江苏地产白首乌C21甾苷抗衰老作用研究

http://www.100md.com 《实用老年医学》 2007年第1期

     【摘要】 目的 研究江苏地产白首乌C21甾苷(C21 steroidal glycoside，CSG)抗氧化、耐缺氧、抗疲劳等抗衰老作用。 方法 以维生素E[VE，100 mg/(kg·d)]为对照，观察CSG低、中、高剂量组[10、20、40 mg/(kg·d)，即CL、CM、CH组]对小鼠常压耐缺氧试验，负重游泳试验和Dgal亚急性衰老模型小鼠的影响。 测定小鼠常压耐缺氧和负重游泳时间，取血清、心、肝、脑组织，黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性，TBA法测定丙二醛(MDA)含量，ELISA法检测端粒酶活性。 结果 与正常对照组相比, CSG和VE能够延长健康小鼠常压耐缺氧和负重游泳时间，提高Dgal模型小鼠血清、心、肝、脑SOD活性，降低MDA含量; 中、高剂量CSG组小鼠血清端粒酶活性升高；3个CSG组及VE组均能升高小鼠心脏端粒酶活性(P<001)；CSG及VE对小鼠肝及脑组织端粒酶活性无影响。 结论 CSG能拮抗自由基损伤,提高健康小鼠常压耐缺氧和负重游泳时间，提高Dgal衰老模型小鼠血清、心、肝、脑组织SOD活性，减少MDA含量，提高心脏组织中端粒酶活性。具有抗氧化，延缓衰老，抗疲劳作用。

    【关键词】 白首乌C21甾苷； SOD； MDA； 端粒酶； 抗衰老

    Study on antiaging effect of C21 steroidal glycoside from the root of cynanchum auriculatum planted in Jiangsu

    ZHANG Shixia，LI Xin， YIN Jiale，CHEN Lili， ZHANG Hongquan.

    The Medical and Pharmaceutical Institute of Yangzhou University,Yangzhou 225001，China

    【Abstract】 Objective To study the antiaging effect of C21 steroidal glycoside (CSG) from the root of cynanchum auriculatum planted in Jiangsu. Methods Weight loading swim test and tolerance of oxygen deficiency test, the superoxide dismutase (SOD) activity test, malon dialdehyde (MDA) content test and telomerase activity test were used to observe the antiaging effect of CSG of different dosages，contrasting to VE group. Resukts After 8week treatment,time of weight loading swim test and tolerance of oxygen deficiency test was more prolonged and SOD activity was increased and MDA level was decreased in CL，CM，CH groups and VE group than in normal group；Telomerase activity in serum in CM，CH groups were increased and cardiac telomerase activity in CL，CM，CH，VE groups were increased，while theres no change of telomerase activity in liver and brain. Conckusions CSG could prompt the ability of antioxidation, antifatigue and antistress, so it may be effective on antiaging.

    【Key words】 C21 steroidal glycoside of Cynanchum auriculatum; SOD; MDA; telomerase; antiaging

    白首乌是中医药中传统的补益药，为萝藦科植物柏氏牛皮消(cynanchum bungei decne)、耳叶牛皮消(cynanchum auriculatum royle ex wight)和隔山消(cynoctonum wilfordii maxim)的块根[1]。研究表明,C21甾体苷类是白首乌主要有效部位，现代药理学研究表明其具有抗肿瘤、增强免疫功能、抗氧化、延缓衰老等多方面的药理功能[2]。研究表明白首乌C21甾苷及甾苷元具有较强的清除羟自由基的能力，可抑制剧烈过度运动所引发的氧化损伤[3]。 本研究从衰老的自由基学说和端粒学说入手,采用健康小鼠和D半乳糖(Dgal)衰老小鼠模型,以抗氧化剂维生素E(VE)作为对照[4]，观察白首乌C21甾苷对健康小鼠耐缺氧和抗疲劳的影响以及其对Dgal模型小鼠的影响,对其抗氧化抗衰老作用机理进行初步探讨。

     1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 动物：3月龄ICR小鼠，清洁级，雌雄各半，体质量26～32 g，由扬州大学实验动物中心提供，实验动物质量合格证号：SCXK(苏)2002-0009。实验室温度18～26 ℃,自然照明，实验前适应环境饲养1周。

    1.1.2 药物：白首乌C21甾苷为江苏滨海产白首乌粗粉经95%乙醇提取，正丁醇等溶剂萃取，萃取液减压回收溶剂得萃取物，萃取物稀释后上大孔树脂(HP20)进行层析，精制而得，临用前用1%的CMCNa配置成混悬液。

    1.1.3 试剂：Dgal(上海试剂二厂，批号981013),维生素E(东海制药厂，批号20050412)，牛血清白蛋白(BSA，中国科学院上海生化所产品),端粒酶活性检测试剂盒(美国BPB公司)，考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)检测试剂盒均由南京建成生物研究所提供，其余试剂均为国产分析纯。

