNFR超家族成员，是B淋巴细胞重要的促有丝分裂受体。CD40最先发现于B淋巴细胞表面，但不仅表达于造血系统起源的细胞，而且存在于许多非造血系统起源的细胞如内皮细胞、上皮细胞以及成纤维细胞等多种细胞表面\[35\]。本试验中采用GAPDH作为内对照。因内对照GAPDH与CD40的引物在同一反应体系中共同扩增，因此，无论影响PCR扩增产率的哪个因素改变，对两种产物的影响是一致的，两者扩增产量的比率在扩增反应中会保持一致。表2400 U/mL重组人干扰素γ作用不同时间CD40的光密度比值的比较(略)
本研究表明，正常人和TAO患者RF均表达CD40 mRNA，这与Sempowski等的结果一致\[6\]。因此，可以推测RF可能通过CD40 mRNA的表达，与眼眶炎症后局部浸润的活化T淋巴细胞可能通过CD40与CD40L共刺激通路相互作用。一方面，可能引起更多的免疫细胞的激活；另一方面可能导致RF活化，从而产生TAO的病理组织学改变及典型临床表现。同时发现，正常人和TAO患者RF表达CD40 mRNA无明显差异。这可能说明无论正常人或TAO患者RF均可通过CD40接收和转导信号。与肺、齿龈、滑膜、皮肤、脾等解剖部位RF类似，IFNγ可上调RF CD40 mRNA的水平\[5\]。本研究结果还显示，rhIFNγ诱导RF CD40 mRNA的表达呈时间和剂量依赖性，但正常人和TAO患者RF在同一时间或同一浓度无明显差异。而作为免疫作用的效应细胞和靶细胞的RF具有维持组织器官的结构，参与免疫反应，分泌细胞外基质蛋白的功能。因此，推测CD40对于维持眼眶正常组织功能具有重要意义；而在眼眶炎症微环境中，IFNγ可能上调RF表达CD40，从而可能与眼眶组织内活化的免疫细胞通过CD40与CD40L的相互作用而激活，通过分泌细胞因子及大量的亲水性GAG，引起TAO的发生与发展。故CD40/CD40L有可能代表着一个重要的RF活化通路，有可能是TAO分子致病的基础，抑制或阻断IFNγ上调RF表达CD40 mRNA可能成为治疗TAO提供新的思路。由于受球后结缔组织、特别是TAO患者的球后结缔组织取材的限制。由于本研究观察的例数较少，IFNγ和CD40在TAO发病的具体机制有待于进一步的研究。
参考文献：
[1\]Heufelder A E. Pathogenesis of ophthalmopathy in autoimmune thyroid disease\[J\]. Rev Endocr Metab Disord, 2000,1(12):8795.
[2\]Ajjan R A,Weetman A P. New understanding of the role of cytokines in the pathogenesis of Graves' ophthalmopathy\[J\]. J Endocrinol Invest, 2004,27(3):237245.
[3\]Wagner A H,Guldenzoph B,Lienenluke B,et al. CD154/CD40mediated expression of CD154 in endothelial cells: consequences for endothelial cellmonocyte interaction\[J\]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2004,24(4):715720.
[4\]Dimitriou I D,Kapsogeorgou E K,Moutsopoulos H M,et al. CD40 on salivary gland epithelial cells: high constitutive expression by cultured cells from Sjogren's syndrome patients indicating their intrinsic activation\[J\]. Clin Exp Immunol, 2002,127(2):386392.
[5\]Smith T J. Insights into the role of fibroblasts in human autoimmune diseases\[J\]. Clin Exp Immunol, 2005,141(3):388397.
[6\]Sempowski G D,Rozenblit J,Smith T J,et al. Human orbital fiboblasts are activated through CD40 to induce proinflammatory cytokine production\[J\]. Am J Physiol, 1998,274:c707c714.
