甲状腺肿瘤ras癌基因产物p21的免疫组织化学观察
作者：林开桂 丛培渊 李含泗 张建中
单位：林开桂 丛培渊 李含泗(空军重庆医院)；张建中(第三军医大学)
关键词：甲状腺肿瘤；致癌基因；抗体，单克隆；免疫组织化学
中华医学杂志900308
提要 对88例甲状腺病变组织进行了p21免疫组化观察。结果显示：乳头状腺癌，滤泡性癌p21均过量表达，多呈均匀地分布于细胞浆或顶浆；良性肿瘤几乎是阴性或弱阳性；不典型增生细胞中等程度地表达p21抗原。甲状腺肿瘤p21免疫组织化学研究，有助于鉴别甲状腺癌与甲状腺瘤。
近年来发现，ras癌基因产物p21过量表达与人类癌症发生有关[1～3]。我们应用p21单克隆抗体及ABC法对88例甲状腺病变组织进行标记，重点观察甲状腺肿瘤中p21表达与肿瘤形态学和生物学行为的关系，并对其在肿瘤发生学及预后评价中的意义进行探讨。
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材料与方法
1. 材料:88例材料均取自第三军医大学第二附属医院病理科1978～1989年间甲状腺手术切除标本。其中甲状腺肿瘤72例(肿瘤组)，16例为甲状腺其它病变(非肿瘤组)。根据WHO甲状腺肿瘤的分类[4]，肿瘤组又可分为恶性组(51例)与良性组(21例)，并进行随访。所有标本均经10%甲醛溶液固定，石蜡包埋。抗p21单克隆抗体(SCI-oncogema I)为上海肿瘤研究所提供，标准ABC试剂盒为美国Vector Lab产品。
2. 染色步骤：(1)常规脱蜡；(2)0.1%胰酶消化，置37°C、30分钟；(3)3%H2O2溶液，室温、10分钟；(4)3%羊血清，置37°C、30分钟；(5)一抗(1：50)，置4°C、过夜；(6)二抗(1：100)，置37°C、30分钟；(7)ABC法(1:100)置37℃,30分钟；(8)DAB显色；(9)在(1)～(8)之间均用PBS洗3分钟3次；(10)苏木精复染。用PBS代替一抗体作为对照。
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3. 观察方法：双盲法阅片。染色强度以正常甲状腺滤泡上皮为阴性标准，分为弱(+)、中(++)、强(+++)阳性3级。此外，对近滤泡腔或乳头表面上皮胞浆和胞膜染色列为顶浆阳性。各组染色强度按秩和检验方法进行处理。
结 果
一、一般染色
88例甲状腺病变组织的染色强度(附表)。最常见的p21阳性反应为胞浆内弥漫性棕黄色细颗粒状(图1)。在大部分腺癌中同时伴有癌细胞顶浆面阳性，其染色强度比胞浆染色略有增加，这在乳头状癌特别明显。此外，4/50例腺癌中可见部分癌细胞p21阳性物质局限于胞浆一侧呈球形浓染。癌旁正常甲状腺滤泡上皮细胞染色较浅或无明显染色(图2)，而癌旁不典型性增生细胞显中度反应。所有切片背景清晰，对照染色切片均为阴性。
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图1 滤泡性癌细胞浆p21弥漫性阳性反应，ABC×400
附表 ras癌基因产物p21在意8例甲状腺病变组织中的表达(例数)
组织学类型
例数
胞 浆
顶 浆
-
+
++
+++
-
, 百拇医药
+
++
+++
乳头状腺癌
40
0
18
13
9
3
15
14
8
滤泡性癌
, 百拇医药
6
0
1
4
1
0
2
3
1
未分化癌
3
0
3
0
, 百拇医药
0
2
1
0
0
髓样癌
1
0
1
0
0
1
0
0
, 百拇医药
0
恶性淋巴瘤
1
1
0
0
0
1
0
0
0
滤泡性腺瘤
15
8
, 百拇医药
6
1
0
14
1
0
0
乳头状腺瘤
6
0
6
0
0
6
, 百拇医药
0
0
0
亚急性甲状腺炎
2
2
0
0
0
2
0
0
0
桥本氏病
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2
2
0
0
0
2
0
0
0
甲状腺原发性增生
6
3
1
2
, 百拇医药
0
6
0
0
0
正常甲状腺
6
6
0
0
0
6
0
0
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0
合计
88
22
36
20
10
43
19
17
9
图2 甲状腺乳头状腺癌(右)p21阳性，癌旁正
, 百拇医药
常滤泡(左)上皮细胞呈阴性反应，ABC×54
二、p21阳性与肿瘤组织学类型的关系
51例甲状腺恶性肿瘤中50例为甲状腺癌，均不同程度地表现为p21阳性。其中弱阳性23例，中度阳性17例，强阳性10例。乳头状腺癌比滤泡性癌阳性反应强；髓样癌与未分化癌阳性反应较弱；1例为恶性淋巴瘤，显阴性反应。良性组21例腺瘤中有12例为轻度阳性，1例为中度阳性。恶性组p21胞浆染色强度与良性组有非常显著差异(P<0.01)。此外，恶性组除3例外均伴有顶浆阳性。这1例不典型性腺瘤的部分增生活跃的瘤细胞表现为中度弥漫性胞浆阳性和轻度顶浆阳生。
三、p21阳性与肿瘤生物学行为的关系