    1.1.4 仪器：722分光光度计(上海精密科学仪器有限公司),PTMR3100D组织匀浆机(瑞士Polytron公司), ELX800UV酶标仪(美国BIOTEK公司)，PTC200 PCR仪(美国MJ公司)，台式低温高速离心机(德国Hettich公司)，BP11OS电子天秤(德国Sartorius公司)，THZ95恒温振荡仪(太仓医疗器械厂)，HHW 21600A电热恒温水温箱(黄石市恒丰医疗器械有限公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 常压耐缺氧试验[5]：健康ICR小鼠60只，分5组，正常对照组(N)、CSG低剂量组(CL)、CSG中剂量组(CM)、CSG高剂量组(CH),VE组, CL、CM、CH组分别按10 mg/(kg·d)、20 mg/(kg·d)、40 mg/(kg·d)的量(容量为02 ml/10 g) 给药，VE按100 mg/(kg·d)给药, 正常对照组喂饲同体积的1%CMCNa溶液，连续灌胃给药10 d, 末次给药1 h后，将小鼠放入250 ml磨口瓶，瓶口以凡士林涂抹密封，瓶内放置10 g钠石灰，以小鼠停止呼吸为标准，观察小鼠常压耐缺氧时间。

    122 负重游泳试验[5]：健康ICR小鼠60只，分组和给药方法同上，末次给药1 h后，给小鼠尾部下2/3处负重其体质量的5%，放入游泳测试箱中，水温25 ℃，水深30 cm，以小鼠头部沉入水面下超过10 s的时间为标准，观察游泳时间。

    123 Dgal亚急性衰老试验

    1.2.3.1 模型制备：按文献[6]方法操作。将Dgal溶于注射用水,浓度10%,注射剂量为001 ml/g小鼠体质量,颈背部皮下注射,每天1次,连续8周。

    1.2.3.2 动物分组与处理：小鼠随机分为6组即N、M、CL、CM、CH、VE，每组8只。M、CL、CM、CH及VE组小鼠依法造模, N组注射同体积的注射用水。在造模的同时给药方法同上。模型组和正常对照组分别喂饲同体积的1%的CMCNa溶液。实验8周后摘眼球取血处死小鼠,分离血清，快速摘取心、肝、脑,在低温条件下进行新鲜组织匀浆、离心,取上清检测。

    1.2.3.3 检测指标及方法： (1)SOD活力测定和MDA含量测定：黄嘌呤氧化酶法测定SOD活力，硫代巴比妥酸法测定MDA含量，考马斯亮蓝显色法测定蛋白含量，具体操作按试剂盒说明进行。(2)端粒酶活性检测:采用PCRELISA法[7]。操作步骤按试剂盒说明书进行,酶标仪450 nm测定吸光度A值。

    124 统计学方法：实验结果采用SPSS 110软件进行处理。2组间均数比较采用t检验；多组间均数比较采用单因素方差分析。

     2 结果

    21 小鼠常压耐缺氧及负重游泳时间比较 CL、CM、CH、VE组均能提高小鼠常压耐缺氧时间，和VE组相比，CH组时间延长差异具有统计学意义(P<001)； CL、CM、CH、VE组均能提高小鼠负重游泳时间，和VE组相比，CH、CM组时间延长差异具有统计学意义(P<001)。见表1。

    表1 小鼠常压耐缺氧及负重游泳时间比较(略)

    注：与N组比较，**P<001；与VE组比较，△△P<001

    22 小鼠Dgal亚急性衰老试验结果

    221 各组小鼠血清、心、脑、肝SOD活力比较 CL、CM、CH、VE组均能提高衰老模型小鼠血清、心、脑、肝SOD活力(P<001)；与VE组比较，CH组血清、肝、脑SOD活力变化无显著差异，CH组心肌SOD活力提高程度高于VE组(P<001)。见表2。心、肝、脑SOD活力均为每毫克蛋白中的含量。

    222 各组小鼠血清、心、脑、肝MDA 含量比较 CL、CM、CH、VE组小鼠血清心、脑、肝MDA含量明显减少(P<001)；与VE组比较，CL、CM、CH组脑中MDA含量显著降低(P<001),血清、心、肝中MDA含量降低程度差异无统计学意义(P>005)。

    表2 各组小鼠血清、心、肝、脑SOD活力比较(略)

    注：与N组比较**P<001；与M组比较，△△P<001；与VE组比较，▲▲P<001

    表3 各组小鼠血清、心、肝、脑中MDA含量比较(略)

