精神分裂症患者伏隔核的DARPP32及其磷酸化水平
摘要: 目的 探讨DARPP32蛋白及其苏氨酸磷酸化水平和精神分裂症症状的关系。 方法 取17例精神分裂症患者(I型7例,Ⅱ型10例)和9例对照组的脑组织,蛋白质免疫印迹法测定伏隔核中DARPP32、34PDARPP32和75PDARPP32的水平。 结果 在脑的伏隔核,对照组、I型组、Ⅱ型组的DARPP32分别为(1000±73)、(708±47)和(962±58),(单因素方差分析P<005); 34PDARPP32分别为(1000±87)、(663±70)和(1020±92),(单因素方差分析，P<005);而75PDARPP32分别为(1000±199)、(798±70)和(1181±220),(单因素方差分析，P>005)。 结论 DARPP32及其在34苏氨酸磷酸化程度的减少和精神分裂症的阳性症状有关。
关键词: DARPP32； 精神分裂症; 伏隔核; 神经组织蛋白质类; 磷酸蛋白类
2002年,Albert等发现精神分裂症患者前额叶的DARPP32 (dopamine and cAMPregulated phosphoprotein,32 kD)蛋白明显减少[1],提示在与精神分裂症症状关系密切的伏隔核,DARPP32及其磷酸化功能可能存在异常。为了明确伏隔核的DARPP32及其磷酸化功能和精神分裂症症状的关系,笔者用蛋白质免疫印迹定量法测定精神分裂症患者伏隔核的DARPP32、34磷酸苏氨酸DARPP32(34PDARPP32)和75磷酸苏氨酸DARPP32(75PDARPP32)的水平。
1 对象与方法
11 对象 脑标本由日本神户大学研究生院医学研究科神经精神病学讲座提供,其中包括17例精神分裂症患者和9例无神经精神病史的对照组。对精神分裂症的诊断由两名以上精神科医师依据DSMⅣ诊断标准进行[2]。精神分裂症患者中,7例属于Ⅰ型精神分裂症(男性3例,女性4例),10例为Ⅱ型精神分裂症(男性6例,女性4例);对照组中,男性8例,女性1例。对照组、Ⅰ型组和Ⅱ型组死亡时年龄[(579±43),(653±34),(592±43)岁]、死后解剖时间[(78±24),(124±31),(158±34)h]的差别无统计学意义(P>005,多个独立样本非参数检验)。Ⅰ型组和Ⅱ型组的病程[(286±35),(331±56)年]及治疗时间[(171±33),(197±29)年]的差别也无统计学意义(P>005,两个独立样本非参数检验)。死亡原因中,精神分裂症患者以心衰和胃癌为主,对照组以出血和心衰为主。
12 方法
121 取材 脑标本升温至-20 ℃,切取伏隔核组织块,以10倍于组织块容积的50 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸(TrisCl)缓冲溶液(pH 74,25 ℃)把脑组织块制成脑组织匀浆,再保存于-80 ℃冰箱中备用[3]。
122 蛋白质免疫印迹定量 分别取以上样品蛋白质10 μg,在125%SDSPAGE凝胶[W(样品)/V(凝胶)]上电泳分离,然后把凝胶上蛋白质转移到PVDF膜上。室温下PVDF膜先被杂交于DARPP32(1∶100 0)、34PDARPP32(1∶500)或75PDARPP32(1∶500)特异性抗体(美国Cell Signaling Technology公司)90 min,再和经过辣根过氧化物酶标记的二抗杂交30 min,最后用Enhanced Chemiluminescence(ECL)System(英国Amersham公司)让免疫印迹条带曝光于胶片上。胶片中的各免疫印迹条带的浓度作为目的蛋白质的相对量[3]。
13 统计学处理 各组测定值取x±sx。单因素方差分析检验3组间统计学差异,差异有统计学意义时行2组间独立样本t检验。
2 结果
在伏隔核,Ⅰ型组DARPP32含量较对照组(P<0001)和Ⅱ型组(P<001)明显减少;Ⅰ型组34PDARPP32较对照组(P<005)和Ⅱ型组(P<001)明显减少。Ⅰ型组DARPP32和34PDARPP32含量变化存在明显正相关(P<005)(图1)。在对照组、Ⅰ型组和Ⅱ型组之间,75PDARPP32含量差别无统计学意义(P>005)(表1)。17例精神分裂症患者中，11例死亡之前坚持服用典型性抗精神病药物,6例患者死亡前>3个月未服用典型性抗精神病药物。这2组患者DARPP32、34PDARPP32和75PDARPP32含量差别无统计学意义(P>005)。