40例乳头状腺癌中，16例有包膜浸润。浸润包膜的病例多见于p21表达增强者(图3)，其中12例浸润灶p21表达比原发灶增强，占75%。7例发生淋巴结转移，转移灶中癌细胞亦呈强阳性(图4)。此外，滤泡性癌浸润包膜1例。骨转移1例以及未分化癌浸润包膜1例均为弱阳性反应。
, 百拇医药
图3 浸润包膜的癌细胞浆p21亦呈阳性反应，ABC×90
图4 淋巴结转移灶中癌细胞浆为p21阳性反应，ABC×90
Ⅰ级乳头状腺癌14例中，p21顶浆弱、中、强阳性反应分别为7、5、1例；Ⅱ级乳头状腺癌26例，其中轻度8例，中度9例，强阳性7例。两组染色强度有显著差异(P<0.05)。
51例恶性肿瘤病例均得到了随访，其中乳头状腺癌随访五年以上者17例，2例死亡，6例复发。这后8例患者7例p21染色为强阳性。6例滤泡性癌有2例在2年内死亡，均为中度阳性反应；1例p21弱阳性的未分化癌在术后2个月复发，10个月死亡。
四、非肿瘤性甲状腺病例p21染色
, 百拇医药
正常甲状腺及甲状腺炎均为阴性反应。6例甲状腺原发性增生有3例为轻、中度阳性，其阳性的滤泡上皮呈柱状，部分增生细胞突入滤泡腔形成乳头，这3例均为复旧不完全的甲亢。
讨 论
最近研究表明，细胞癌基加(C-onc)被活化或发生点突变时能表达过量的基因产物，这些此基因产物能使正常细胞转化为恶性肿瘤。人体肿瘤中ras家族的C-onc成员是最常见的转化诱导基因。3种ras基因(H-ras，K-ras和N-ras)均可编码分子量为21000的蛋白(p21)。p21被认为是一种具有GTP酶活性的膜信号转导蛋白。正常情况下可调节着细胞的生长发育，而在异常情况下可使细胞分化增殖失控而发生癌变。以往研究发现结肠癌、乳腺癌、肝癌、膀胱癌等肿瘤中均有ras p21表达增强或过量表达[1～3，5～8]。免疫组化染色也提示，ras p21可有助于通过组织学检查来预测肿瘤的生物学行为[7，8]。因此，深入研究肿瘤组织中的p21表达对患者的预后评价可能有一定的意义。
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本研究发现恶性组除恶性淋巴瘤之外，均有不同程度的p21过量表达，提示甲状腺癌变与ras癌基因活化有关。同时在乳头状腺癌移行区以及不典型性腺瘤的增生活跃区观察到不典型增生细胞亦有中等程度的p21过量表达，这从基因水平及基因表达水平提示间变细胞的本质——ras基因已开始活化，基因产物也已大量增加。我们注意到乳头状腺癌癌旁正常甲状腺滤泡上皮细胞未见P21表达，提示p21单克隆抗体具有对甲状腺乳头状腺癌的辅助诊断及其临床应用的潜在可能性。此外，我们还发现甲状腺癌比腺瘤中p21表达明显增强；Ⅰ级与Ⅱ级乳头状腺癌p21染色强度亦有明显差异；临床资料也表明p21过量表达的肿瘤较易发生包膜浸润、淋巴结转移和复发。上述结果提示p21表达增强可能会影响甲状腺癌的生物学行为。
Mizukami等[8]报告顶浆面p21过量表达是甲状腺乳头状腺癌的特征性染色类型，本研究也有类似的发现。一般认为，ras p21在粗面内质网合成，经高尔基体运送至顶浆区。甲状腺病变组织癌变时顶浆面染色增强提示此区与肿瘤的生长有关。因此，p21顶浆区阳性有助于鉴别甲状腺癌与甲状腺瘤。
, 百拇医药
真性甲状腺乳头状瘤极少见。我们收集一组部分或局限性低乳头状增生的甲状腺瘤，染色发现6例均一致地表达p21抗原，与某些乳头状癌的胞浆染色差异无显著性。提示对于乳头状腺瘤的诊断应慎重，并注意随访。
有趣的是甲状腺原发性增生亦有p21的轻、中度表达，说明滤泡上皮细胞增生与代谢活跃。但未见明显的顶浆阳性，提示顶浆阳性可能是滤泡上皮肿瘤性增生所必需的。进一步应用ras癌基因探针进行印迹或原位杂交可能有助于区别ras癌基因点突变与正常细胞ras基因增强所致的过量表达，以及在基因或mRNA水平上证实甲状腺瘤中ras p21表达的免疫组织化学发现。
参考文献
1. Slamen DJ, et al Expression of cellular oncogenes in human malignancies. Science 1984；224：256.
, 百拇医药
2. Spandidos DA, et al. Elevated expression of the human ras oncogene family in premalignant and malignant tumors of the colorectum. Br J Cancer 1984；49：681.
3. Kerr IB, et al. Immunocytochemical demonstration of p21 ras family oncogene product in normal mucosa and in premalignant and malignant tumors of the colorectum. Br J Cancer 1985；52：695.
4. Hedinger C, et al. The WHO histological classification of thyroid tumor. Cancer 1989；63：908.
, http://www.100md.com