基金项目: 福建省自然科学基金资助项目(C0510018)
作者单位: 1.福建医科大学附属协和医院眼科，福州 350001；
2.中南大学湘雅医院眼科，长沙 410008
作者简介: 傅德生(1969～)，男，主治医师，医学博士, 百拇医药(傅德生, 许雪亮)
关键词: 成纤维细胞； 甲状腺相关眼病； 干扰素，重组； 抗原，CD40； 细胞，培养的
The Effects of rhIFNγ Induced CD40 mRNA Expression
in Cultured Human Retroocular Fibroblasts
Fu Desheng, Xu Xueliang
1.Department of Ophathalmology, The Affiliated Union Hospital, Fujian Medical University, Fuzhou 350001, China
2.Department of Ophthalmology, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, China
ABSTRACT: Objective To quantify the mRNA expression of CD40 induced by recombinant human interferon gamma(rhIFNγ) in cultured human retroocular fibroblast(RF) from normal subjects and thyriod associated ophthalmophy(TAO) patients. Methods Half quantifying the mRNA expression of CD40 induced by different concentration and time rhIFNγ in cultured human RF from normal subjects and TAO patients. Results The absorbency values of 100, 200, 400, 1000 U/mL rhIFNγ in RF from normal subjects and TAO patients were increased significantly than negative control and 50 U/mL rhIFNγ group(P<0.01). Both not difference in same concentration. The absorbency values of 12,24,48,72 h of 400 U/mL rhIFNγ in RF from normal subjects and TAO patients， showed significantly different compared with negative control group(P<0.01)，and no difference in same time. Conclusions The cultured human RF from normal subjects and patients with TAO all express CD40 mRNA. The rhIFNγ could upregulate CD40 gene mRNA expression with dosedependence and timedependent in both human RF.
KEY WORDS: fibroblasts; Graves' disease;
甲状腺相关眼病(thyroid associated ophthalmopathy，TAO)在病理组织学特征性表现为眼眶组织内大量亲水性糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)聚集和免疫活性细胞浸润\[1\]。免疫活性细胞产生的炎症介质能上调球后成纤维细胞(retroocular fibroblast，RF)的目的基因，进而改变其生物合成活性，引起TAO的发生、发展，但免疫活性细胞浸润眼眶、免疫活性细胞和RF相互作用最终激活RF的分子机制尚不明确。RF与球后浸润的免疫活性细胞能否通过CD40/CD40L共刺激通路而相互作用，取决于RF是否表达CD40及球后局部微环境对CD40表达的影响；同时组织学证实TAO患者球后组织存在细胞因子γ(interferon gamma，IFNγ) \[2\]。笔者探讨体外培养的正常人和TAO患者RF是否有CD40 mRNA的表达，同时了解重组人干扰素γ(rhIFNγ)对它们表达的影响及两者的差异，探索TAO发病的可能机制。
1 材料与方法
1.1 试剂和仪器
RPMI 1640，DHanks液，胰蛋白酶，EDTA，青霉素，链霉素(均由中南大学分析测试中心、湘雅医学院中心实验室提供)。rhIFNγ(美国Peprotech EC LTD)。MTT(美国Sigma公司)。胎牛血清(武汉丽欣生物公司)。DMSO(美国Sigma公司)。Trizol提取液(美国Invitrogen公司)。DNA100标准物，RTPCR试剂盒，PCR引物，DEPC(北京鼎国生物技术发展中心)。琼脂糖(北京鼎国生物技术发展中心)。