蛋白质含量是以对照组均值为100的相对量(纵轴) C:对照组； I:I型精神分裂症； Ⅱ:Ⅱ型精神分裂症 2组间比较：☆:P<005,☆☆:P<001,☆☆☆:P<0001
图1 精神分裂症患者伏隔核DARPP32和34PDARPP32水平(略)
表1 伏隔核DARPP32及其磷酸化水平(略)
3组单因素方差分析检验,☆:P< 005
3 讨论
DARPP32主要有34和75两个苏氨酸磷酸化位点,这两个位点的磷酸化水平是调节多巴胺受体介导的神经细胞内信息传递功能的重要步骤。其中,多巴胺D2受体的激活可以经过减少细胞内cAMP的产生而抑制DARPP32在34位点苏氨酸的磷酸化,最后影响神经细胞生理功能。DARPP32在75苏氨酸的磷酸化需要通过抑制34苏氨酸的磷酸化来影响细胞功能[4]。Svenningsson用丙氨酸替代DARPP32中的34苏氨酸或75苏氨酸,制作基因变异老鼠,发现用丙氨酸替代DARPP32的34苏氨酸,不仅能够抑制老鼠对苯丙胺(多巴胺受体激动剂)刺激的行为反应,而且能明显减少DARPP32下游的信息反应;而用丙氨酸替代DARPP32的75苏氨酸的老鼠则没有这些变化[5],说明从多巴胺功能变化到动物行为改变之间的信息联络和DARPP32的34苏氨酸有关。Ⅰ型精神分裂症患者表现为明显的中枢多巴胺神经功能亢进现象,特别是拥有丰富多巴胺神经投射的伏隔核,多巴胺D2受体的数量明显增加,该量的增加和患者生前的阳性症状程度呈正相关[6]。因此,Ⅰ型精神分裂症患者伏隔核DARPP32在34苏氨酸磷酸化程度的减少,可能是该脑部位多巴胺D2受体功能亢进的结果。至于Ⅰ型精神分裂症患者伏隔核的DARPP32与34PDARPP32呈正相关性减少,可能是DARPP32对34苏氨酸低磷酸化状态的适应性变化的结果。笔者的研究还表明,在连续服用典型性抗精神病药物的患者和死亡前>3个月未服用典型性抗精神病药物患者之间,DARPP32及34PDARPP32的差别无统计学意义,说明Ⅰ型精神分裂症DARPP32和34PDARPP32含量减少,与长期使用抗精神病药物无关。笔者推测,在Ⅰ型精神分裂症患者的伏隔核,由于多巴胺D2受体机能亢进导致DARPP32在34苏氨酸位点的低磷酸化,可能是精神分裂症阳性症状发生的神经病理途径之一。
参考文献:
[1] Albert KA,Hemmings HC Jr,Adamo AI,et al Evidence for decreased DARPP32 in the prefrontal cortex of patients with schizophrenia[J] Arch Gen Psychiatry,2002, 59(8):705712
[2] American Psychiatric Association Diagnostic and statistical manual of mental disorders[M] 4th EdWashington DC:American Psychiatric Association, 1994:1821
[3] Lin XH,Kitamura N,Hashimoto T,et al Opposite changes in phosphoinositidespecific phospholipase C immunoreactivity in the left prefrontal and superior temporal cortex of patients with chronic schizophrenia[J] Biol Psychiat, 1999,46(12):16651671
[4] Greengard P,Allen PB,Nairn AC Beyond the dopamine receptor: the DARPP32/protein phosphatase cascade[J].Neuron, 1999,23(3):435447
[5] Svenningsson P,Tzavara ET,Carruthers R,et al Diverse psychotomimetics act through a common signaling pathway[J] Science, 2003,302:14121415