5. Nohomura A, et al. Immunohistochemical detection of ras oncogene p21 product in liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Am I Gastroenterol 1987；82：512.
6. Ohuchi N, et al.Expression of the 21000 molecular weight ras protein in a spectrum of benign and malignant human mammary tissues. Cancer Res 1986；46：2511.
7. Viola MV, et al. Expression of ras oncogene p21in prostate cancer. N Engl J Med 1986；314：133.
8. Mizukami Y, et al.Immunohistochemical demonstration of ras p21 oncogene product in normal, benign, and malignant human thyroid tissues. Cancer 1988；61：873.
(1989年7月6日收稿 同年9月18日修回), 百拇医药
单位：林开桂 丛培渊 李含泗(空军重庆医院)；张建中(第三军医大学)
关键词：甲状腺肿瘤；致癌基因；抗体，单克隆；免疫组织化学
中华医学杂志900308
提要 对88例甲状腺病变组织进行了p21免疫组化观察。结果显示：乳头状腺癌，滤泡性癌p21均过量表达，多呈均匀地分布于细胞浆或顶浆；良性肿瘤几乎是阴性或弱阳性；不典型增生细胞中等程度地表达p21抗原。甲状腺肿瘤p21免疫组织化学研究，有助于鉴别甲状腺癌与甲状腺瘤。
近年来发现，ras癌基因产物p21过量表达与人类癌症发生有关[1～3]。我们应用p21单克隆抗体及ABC法对88例甲状腺病变组织进行标记，重点观察甲状腺肿瘤中p21表达与肿瘤形态学和生物学行为的关系，并对其在肿瘤发生学及预后评价中的意义进行探讨。
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材料与方法
1. 材料:88例材料均取自第三军医大学第二附属医院病理科1978～1989年间甲状腺手术切除标本。其中甲状腺肿瘤72例(肿瘤组)，16例为甲状腺其它病变(非肿瘤组)。根据WHO甲状腺肿瘤的分类[4]，肿瘤组又可分为恶性组(51例)与良性组(21例)，并进行随访。所有标本均经10%甲醛溶液固定，石蜡包埋。抗p21单克隆抗体(SCI-oncogema I)为上海肿瘤研究所提供，标准ABC试剂盒为美国Vector Lab产品。
2. 染色步骤：(1)常规脱蜡；(2)0.1%胰酶消化，置37°C、30分钟；(3)3%H2O2溶液，室温、10分钟；(4)3%羊血清，置37°C、30分钟；(5)一抗(1：50)，置4°C、过夜；(6)二抗(1：100)，置37°C、30分钟；(7)ABC法(1:100)置37℃,30分钟；(8)DAB显色；(9)在(1)～(8)之间均用PBS洗3分钟3次；(10)苏木精复染。用PBS代替一抗体作为对照。
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3. 观察方法：双盲法阅片。染色强度以正常甲状腺滤泡上皮为阴性标准，分为弱(+)、中(++)、强(+++)阳性3级。此外，对近滤泡腔或乳头表面上皮胞浆和胞膜染色列为顶浆阳性。各组染色强度按秩和检验方法进行处理。
结 果
一、一般染色
88例甲状腺病变组织的染色强度(附表)。最常见的p21阳性反应为胞浆内弥漫性棕黄色细颗粒状(图1)。在大部分腺癌中同时伴有癌细胞顶浆面阳性，其染色强度比胞浆染色略有增加，这在乳头状癌特别明显。此外，4/50例腺癌中可见部分癌细胞p21阳性物质局限于胞浆一侧呈球形浓染。癌旁正常甲状腺滤泡上皮细胞染色较浅或无明显染色(图2)，而癌旁不典型性增生细胞显中度反应。所有切片背景清晰，对照染色切片均为阴性。
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图1 滤泡性癌细胞浆p21弥漫性阳性反应，ABC×400
附表 ras癌基因产物p21在意8例甲状腺病变组织中的表达(例数)
组织学类型
例数
胞 浆
顶 浆
-
+
++
+++
-
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+
++
+++
乳头状腺癌
40
0
18
13
9
3
15
14
8
滤泡性癌
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6
0
1
4
1
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1
未分化癌
3
0
