结合生物工程技术——超临界流体技术发展应用大有潜力
▲关键词解析
超临界流体：是指物质在温度、压力高于临界温度和临界压力时所形成的可压缩性高密度流体，其密度接近液体，黏度接近气体，具有与液体相近的溶解能力和与气体相近的扩散特性。它最显著的性质是其密度随温度和压力的改变而改变，因而可以通过调节温度或压力达到改变其溶解能力的目的。常见的超临界流体介质有二氧化碳、乙烯、乙烷、水等。
超临界流体技术自上世纪70年代崭露头角以来，因其具有环保、高效等显著优势轻松超越传统技术，从最初的单纯萃取扩展到有机合成、化学分析和环境保护等多个领域，而且与化学、生物学等学科交叉发展迅速。近年来，超临界流体技术与生物工程技术相结合的生产工艺出现在制药领域，如超临界流体酶催化、超临界流体发酵、超临界流体灭菌和细胞破碎技术等，显示出了巨大的潜力。
■超临界流体酶催化
超临界流体酶催化技术最早出现于20世纪70年代末。那时广泛采用的有机溶剂如正己烷等，多为有毒物质，易燃易爆、不安全、价格贵，且存在溶剂残留问题。1985年，Hammard率先提出超临界二氧化碳(SCCO2)可作为酶催化酯交换反应的介质，随后十几年来，国外已对十多种酶及其在SCCO2中的反应进行了研究。研究的酶多集中于脂肪酶类，如毛酶脂肪酶、圆柱形假丝酵母脂肪酶等。
, http://www.100md.com
在近二十年的研究中，超临界流体酶催化技术日臻完善。超临界流体酶催化中酶的稳定性和活性是反应的关键因素。酶在水溶液中时，其活性主要受温度和pH值影响；在超临界流体中时，由于流体的可压缩性和极性可变的特点，影响酶活性的因素增多，包括压强、温度、流体种类、含水量等。
提高酶稳定性的方法之一是固定化。酶的固定化技术包括吸附法、交联法、共价法、包埋法等，此外还有分子沉积法和酶晶体交联法等新技术。固定化的载体常见的有硅藻土、氧化铝、硅胶、多孔玻璃、离子交换树脂等，如常见的Novo公司的Lipozyme系列酶就是把来源于微生物Mueormiehei的脂肪酶以吸附法固定于离子交换树脂上的一种应用较广的商品酶。
■超临界流体发酵
应用超临界流体作为整体细胞反应介质的技术晚于超临界酶催化技术，至今只有十多年的历史。人们发现许多化学反应不是由单一的酶催化，而是由许多酶组成的多媒体系共同催化，同时多媒体系的催化效率与其所处的相对位置也有一定关系。这种催化反应需要一些辅酶的参与，因此应用完整细胞发酵，结合强渗透性的超临界流体作为发酵介质成为一种可行的方案。
, 百拇医药
这项技术目前多见于乙醇的发酵提取中。常规的乙醇发酵过程有两个问题需要解决：一是发酵产物乙醇对发酵过程的阻抑，二是发酵反应放热引起的阻抑。目前使用的发酵菌株耐醇性较差，所以只能制得乙醇质量分数为8%～12%的稀溶液，解决办法是选育耐醇菌株，或者边发酵边提取乙醇，使乙醇质量分数始终维持在较低水平。具体方法有：真空发酵、溶剂萃取发酵、使用疏水性分子筛、使用膜生物反应器、使用超临界流体介质、加入蛋白质-磷脂复合体等。
目前，超临界流体发酵存在的主要问题是在高压及高渗环境下，细胞的生理活性和发酵能力会受到很大影响。有报道指出，压力本身对细胞的影响不大，操作时的升降压速率是影响细胞存活率的关键因素，升降压速率越快，细胞存活率越低，处理时间越长，存活率越低。
■灭菌和酶灭活
食品和制药工业中经常需要进行灭菌或酶灭活，以防微生物污染或分解产品，同时防止酶对产品的分解破坏。具体方法有：过热蒸汽法、微波法、紫外线和γ-射线法及加热法，其中除射线法外，其他方法均会因高温对热敏性生物物质产生破坏。
, 百拇医药
以超临界流体处理，可以在比较温和的条件下杀灭微生物和酶，避免因高温消毒引起产品的破坏。SCCO2是各种超临界流体中最具灭菌效果的介质，它可以抽提出微生物细胞内或细胞膜中的功能性物质，破坏细胞膜的完整性；进入微生物细胞内的CO2形成HCO3-离子，使细胞质的酸性增加，pH下降，抑制胞内酶的活性；在急速减压时使细胞内CO2体积迅速膨胀而使细胞破裂。