[6] 沈渔邨 精神病学[M] 3版 北京:人民卫生出版社, 2001:396
(编辑：曹 延)
基金项目: 福建省教育厅科研基金资助项目(JB03162)
作者单位: 福建医科大学 心理学教研室, 福州 350004, http://www.100md.com(林贤浩)
关键词: DARPP32； 精神分裂症; 伏隔核; 神经组织蛋白质类; 磷酸蛋白类
2002年,Albert等发现精神分裂症患者前额叶的DARPP32 (dopamine and cAMPregulated phosphoprotein,32 kD)蛋白明显减少[1],提示在与精神分裂症症状关系密切的伏隔核,DARPP32及其磷酸化功能可能存在异常。为了明确伏隔核的DARPP32及其磷酸化功能和精神分裂症症状的关系,笔者用蛋白质免疫印迹定量法测定精神分裂症患者伏隔核的DARPP32、34磷酸苏氨酸DARPP32(34PDARPP32)和75磷酸苏氨酸DARPP32(75PDARPP32)的水平。
1 对象与方法
11 对象 脑标本由日本神户大学研究生院医学研究科神经精神病学讲座提供,其中包括17例精神分裂症患者和9例无神经精神病史的对照组。对精神分裂症的诊断由两名以上精神科医师依据DSMⅣ诊断标准进行[2]。精神分裂症患者中,7例属于Ⅰ型精神分裂症(男性3例,女性4例),10例为Ⅱ型精神分裂症(男性6例,女性4例);对照组中,男性8例,女性1例。对照组、Ⅰ型组和Ⅱ型组死亡时年龄[(579±43),(653±34),(592±43)岁]、死后解剖时间[(78±24),(124±31),(158±34)h]的差别无统计学意义(P>005,多个独立样本非参数检验)。Ⅰ型组和Ⅱ型组的病程[(286±35),(331±56)年]及治疗时间[(171±33),(197±29)年]的差别也无统计学意义(P>005,两个独立样本非参数检验)。死亡原因中,精神分裂症患者以心衰和胃癌为主,对照组以出血和心衰为主。
12 方法
121 取材 脑标本升温至-20 ℃,切取伏隔核组织块,以10倍于组织块容积的50 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸(TrisCl)缓冲溶液(pH 74,25 ℃)把脑组织块制成脑组织匀浆,再保存于-80 ℃冰箱中备用[3]。
122 蛋白质免疫印迹定量 分别取以上样品蛋白质10 μg,在125%SDSPAGE凝胶[W(样品)/V(凝胶)]上电泳分离,然后把凝胶上蛋白质转移到PVDF膜上。室温下PVDF膜先被杂交于DARPP32(1∶100 0)、34PDARPP32(1∶500)或75PDARPP32(1∶500)特异性抗体(美国Cell Signaling Technology公司)90 min,再和经过辣根过氧化物酶标记的二抗杂交30 min,最后用Enhanced Chemiluminescence(ECL)System(英国Amersham公司)让免疫印迹条带曝光于胶片上。胶片中的各免疫印迹条带的浓度作为目的蛋白质的相对量[3]。
13 统计学处理 各组测定值取x±sx。单因素方差分析检验3组间统计学差异,差异有统计学意义时行2组间独立样本t检验。
2 结果
在伏隔核,Ⅰ型组DARPP32含量较对照组(P<0001)和Ⅱ型组(P<001)明显减少;Ⅰ型组34PDARPP32较对照组(P<005)和Ⅱ型组(P<001)明显减少。Ⅰ型组DARPP32和34PDARPP32含量变化存在明显正相关(P<005)(图1)。在对照组、Ⅰ型组和Ⅱ型组之间,75PDARPP32含量差别无统计学意义(P>005)(表1)。17例精神分裂症患者中，11例死亡之前坚持服用典型性抗精神病药物,6例患者死亡前>3个月未服用典型性抗精神病药物。这2组患者DARPP32、34PDARPP32和75PDARPP32含量差别无统计学意义(P>005)。
蛋白质含量是以对照组均值为100的相对量(纵轴) C:对照组； I:I型精神分裂症； Ⅱ:Ⅱ型精神分裂症 2组间比较：☆:P<005,☆☆:P<001,☆☆☆:P<0001
图1 精神分裂症患者伏隔核DARPP32和34PDARPP32水平(略)
