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编号:11476934
洛沙坦对肝纤维化大鼠AngⅡ1型受体的表达及胶原形成的影响
http://www.100md.com 2007年8月9日 《第四军医大学学报》
     Effects of losartan intervention on regulation of collagen expression by angiotensin Ⅱ type 1 receptor in liver fibrosis rat models

    WANG WeiWei, YANG XiShan, LI Xu, WANG Jie, TIAN Ye, LAI HuangWen, YANG ChuanHong, LAI RiQuan

    1Department of Gastroenterology, General Hospital, Guangzhou Military Area Command, Guangzhou 510010, China, 2Institute for Digestive Diseases of PLA, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China
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    【Abstract】 AIM: To investigate the expression of angiotensin Ⅱ type 1 receptor (AT1R) and the effects of losartan intervention on the synthesis of collagen. METHODS: Thirtysix Wister rats were randomly divided into three groups: healthy control group (A), fibrosis model group ( B ) and fibrosis + losartan intervention group (C ). All rats, except the rats in control group, were given subcutaneous injection of 40% carbon tetrachloride (once every 3 days for 6 weeks). The rats in group C were also given losartan of 10 mg/kg daily for 6 weeks via gastrogarage, respectively. At the end of the sixth week, all rats were sacrificed . Van Giesion collagen staining was used to evaluate the extracellular matrix of the liver tissues and the ultrastructures of liver were observed by electron microscopy. The expression of AT1R was detected by indirect immunofluorescent microscopy and the protein or mRNA expression of collagenⅠ, Ⅲ in liver tissues was observed using immunohistochemistry or in situ hybridization methods. The relative contents of collagenⅠ, Ⅲ and procollagenⅠ, Ⅲ mRNA in liver tissues were calculated by image analyzer. RESULTS: ① Under light microscopy, the fibrotic degrees in group C were significantly lower than those in group B (P<0.05). ② The AT1R positive cells in group B significantly increased than those in group A (P<0.01), but in group C they decreased significantly than those in group B (P<0.01). ③ CollagenⅠ, Ⅲ and procollagenⅠ, Ⅲ mRNA expressions in liver tissues significantly increased in group B than those in group A(P<0.01, P<0.05), but in group C they decreased significantly than those in group B (P<0.01, P< 0.05). ④ Significantly positive correlations were found between the AT1R and collagenⅠ, Ⅲ expressions (P<0.01, 0.01), and between the procollagenⅠ, Ⅲ mRNA expressions (P<0.01, 0.01). CONCLUSION: Losartan can reduce the collagen expression by inhibiting AngⅡand its receptor AT1R.
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    【Keywords】 losartan; receptors, angiotensin; liver fibrosis; collagen

    【摘要】 目的: 观察洛沙坦对血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)在肝纤维化大鼠模型中的表达及胶原形成作用的影响. 方法: 大鼠肝实质损伤性纤维化模型由四氯化碳(CCl4)诱导. 36只 Wister大鼠随机分为3组:A组(对照组)、B组(肝纤维化模型组)、C组(洛沙坦干预组),每组12只. 除对照组外所有大鼠均给予皮下注射400 mL/L CCl4(精致橄榄油配制,每3日1次,共6 wk). 对照组注射等体积的精致橄榄油. 洛沙坦干预组同时给予洛沙坦(洛沙坦50 mg/kg溶于2 mL蒸馏水)灌胃,1次/d,至6 wk. 实验结束后处死大鼠留取肝组织,利用VG染色对肝组织胶原表达及纤维化程度进行评价. 采用透射电镜、间接免疫荧光法、免疫组化、原位杂交等方法观察肝窦区超微结构、肝组织AT1R表达、Ⅰ, Ⅲ 型胶原和 Ⅰ,Ⅲ 型前胶原基因表达的变化. 结果: ①光镜下观察,C组大鼠肝纤维化程度较B组明显减轻(P<0.05). ②B组大鼠肝组织AT1R阳性表达细胞数显著高于A组(P<0.01), C组大鼠AT1R阳性表达细胞数显著低于B组(P<0.01). ③免疫组化和原位杂交显示,B组大鼠肝组织Ⅰ, Ⅲ型胶原和Ⅰ, Ⅲ型前胶原mRNA的平均吸光度(IA)值较A组明显升高(P<0.01,P<0.05),C组较B组降低(P<0.01,P<0.05). ④肝组织AT1R的表达与肝窦区Ⅰ,Ⅲ型前胶原mRNA及蛋白表达呈正相关(r值分别为0.942,0.658,0.859和0.501,P<0.01). 结论: 洛沙坦通过抑制血管紧张素Ⅱ及其受体的作用减少胶原的生成.
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    【关键词】 洛沙坦;受体,血管紧张素;肝纤维化;胶原