据报道，在35℃、6兆帕的SCCO2中连续处理样液15分钟，样液流量为20千克/小时，出口瞬间减压，当CO2流量为0.5千克/小时，可全部杀灭乳酸菌，当CO2流量增加到1.0千克/小时以上时，大肠杆菌和酵母菌被全部杀灭。在酶灭活方面，40℃、20兆帕、30分钟的SCCO2处理可使小麦胚芽中的脂肪氧化酶全部失活，60℃、13.7兆帕、25分钟的SCCO2处理可使桔汁中的果胶酶全部失活。
■细胞破碎
传统的细胞破碎技术有：高压匀浆法、高速球磨法、超声波法、酶法、化学法和渗透压法等，但各种方法均存在一定缺点，如高压匀浆法、高速球磨法、超声波法在操作中会产生大量的热，对一些生物活性物质产生破坏；酶法(如加入纤溶酶)、化学法(如酸热法)和渗透压法会不可避免地引入杂质，处理能力也偏小。
, 百拇医药
超临界流体细胞破碎技术可以较好地解决上述问题。高压CO2易于渗透到细胞内，突然降压使细胞内外压差急剧增大而膨胀破裂，适于细胞壁较厚的微生物。因CO2能破坏胞壁上的脂溶性成分，降压时破裂发生在一定位置，使破碎后的细胞碎片较大，便于下游分离，同时在降压过程中流体体积膨胀，温度降低，可防止因升温引起的生物活性物质失活。
如以超临界一氧化二氮处理酿酒酵母细胞，35兆帕、40℃、25分钟蛋白释放率可达27%，核酸释放率达67%；对于大肠杆菌，蛋白释放率达17%，核酸释放率达51%；对于枯草芽孢杆菌，核酸释放率达21%。
综上所述，与制药工艺中使用的传统技术相比，超临界流体技术在生物工程领域的应用大有潜力，当然这还需要研究人员不断进行深入的探索，解决技术层面的问题。
(肖京力周丽莉礼彤), 百拇医药(肖京力；周丽莉；礼彤)
超临界流体：是指物质在温度、压力高于临界温度和临界压力时所形成的可压缩性高密度流体，其密度接近液体，黏度接近气体，具有与液体相近的溶解能力和与气体相近的扩散特性。它最显著的性质是其密度随温度和压力的改变而改变，因而可以通过调节温度或压力达到改变其溶解能力的目的。常见的超临界流体介质有二氧化碳、乙烯、乙烷、水等。
超临界流体技术自上世纪70年代崭露头角以来，因其具有环保、高效等显著优势轻松超越传统技术，从最初的单纯萃取扩展到有机合成、化学分析和环境保护等多个领域，而且与化学、生物学等学科交叉发展迅速。近年来，超临界流体技术与生物工程技术相结合的生产工艺出现在制药领域，如超临界流体酶催化、超临界流体发酵、超临界流体灭菌和细胞破碎技术等，显示出了巨大的潜力。
■超临界流体酶催化
超临界流体酶催化技术最早出现于20世纪70年代末。那时广泛采用的有机溶剂如正己烷等，多为有毒物质，易燃易爆、不安全、价格贵，且存在溶剂残留问题。1985年，Hammard率先提出超临界二氧化碳(SCCO2)可作为酶催化酯交换反应的介质，随后十几年来，国外已对十多种酶及其在SCCO2中的反应进行了研究。研究的酶多集中于脂肪酶类，如毛酶脂肪酶、圆柱形假丝酵母脂肪酶等。
, http://www.100md.com
在近二十年的研究中，超临界流体酶催化技术日臻完善。超临界流体酶催化中酶的稳定性和活性是反应的关键因素。酶在水溶液中时，其活性主要受温度和pH值影响；在超临界流体中时，由于流体的可压缩性和极性可变的特点，影响酶活性的因素增多，包括压强、温度、流体种类、含水量等。
提高酶稳定性的方法之一是固定化。酶的固定化技术包括吸附法、交联法、共价法、包埋法等，此外还有分子沉积法和酶晶体交联法等新技术。固定化的载体常见的有硅藻土、氧化铝、硅胶、多孔玻璃、离子交换树脂等，如常见的Novo公司的Lipozyme系列酶就是把来源于微生物Mueormiehei的脂肪酶以吸附法固定于离子交换树脂上的一种应用较广的商品酶。
■超临界流体发酵