    注：与N组比较，**P<001;与M组比较,▲▲P<001;与VE组比较,△△P<001

    233 各组小鼠心、脑、肝组织端粒酶活性比较 在心脏组织中,3个剂量的CSG组和VE组对心脏组织端粒酶活性有明显升高作用, 其中CM组、CH组端粒酶活性提高幅度大于VE组(P<001)，CL组和VE组相比无显著差异(P>005)。在肝脏组织中,3个CSG给药组的端粒酶活性无明显差异(P>005),即CSG和VE对Dgal衰老模型小鼠肝脏组织端粒酶活性无影响。在脑组织中, 端粒酶活性变化均无显著差异(P>005)。

    表4 各组小鼠心、肝、脑组织中端粒酶A值比较(略)

    注：与N组比较，**P<001;与M组比较,△△P<001;与VE组比较，▲▲P<001

     3 讨论

    自由基衰老和非酶促糖基化(NEG)衰老学说认为长期注射Dgal可产生晚期糖基化终末产物(AGE),促进LDL氧化产生大量自由基等使SOD失去抗氧化活性，随着机体的衰老，自由基代谢失衡，过量自由基可氧化生物膜中不饱和脂肪酸，形成脂质过氧化产物MDA，进一步引起一系列生化反应，细胞无法维持正常代谢，造成机体氧化损伤。近年来有研究表明端粒酶活性的表达本身并不是致癌的,而且在正常的人体细胞中适当地激活端粒酶活性可以延长细胞的寿命达到抗衰老的作用[8]。VE为自由基清除剂，有研究表明，VE可以抑制癌细胞端粒酶的活性，从而发挥抗癌作用[9]，防治肿瘤和抗衰老很有可能是通过影响端粒酶活性而达到防治目的[10]。

    白首乌是传统的补益中药，味甘、苦，性微温。功效为补肝肾，强筋骨，益精血。现代药理学研究表明其C21甾甙因为其结构上具有不饱和双键，因此具有体外清除自由基，抗氧化的作用。本研究显示，CSG能够提高健康小鼠常压耐缺氧和负重游泳时间，全面提高Dgal衰老模型小鼠血清、心、肝、脑组织中SOD的活性，降低脂质过氧化代谢产物MDA的含量，和VE对照组相比总体差异不大，有些项目指标甚至优于VE。结果表明CSG通过体内直接清除氧自由基作用和激活机体抗氧化防御系统等作用提高机体的抗氧化作用，减少自由基对机体的损伤，起到延缓衰老,抗疲劳和滋补强健的作用。CSG对Dgal衰老模型小鼠心、肝、脑组织端粒酶活性的影响显示具有明显的器官差异和剂量差别，CSG对小鼠心肌组织端粒酶活性有提高作用，而对肝和脑组织中的端粒酶活性影响不明显，由于药物对端粒酶的作用机制还不甚清楚，结果尚无法确切解释，有待进一步研究证实。但本实验的研究表明调节端粒酶活性，调控细胞代谢状态可能是CSG滋补强身抗衰老的又一作用机制。

    [参考文献]

    [1] Shan L, Liu RH ,Shen YH. et al . Gastroprotective effect of a traditional Chinese herbal drug “Baishouwu” on experimental gastric lesions in rats[J].J Ethnopharmacol，2006，107(3):389394.

    [2] 印敏，冯煦，董云发，等.白首乌化学成分与药理活性研究进展[J].中国野生植物资源，2004，23(2):811.

    [3] 宋俊梅，丁霄霖.白首乌中C21甾甙及甾甙元清除羟自由基的功能[J].无锡轻工业大学学报，1998，17(2):4346.

    [4] Arivazhagan P,Thilakavathy T, Panneerselvam C.Antioxidant lipoate and tissue antioxidants in aged rats[J].Nutritional Biochemistry，2000，11(3):122127.

    [5] 李仪奎.中药药理实验方法学[M].1版.上海：上海科学技术出版社，1991:149.

    [6] 徐叔云,卞如濂,陈修. 药理实验方法学[M].3 版.北京:人民卫生出版社, 2001:14651467.

    [7] Yuan Z,Mei HD. Inhibition of telomerase activity with hTERT antisense increases the effect of CDDP-induced apoptosis inmyeloid leukemia[J]. Hematol J，2003，3(4):201205.

    [8] DE Lange T.Protection of mammalian telomeres[J].Oncogene,2002,21(4):532540.

    [9] Eitsuka T，Nakagawa K，Miyazawa T.Downregulation of telomerase activity in DLD-1 human colorectal adenocarcinoma cells by tocotrienol[J].Biochem Biophys，2006,348(1):170175.

    [10]徐敏，张文高.中药对端粒及端粒酶的影响[J].浙江中西医结合杂志，2004，14(2):127129.

    基金项目：江苏省科技招标项目S 200406005

    作者单位：225001江苏省扬州市，扬州大学医药研究所(张士侠 李心 尹家乐 陈莉莉 张洪泉)

    百拇医药网 http://www.100md.com/html/DirDu/2007/03/10/38/50/75.htm