    0引言

    近年来局部组织AngⅡ在器官及组织纤维化中的作用日益受到重视,研究表明AngⅡ对心脏及动脉血管的细胞增殖有直接作用,它能刺激血管平滑肌细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的合成与沉积,导致管壁纤维化[1]. 在肝纤维化方面,用AngⅡ受体拮抗剂candesartan治疗肝纤维化大鼠,可减轻大鼠肝纤维化,降低肝纤维化血清标志物和转化因子β(TGFβ)mRNA等的表达水平[2]. 而这些作用是通过不同器官组织的AngⅡ受体实现的,其中主要起生物学效应的是(AT1R). 我们通过观察肝纤维化大鼠模型AT1R表达与胶原形成的关系及洛沙坦对其干预的影响,为阐明肝纤维化发病机制中局部组织AngⅡ的作用提供实验资料.

    1材料和方法

    1.1材料
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    清洁Wister大鼠(第一军医大学实验动物中心提供)36只,雌雄各半,体质量200~250 g. 随机分为3组,每组12只,雌雄各半. 400 mL/L四氯化碳(CCl4)用精制橄榄油配制. AngⅡ1型受体阻断剂洛沙坦由默沙东医药公司提供. 模型组(B)和洛沙坦干预组(C)大鼠皮下注射400 mL/L CCl4 3 mL/kg(首剂加倍),每1次/3 d,共6 wk. 对照组(A)注射等剂量的精制橄榄油. 洛沙坦干预组给予洛沙坦(洛沙坦50 mg/kg溶于2 mL蒸馏水)灌胃,1次/d. 模型组和对照组灌以等剂量的生理盐水. 用药至CCl4造模结束(6 wk).

    1.2方法

    处死大鼠,取出肝组织,40 g/L多聚甲醛PBS缓冲液固定,制成石蜡切片,约4 μm,行HE, VG染色,在光镜下观察肝脏组织细胞形态及纤维化形成情况. 根据其纤维结缔组织增生程度分为0~4级[3]. 0级:无纤维化;Ⅰ级:极少量纤维结缔组织仅局限于汇管区;Ⅱ级:纤维结缔组织增生进入肝小叶;Ⅲ级:纤维结缔组织进入肝小叶中央静脉周围;Ⅳ级:纤维结缔组织在小叶间弥漫性增生,有假小叶形成. 取1 mm×1 mm×1 mm大小的肝组织2~3块(每组取6只大鼠),用25 mL/L戊二醛做前固定,10 g/L锇酸做后固定,EPON812包埋,LKBV型超薄切片机切片,常规染色,H600型透射电镜观察并拍照.
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    1.2.1AT1R间接免疫荧光检测将部分大鼠肝组织迅速置于丙酮中固定,采用SM2400型冰冻切片机在-18℃下切片,切片厚度为6 μm,切片置-20℃冰箱冻存. 第一抗体选用鼠抗AT1R的mAb(美国Santa Cruz公司),二抗及检测试剂盒为荧光标记的FITC试剂盒(美国Santa Cruz公司),1 g/L伊文蓝衬染1 min,封片. 荧光显微镜下观察,细胞胞质内反射出明亮的黄绿色荧光为阳性. 以每高倍视野平均阳性细胞数(PC/Hp)作为AT1R的相对表达量.