应用超临界流体作为整体细胞反应介质的技术晚于超临界酶催化技术，至今只有十多年的历史。人们发现许多化学反应不是由单一的酶催化，而是由许多酶组成的多媒体系共同催化，同时多媒体系的催化效率与其所处的相对位置也有一定关系。这种催化反应需要一些辅酶的参与，因此应用完整细胞发酵，结合强渗透性的超临界流体作为发酵介质成为一种可行的方案。
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这项技术目前多见于乙醇的发酵提取中。常规的乙醇发酵过程有两个问题需要解决：一是发酵产物乙醇对发酵过程的阻抑，二是发酵反应放热引起的阻抑。目前使用的发酵菌株耐醇性较差，所以只能制得乙醇质量分数为8%～12%的稀溶液，解决办法是选育耐醇菌株，或者边发酵边提取乙醇，使乙醇质量分数始终维持在较低水平。具体方法有：真空发酵、溶剂萃取发酵、使用疏水性分子筛、使用膜生物反应器、使用超临界流体介质、加入蛋白质-磷脂复合体等。
目前，超临界流体发酵存在的主要问题是在高压及高渗环境下，细胞的生理活性和发酵能力会受到很大影响。有报道指出，压力本身对细胞的影响不大，操作时的升降压速率是影响细胞存活率的关键因素，升降压速率越快，细胞存活率越低，处理时间越长，存活率越低。
■灭菌和酶灭活
食品和制药工业中经常需要进行灭菌或酶灭活，以防微生物污染或分解产品，同时防止酶对产品的分解破坏。具体方法有：过热蒸汽法、微波法、紫外线和γ-射线法及加热法，其中除射线法外，其他方法均会因高温对热敏性生物物质产生破坏。
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以超临界流体处理，可以在比较温和的条件下杀灭微生物和酶，避免因高温消毒引起产品的破坏。SCCO2是各种超临界流体中最具灭菌效果的介质，它可以抽提出微生物细胞内或细胞膜中的功能性物质，破坏细胞膜的完整性；进入微生物细胞内的CO2形成HCO3-离子，使细胞质的酸性增加，pH下降，抑制胞内酶的活性；在急速减压时使细胞内CO2体积迅速膨胀而使细胞破裂。
据报道，在35℃、6兆帕的SCCO2中连续处理样液15分钟，样液流量为20千克/小时，出口瞬间减压，当CO2流量为0.5千克/小时，可全部杀灭乳酸菌，当CO2流量增加到1.0千克/小时以上时，大肠杆菌和酵母菌被全部杀灭。在酶灭活方面，40℃、20兆帕、30分钟的SCCO2处理可使小麦胚芽中的脂肪氧化酶全部失活，60℃、13.7兆帕、25分钟的SCCO2处理可使桔汁中的果胶酶全部失活。
■细胞破碎
传统的细胞破碎技术有：高压匀浆法、高速球磨法、超声波法、酶法、化学法和渗透压法等，但各种方法均存在一定缺点，如高压匀浆法、高速球磨法、超声波法在操作中会产生大量的热，对一些生物活性物质产生破坏；酶法(如加入纤溶酶)、化学法(如酸热法)和渗透压法会不可避免地引入杂质，处理能力也偏小。
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超临界流体细胞破碎技术可以较好地解决上述问题。高压CO2易于渗透到细胞内，突然降压使细胞内外压差急剧增大而膨胀破裂，适于细胞壁较厚的微生物。因CO2能破坏胞壁上的脂溶性成分，降压时破裂发生在一定位置，使破碎后的细胞碎片较大，便于下游分离，同时在降压过程中流体体积膨胀，温度降低，可防止因升温引起的生物活性物质失活。
如以超临界一氧化二氮处理酿酒酵母细胞，35兆帕、40℃、25分钟蛋白释放率可达27%，核酸释放率达67%；对于大肠杆菌，蛋白释放率达17%，核酸释放率达51%；对于枯草芽孢杆菌，核酸释放率达21%。
综上所述，与制药工艺中使用的传统技术相比，超临界流体技术在生物工程领域的应用大有潜力，当然这还需要研究人员不断进行深入的探索，解决技术层面的问题。
(肖京力周丽莉礼彤), 百拇医药(肖京力；周丽莉；礼彤)