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0
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0
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髓样癌
1
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1
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0
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0
恶性淋巴瘤
1
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滤泡性腺瘤
15
8
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乳头状腺瘤
6
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亚急性甲状腺炎
2
2
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2
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桥本氏病
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2
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0
甲状腺原发性增生
6
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1
2
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0
正常甲状腺
6
6
0
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0
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0
合计
88
22
36
20
10
43
19
17
9
图2 甲状腺乳头状腺癌(右)p21阳性，癌旁正
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常滤泡(左)上皮细胞呈阴性反应，ABC×54
二、p21阳性与肿瘤组织学类型的关系
51例甲状腺恶性肿瘤中50例为甲状腺癌，均不同程度地表现为p21阳性。其中弱阳性23例，中度阳性17例，强阳性10例。乳头状腺癌比滤泡性癌阳性反应强；髓样癌与未分化癌阳性反应较弱；1例为恶性淋巴瘤，显阴性反应。良性组21例腺瘤中有12例为轻度阳性，1例为中度阳性。恶性组p21胞浆染色强度与良性组有非常显著差异(P<0.01)。此外，恶性组除3例外均伴有顶浆阳性。这1例不典型性腺瘤的部分增生活跃的瘤细胞表现为中度弥漫性胞浆阳性和轻度顶浆阳生。
三、p21阳性与肿瘤生物学行为的关系
40例乳头状腺癌中，16例有包膜浸润。浸润包膜的病例多见于p21表达增强者(图3)，其中12例浸润灶p21表达比原发灶增强，占75%。7例发生淋巴结转移，转移灶中癌细胞亦呈强阳性(图4)。此外，滤泡性癌浸润包膜1例。骨转移1例以及未分化癌浸润包膜1例均为弱阳性反应。
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图3 浸润包膜的癌细胞浆p21亦呈阳性反应，ABC×90
图4 淋巴结转移灶中癌细胞浆为p21阳性反应，ABC×90
Ⅰ级乳头状腺癌14例中，p21顶浆弱、中、强阳性反应分别为7、5、1例；Ⅱ级乳头状腺癌26例，其中轻度8例，中度9例，强阳性7例。两组染色强度有显著差异(P<0.05)。
51例恶性肿瘤病例均得到了随访，其中乳头状腺癌随访五年以上者17例，2例死亡，6例复发。这后8例患者7例p21染色为强阳性。6例滤泡性癌有2例在2年内死亡，均为中度阳性反应；1例p21弱阳性的未分化癌在术后2个月复发，10个月死亡。
四、非肿瘤性甲状腺病例p21染色
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正常甲状腺及甲状腺炎均为阴性反应。6例甲状腺原发性增生有3例为轻、中度阳性，其阳性的滤泡上皮呈柱状，部分增生细胞突入滤泡腔形成乳头，这3例均为复旧不完全的甲亢。
讨 论
最近研究表明，细胞癌基加(C-onc)被活化或发生点突变时能表达过量的基因产物，这些此基因产物能使正常细胞转化为恶性肿瘤。人体肿瘤中ras家族的C-onc成员是最常见的转化诱导基因。3种ras基因(H-ras，K-ras和N-ras)均可编码分子量为21000的蛋白(p21)。p21被认为是一种具有GTP酶活性的膜信号转导蛋白。正常情况下可调节着细胞的生长发育，而在异常情况下可使细胞分化增殖失控而发生癌变。以往研究发现结肠癌、乳腺癌、肝癌、膀胱癌等肿瘤中均有ras p21表达增强或过量表达[1～3，5～8]。免疫组化染色也提示，ras p21可有助于通过组织学检查来预测肿瘤的生物学行为[7，8]。因此，深入研究肿瘤组织中的p21表达对患者的预后评价可能有一定的意义。