    1.2.2Ⅰ, Ⅲ型胶原的免疫组化检测用40 g/L多聚甲醛PBS缓冲液固定后行Ⅰ, Ⅲ型胶原的免疫组化染色. 一抗为Ⅰ, Ⅲ型胶原兔抗鼠多克隆抗体(美国Santa Cruz公司),二抗及检测试剂盒为SABC工作液,DAB显色,苏木素衬染,阳性结果呈棕黄色. 每只大鼠选一张肝组织切片,每张切片摄片25幅,将从25幅照片获得的体视学参数值,用体视学图像分析软件(第一军医大学研制)检测Ⅰ, Ⅲ型胶原含量,用阳性单位(PU)表示.
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    1.2.3Ⅰ, Ⅲ型前胶原mRNA的原位杂交采用地高辛标记的Ⅰ,Ⅲ型胶原寡核苷酸探针(购自武汉博士德生物工程有限公司). Ⅰ型胶原寡核苷酸探针序列为:CACAGATCACGTCATCGCACAACACCTTGCCGTTG, AGCTTCACCGGGACGACCAGCTTCACCAGGAGATC, TCACTCCTTCTACATTATATTCAAACTGGCTGCCA. Ⅲ型胶原寡核苷酸探针序列为:ATTAACAGACTTGAGTGAAGTCATAATCTCATCGG, AGAATACAATCTGTGTTTCTGACCAGGTGAGGTAG, GAAGGAGGAGAATCCCGTGGCATGCCAATGAATCT. 具体方法按原位杂交试剂盒操作. 每只大鼠选一张肝组织切片,每张切片摄片25幅,将从25幅照片获得的体视学参数值,用体视学图像分析软件(第一军医大学研制)检测Ⅰ, Ⅲ型前胶原mRNA含量值(PU)作为Ⅰ, Ⅲ型前胶原mRNA的相对含量.

    统计学处理:全部数据经SPSS 8.0统计软件进行分析,计量资料用x±s表示. 纤维化程度计数资料采用Ridit分析,以α=0.05双侧为显著性检验标准. 多组间比较采用方差分析. 两变量的相关程度用直线相关分析法分析.
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    2结果

    肝组织切片HE,VG染色显示,A组大鼠胶原着色仅见于血管壁;B组肝组织呈现显著的脂肪变性、坏死、炎性细胞浸润,汇管区扩大,汇管区胶原沉积,部分肝组织有明显的假小叶形成;C组炎症程度较模型组明显减轻,纤维间隔细小,无假小叶形成(Tab 1). 电镜下,A组大鼠窦周隙内充满血浆样物,其内可见散在的贮脂细胞(hepatic stellate cell, HSC). HSC形态不规则,有突起,胞质内含有许多大的脂滴,周围可见少量散在分布的网状纤维;B组大鼠窦周隙HSC数量明显增多,向成纤维细胞转化,形态变为长椭圆形,胞质内粗面内质网明显增多,脂滴减少,周围胶原纤维密集(Fig 1A);C组HSC数量减少,周围胶原纤维稀少(Fig 1B).表1洛沙坦对大鼠肝纤维化程度的影响(略)

    2.1AT1R间接免疫荧光检测荧光显微镜下观察,A组大鼠AT1R的阳性表达位于肝小叶周边及肝窦区HSC的胞质内,在肝组织切片上呈散在分布,为均匀着色的黄绿色荧光,每高倍镜下平均阳性细胞数为(4.21±3.28)/Hp;B组大鼠肝组织中阳性表达细胞散在或成团分布(Fig 2A),阳性表达细胞数平均值为(31.73±12.40)/Hp,明显高于A组(P<0.01);C组为(8.34±3.67)/Hp,明显低于B组(P<0.01,Fig 2B).
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    2.2Ⅰ,Ⅲ型胶原的免疫组化B组大鼠肝组织Ⅰ,Ⅲ型胶原平均阳性单位数(46.5±24.2,6.1±1.1)明显高于A组(7.1±2.3,4.5±0.9,P<0.01);主要分布于肝窦区、汇管区,小叶间及中央静脉周围,部分有假小叶形成. C组(17.2±13.2,6.0±1.5,P<0.05)明显低于B组.