二氧化碳培养箱(BNA321D型，美国Toabai Espec公司)。低速离心机(北京医用离心机厂)。-70 ℃冰箱(美国Forma公司)。PCR仪(美国Perkin Elmer公司)。核酸纯度分析仪和低温离心机(美国Beckman公司)。电泳仪(北京六一仪器厂)。图像分析仪(美国Stratagene Eagle eyeⅡ)。
1.2 方法
1.2.1 人RF的原代培养
4例TAO患者，均为男性，年龄分别为44，46，52，54岁。按TAO眼部病变分级(NOSPECS)：5级2例，6级2例。患者行眼眶减压术时，取球后结缔组织(患者知情同意)。正常对照取自眼球萎缩半年内无任何眶内、眼内炎症及TAO表现，行眼球摘除义眼座植入术患者3例，男性1例(50岁)，女性2例(43和45岁)；与TAO患者年龄比较差别无统计学意义(P<0.05)。在手术过程中取球后结缔组织(患者知情同意)。
无菌条件下用含有加抗生素培养基的带盖无菌瓶收集标本，在超净工作台内进行操作，取标本放入平皿，用无菌眼科剪剪下所需组织，去除上面的脂肪组织及凝血块，用无菌生理盐水反复冲洗，直至无血迹为止；将组织转到另一无菌平皿，并用DHanks液冲洗3次，剪成1 mm×1 mm×1 mm组织小块，将组织小块均匀分布铺于培养瓶的底壁上，加入20%小牛血清的RPMI 1640培养基(青霉素10 μg/mL、链霉素100 μg/mL)，使液面刚能盖住组织块而又不致使组织块浮起。放置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中孵育，>48 h 加培养基，以后每隔2～3 d换培养基1次。原代培养经透射电镜证实为RF。
1.2.2 分组
(1)浓度效应：分成6组，为不含rhIFNγ的10% RPMI 1640阴性对照组及含rhIFNγ 50，100，200，400，1000 U/mL的5组。孵育48 h。(2)时间效应：分成5组，为不含rhIFNγ的10% RPMI 1640的阴性对照组，含400 U/mL rhIFNγ的10% RPMI 1640组，分别孵育12，24，48，72 h。
1.2.3 一步法半定量RTPCR
1.2.3.1 总RNA的提取
取2～6代正常人或TAO患者RF按上述分组培养后，用胰酶消化离心，PBS洗涤后再次离心去上清，收集细胞。在含有细胞的Eppendorf管中加入0.5 mL Trizol试剂，振荡混匀，室温放置5 min。加氯仿0.2 mL，振荡混匀，室温放置10 min。4 ℃、12000 r/min 离心15 min，小心吸取上层水相，移入另一Eppendorf管中。加入等体积的异丙醇，振荡混匀，室温放置10 min。4 ℃、12000 r/min离心10 min，弃上清。冰预冷的75%乙醇漂洗沉淀；4 ℃、12000 r/min离心5 min，弃上清。室温干燥10 min，用适量的DEPC处理水溶解沉淀，1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，并测定D(260 nm)、D(280 nm)，计算RNA含量和纯度。
1.2.3.2 RTPCR
CD40引物 Forward Primer：5'CTT CTT CCG ACC GTG ACA TGC3' Reverse Primer：5'ATG GTT CGT CTG CCT CTG CAG3'
扩增后DNA片段长330 bp。
GAPDH引物Forward Primer：5' ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC3'Reverse Primer：5' TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA3'
扩增后DNA片段长452 bp。
RTPCR反应体系及反应条件：总反应体系为25 μL。模板1.0 μL，CD40上游引物1.0 μL，CD40下游引物1.0 μL，GAPDH上游引物1.5 μL，GAPDH下游引物1.5 μL， dNTP 2.5 μL， MgCl2 5.0 μL，RNA buffer 2.5 μL， RNase Inhibiter 0.5 μL， AMVRTase 0.5 μL，Taq DNA Polymerase 0.5 μL，DEPC水7.5 μL。反应条件：50 ℃→30 min→94 ℃→2 min；变性94 ℃→30 s→退火58 ℃→30 s→延伸72 ℃→60 s，30个循环；最后延伸72 ℃ 5 min。
1.3 琼脂糖凝胶电泳
取扩增产物6 μL与6×上样缓冲液1 μL混合，加样。在含有0.005 mL-1溴化乙锭(EB)的1.5%琼脂糖凝胶中电泳，电泳缓冲液为0.5×TBE溶液，时间20～30 min，电压为5 V/cm。与标准分子量比较，鉴定扩增产物。
1.4 图像分析
PCR产物采用图像分析仪进行半定量分析，计算单位为积分光密度。所应用GAPDH的积分光密度作为内对照，得出CD40 mRNA表达的相对比值。本研究以CD40基因表达的相对比值进行统计学分析。
1.5 统计学处理
计量资料用x±s表示，运用SPSS 11.0 for windows统计软件包进行方差分析，在此基础上进行单因素组方差分析，两两比较用LSD法检验。P<0.05为差别有统计学意义。
2 结果
2.1 RNA的提取
可见清晰的28S、18S、5S 3条带。各组细胞总RNA的D(260 nm)/D(280 nm)比值在1.8～2.0，说明提取的总RNA质量好，无明显降解，也无明显的DNA污染，可用于RTPCR等进一步的研究见图1。