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本研究发现恶性组除恶性淋巴瘤之外，均有不同程度的p21过量表达，提示甲状腺癌变与ras癌基因活化有关。同时在乳头状腺癌移行区以及不典型性腺瘤的增生活跃区观察到不典型增生细胞亦有中等程度的p21过量表达，这从基因水平及基因表达水平提示间变细胞的本质——ras基因已开始活化，基因产物也已大量增加。我们注意到乳头状腺癌癌旁正常甲状腺滤泡上皮细胞未见P21表达，提示p21单克隆抗体具有对甲状腺乳头状腺癌的辅助诊断及其临床应用的潜在可能性。此外，我们还发现甲状腺癌比腺瘤中p21表达明显增强；Ⅰ级与Ⅱ级乳头状腺癌p21染色强度亦有明显差异；临床资料也表明p21过量表达的肿瘤较易发生包膜浸润、淋巴结转移和复发。上述结果提示p21表达增强可能会影响甲状腺癌的生物学行为。
Mizukami等[8]报告顶浆面p21过量表达是甲状腺乳头状腺癌的特征性染色类型，本研究也有类似的发现。一般认为，ras p21在粗面内质网合成，经高尔基体运送至顶浆区。甲状腺病变组织癌变时顶浆面染色增强提示此区与肿瘤的生长有关。因此，p21顶浆区阳性有助于鉴别甲状腺癌与甲状腺瘤。
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真性甲状腺乳头状瘤极少见。我们收集一组部分或局限性低乳头状增生的甲状腺瘤，染色发现6例均一致地表达p21抗原，与某些乳头状癌的胞浆染色差异无显著性。提示对于乳头状腺瘤的诊断应慎重，并注意随访。
有趣的是甲状腺原发性增生亦有p21的轻、中度表达，说明滤泡上皮细胞增生与代谢活跃。但未见明显的顶浆阳性，提示顶浆阳性可能是滤泡上皮肿瘤性增生所必需的。进一步应用ras癌基因探针进行印迹或原位杂交可能有助于区别ras癌基因点突变与正常细胞ras基因增强所致的过量表达，以及在基因或mRNA水平上证实甲状腺瘤中ras p21表达的免疫组织化学发现。
参考文献
1. Slamen DJ, et al Expression of cellular oncogenes in human malignancies. Science 1984；224：256.
, 百拇医药
2. Spandidos DA, et al. Elevated expression of the human ras oncogene family in premalignant and malignant tumors of the colorectum. Br J Cancer 1984；49：681.
3. Kerr IB, et al. Immunocytochemical demonstration of p21 ras family oncogene product in normal mucosa and in premalignant and malignant tumors of the colorectum. Br J Cancer 1985；52：695.
4. Hedinger C, et al. The WHO histological classification of thyroid tumor. Cancer 1989；63：908.
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5. Nohomura A, et al. Immunohistochemical detection of ras oncogene p21 product in liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Am I Gastroenterol 1987；82：512.
6. Ohuchi N, et al.Expression of the 21000 molecular weight ras protein in a spectrum of benign and malignant human mammary tissues. Cancer Res 1986；46：2511.
7. Viola MV, et al. Expression of ras oncogene p21in prostate cancer. N Engl J Med 1986；314：133.
8. Mizukami Y, et al.Immunohistochemical demonstration of ras p21 oncogene product in normal, benign, and malignant human thyroid tissues. Cancer 1988；61：873.
(1989年7月6日收稿 同年9月18日修回), 百拇医药