表1 伏隔核DARPP32及其磷酸化水平(略)
3组单因素方差分析检验,☆:P< 005
3 讨论
DARPP32主要有34和75两个苏氨酸磷酸化位点,这两个位点的磷酸化水平是调节多巴胺受体介导的神经细胞内信息传递功能的重要步骤。其中,多巴胺D2受体的激活可以经过减少细胞内cAMP的产生而抑制DARPP32在34位点苏氨酸的磷酸化,最后影响神经细胞生理功能。DARPP32在75苏氨酸的磷酸化需要通过抑制34苏氨酸的磷酸化来影响细胞功能[4]。Svenningsson用丙氨酸替代DARPP32中的34苏氨酸或75苏氨酸,制作基因变异老鼠,发现用丙氨酸替代DARPP32的34苏氨酸,不仅能够抑制老鼠对苯丙胺(多巴胺受体激动剂)刺激的行为反应,而且能明显减少DARPP32下游的信息反应;而用丙氨酸替代DARPP32的75苏氨酸的老鼠则没有这些变化[5],说明从多巴胺功能变化到动物行为改变之间的信息联络和DARPP32的34苏氨酸有关。Ⅰ型精神分裂症患者表现为明显的中枢多巴胺神经功能亢进现象,特别是拥有丰富多巴胺神经投射的伏隔核,多巴胺D2受体的数量明显增加,该量的增加和患者生前的阳性症状程度呈正相关[6]。因此,Ⅰ型精神分裂症患者伏隔核DARPP32在34苏氨酸磷酸化程度的减少,可能是该脑部位多巴胺D2受体功能亢进的结果。至于Ⅰ型精神分裂症患者伏隔核的DARPP32与34PDARPP32呈正相关性减少,可能是DARPP32对34苏氨酸低磷酸化状态的适应性变化的结果。笔者的研究还表明,在连续服用典型性抗精神病药物的患者和死亡前>3个月未服用典型性抗精神病药物患者之间,DARPP32及34PDARPP32的差别无统计学意义,说明Ⅰ型精神分裂症DARPP32和34PDARPP32含量减少,与长期使用抗精神病药物无关。笔者推测,在Ⅰ型精神分裂症患者的伏隔核,由于多巴胺D2受体机能亢进导致DARPP32在34苏氨酸位点的低磷酸化,可能是精神分裂症阳性症状发生的神经病理途径之一。
参考文献:
[1] Albert KA,Hemmings HC Jr,Adamo AI,et al Evidence for decreased DARPP32 in the prefrontal cortex of patients with schizophrenia[J] Arch Gen Psychiatry,2002, 59(8):705712
[2] American Psychiatric Association Diagnostic and statistical manual of mental disorders[M] 4th EdWashington DC:American Psychiatric Association, 1994:1821
[3] Lin XH,Kitamura N,Hashimoto T,et al Opposite changes in phosphoinositidespecific phospholipase C immunoreactivity in the left prefrontal and superior temporal cortex of patients with chronic schizophrenia[J] Biol Psychiat, 1999,46(12):16651671
[4] Greengard P,Allen PB,Nairn AC Beyond the dopamine receptor: the DARPP32/protein phosphatase cascade[J].Neuron, 1999,23(3):435447
[5] Svenningsson P,Tzavara ET,Carruthers R,et al Diverse psychotomimetics act through a common signaling pathway[J] Science, 2003,302:14121415
[6] 沈渔邨 精神病学[M] 3版 北京:人民卫生出版社, 2001:396
(编辑：曹 延)
基金项目: 福建省教育厅科研基金资助项目(JB03162)
作者单位: 福建医科大学 心理学教研室, 福州 350004, http://www.100md.com(林贤浩)