    2.3Ⅰ,Ⅲ型前胶原mRNA原位杂交B组大鼠肝组织Ⅰ,Ⅲ型前胶原mRNA平均阳性单位数明显高于A组(34.3±14.2,5.1±1.2 vs 4.9±1.8,3.2±1.3,P<0.01)主要分布于肝窦区、汇管区,小叶间及中央静脉周围,C组(15.1±9.5,3.9±1.1,P<0.05)明显低于B组(Fig 3A,B). 大鼠肝组织中AT1R的阳性表达细胞数与肝组织Ⅰ,Ⅲ型胶原平均阳性单位数呈正相关(r值分别为0.942,0.658,P<0.001,<0.01);与肝组织Ⅰ,Ⅲ型前胶原mRNA平均阳性单位数呈正相关(r值分别为0.859,0.501,P<0.001,<0.01).
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    3讨论

    AngⅡ通过血管收缩和钠储留来维持血压和体液内环境. 但AngⅡ尚有上调细胞因子、促进细胞增生和调节细胞外基质代谢等作用[3]. 血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)和AngⅡ受体拮抗剂均存在拮抗心、肾间质纤维化的作用[4,5]. 在肝纤维化过程中也A: Model group; B: Fibrosis+losartan intervention group.

    有类似作用[6]. 我们发现,B组大鼠与A组大鼠比较肝纤维化程度明显增高,光镜下可见汇管区扩大,汇管区胶原沉积,部分肝组织有明显的假小叶形成,肝组织呈现显著的脂肪变性、坏死、炎性细胞浸润;电镜下可见活化的HSC明显增多,形态向成纤维细胞转化,其周围胶原纤维密集;肝组织中AT1R的阳性表达细胞数明显增多,同时Ⅰ,Ⅲ型胶原和Ⅰ,Ⅲ型前胶原mRNA的表达增加. C组与B组比较大鼠肝纤维化程度明显减轻,肝细胞除有轻度的脂肪沉积外,未见明显坏死及炎性细胞浸润;电镜下活化的HSC明显减少,周围胶原纤维稀少;肝组织中AT1R的阳性表达细胞数明显减少,同时Ⅰ,Ⅲ型胶原和Ⅰ,Ⅲ型前胶原mRNA的表达减少. 提示通过洛沙坦干预,能减少Ⅰ,Ⅲ型胶原的表达,抑制肝纤维化的进程.
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    研究证实,HSC上存在有AT1R,AngⅡ通过与其受体AT1R结合,在肝纤维化形成过程中起着重要的作用. AngⅡ与受体AT1 结合后,通过三磷酸鸟苷结合蛋白调控磷脂酰肌醇酶,该酶继而将磷脂酰肌醇4,5二磷酸脂水解成第二信使二脂酰甘油(DG)和肌醇1,4,5三磷酸酯(IP3),从而形成一套以肌醇磷脂代谢为基础的第二信使系统,与细胞的增殖调控密切相关[7]. 同时AngⅡ与AT1R结合后还可直接促进HSC的增殖,加强细胞外基质的分泌效应. 我们发现,B组大鼠较A组AT1R及Ⅰ,Ⅲ型胶原表达明显增加,HSC激活并转化为成纤维细胞明显增多;C组与B组比较AT1R及Ⅰ,Ⅲ型胶原表达减少,HSC激活并转化为成纤维细胞明显减少. 提示特异性的AT1R拮抗剂洛沙坦主要是通过抑制HSC的活化、增殖,抑制成纤维细胞的转化和纤维连接蛋白合成等,从而起到抗纤维化的作用.

    目前,局部组织AngⅡ在慢性肝脏病变发生发展过程中的作用日益得到重视,由于AT1R拮抗剂早已成为商品药物,并广泛应用于心血管系统的临床治疗,具有安全可靠、毒副作用小等特点. 因此,加强局部组织AngⅡ对肝纤维化作用的研究,对肝纤维化的防治具有积极的意义.
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, 百拇医药     [3] 李乾,张桂英,李新华. 血管紧张素Ⅱ与肝纤维化[J]. 世界华人消化杂志,2003;11(3):334-337.

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    基金项目:国家自然科学基金(30270610)

    通讯作者:李旭. Tel.(020)61360181 Email.mylx99@163.com

    作者简介:王卫卫(1970),女(汉族),湖南省长沙市人. 硕士,主治医师. Tel.(020)61653552Email.niehaibo36@hotmail.com

    (1广州军区总医院消化内科,广东 广州 510010,2第一军医大学消化病研究所,广东 广州 510515), http://www.100md.com