2.2 RTPCR半定量分析
2.2.1 CD40浓度效应
不同浓度rhIFNγ作用48 h对正常人和TAO患者的RF CD40的光密度比值的影响见表1和图2。表1 不同浓度重组人干扰素γ作用48 h CD40的光密度比值的比较(略)
3 讨论
CD40是相对分子质量为45～50 kD的Ⅰ型跨膜蛋白，属于TNFR超家族成员，是B淋巴细胞重要的促有丝分裂受体。CD40最先发现于B淋巴细胞表面，但不仅表达于造血系统起源的细胞，而且存在于许多非造血系统起源的细胞如内皮细胞、上皮细胞以及成纤维细胞等多种细胞表面\[35\]。本试验中采用GAPDH作为内对照。因内对照GAPDH与CD40的引物在同一反应体系中共同扩增，因此，无论影响PCR扩增产率的哪个因素改变，对两种产物的影响是一致的，两者扩增产量的比率在扩增反应中会保持一致。表2400 U/mL重组人干扰素γ作用不同时间CD40的光密度比值的比较(略)
本研究表明，正常人和TAO患者RF均表达CD40 mRNA，这与Sempowski等的结果一致\[6\]。因此，可以推测RF可能通过CD40 mRNA的表达，与眼眶炎症后局部浸润的活化T淋巴细胞可能通过CD40与CD40L共刺激通路相互作用。一方面，可能引起更多的免疫细胞的激活；另一方面可能导致RF活化，从而产生TAO的病理组织学改变及典型临床表现。同时发现，正常人和TAO患者RF表达CD40 mRNA无明显差异。这可能说明无论正常人或TAO患者RF均可通过CD40接收和转导信号。与肺、齿龈、滑膜、皮肤、脾等解剖部位RF类似，IFNγ可上调RF CD40 mRNA的水平\[5\]。本研究结果还显示，rhIFNγ诱导RF CD40 mRNA的表达呈时间和剂量依赖性，但正常人和TAO患者RF在同一时间或同一浓度无明显差异。而作为免疫作用的效应细胞和靶细胞的RF具有维持组织器官的结构，参与免疫反应，分泌细胞外基质蛋白的功能。因此，推测CD40对于维持眼眶正常组织功能具有重要意义；而在眼眶炎症微环境中，IFNγ可能上调RF表达CD40，从而可能与眼眶组织内活化的免疫细胞通过CD40与CD40L的相互作用而激活，通过分泌细胞因子及大量的亲水性GAG，引起TAO的发生与发展。故CD40/CD40L有可能代表着一个重要的RF活化通路，有可能是TAO分子致病的基础，抑制或阻断IFNγ上调RF表达CD40 mRNA可能成为治疗TAO提供新的思路。由于受球后结缔组织、特别是TAO患者的球后结缔组织取材的限制。由于本研究观察的例数较少，IFNγ和CD40在TAO发病的具体机制有待于进一步的研究。
参考文献：
[1\]Heufelder A E. Pathogenesis of ophthalmopathy in autoimmune thyroid disease\[J\]. Rev Endocr Metab Disord, 2000,1(12):8795.
[2\]Ajjan R A,Weetman A P. New understanding of the role of cytokines in the pathogenesis of Graves' ophthalmopathy\[J\]. J Endocrinol Invest, 2004,27(3):237245.
[3\]Wagner A H,Guldenzoph B,Lienenluke B,et al. CD154/CD40mediated expression of CD154 in endothelial cells: consequences for endothelial cellmonocyte interaction\[J\]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2004,24(4):715720.
[4\]Dimitriou I D,Kapsogeorgou E K,Moutsopoulos H M,et al. CD40 on salivary gland epithelial cells: high constitutive expression by cultured cells from Sjogren's syndrome patients indicating their intrinsic activation\[J\]. Clin Exp Immunol, 2002,127(2):386392.
[5\]Smith T J. Insights into the role of fibroblasts in human autoimmune diseases\[J\]. Clin Exp Immunol, 2005,141(3):388397.
[6\]Sempowski G D,Rozenblit J,Smith T J,et al. Human orbital fiboblasts are activated through CD40 to induce proinflammatory cytokine production\[J\]. Am J Physiol, 1998,274:c707c714.
基金项目: 福建省自然科学基金资助项目(C0510018)
作者单位: 1.福建医科大学附属协和医院眼科，福州 350001；
2.中南大学湘雅医院眼科，长沙 410008
作者简介: 傅德生(1969～)，男，主治医师，医学博士, 百拇医药(傅德生, 许雪亮)