以PAH基因第399密码子A→T顺序多态性为遗传标记产前诊断苯丙酮尿症
作者：黄淑帧 周霞娣 陈美珏 任兆瑞 曾溢滔
单位：(上海市儿童医院医学遗传研究室 200040)
关键词：
中华医学杂志900320
苯丙酮尿症(PKU)是一种严重的遗传性代谢病。通过产前诊断，杜绝PKU患儿的出生是有效的优生措施。目前对本病常用的产前诊断方法是限制性片段长度多态性(RFLP)连锁分析。但在一些高危家庭中，由于缺乏RFLP信息而失去产前诊断的机会。最近，作者对PKU患者的PAH基因进行分析时，鉴定出一种新的中性突变，即位于第11外显子的第399密码子由GTA(Val)变为GTT(Val)，这一碱基替代并不更改目前已知的任何限制酶的识别顺序，故为一简单的顺序多态性特点。把它作为遗传标记，应用PCR(聚合酶链反应Polymerase Chain Reaction)/ASO(等位基因特异寡核苷酸，Allele Specific Oligonucleotide)探针技术，我们对1例原先用RFLP连锁分析法不能完全诊断的高危胎儿成功地进行了产前诊断。现简报如下。
, http://www.100md.com
一、材料和方法
1. 家系调查：一个江苏籍PKU家庭，已有1例4岁男孩患有经型PKU，父、母和患儿的PAH基因的RFLP分析除EcoRI位点(17/11kb)外，其它多态位点均无杂合性。母亲已怀孕8周，要求对胎儿作产前诊断。
2. 方法：取父、母、患儿和绒毛DNA各0.5μg在Tap聚合酶催化下进行PCR扩增，PCR的一对寡核苷酸引物为5'CTGATCCTGATTTAACAGTG-3'的5'-AGTCCACTCTCCTGGAACCA-3'，用以引导合成PAH基因第11位外显子3'端和第11内含子5'端部分共266bp的核苷酸顺序，其中包括了第399密码子顺序。DNA双链于95°C变性7分钟，然后进入PCR循环：55°C退火30秒，65°C延伸1分钟，90°C变性30秒，共30个周期，DNA拉增终止于65°C。取2.5μl扩增产物与10μl的0.4mol/L NaOH/25mmol/L EDTA液混匀后直接点加于Zeta Probe尼龙膜上，然后与一对(γ-82P)ATP标记的ASO探针作分子杂交，洗膜后于-20°C下作放射性自显影。根据家庭成员的PAH基因中该顺序多态性存在与否进行连锁分析，对胎儿作出产前诊断。
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二、结果
用相应的一对ASO探针检测扩增的PAH基因片段，发现患儿和母亲的扩增DNA能同时与正常和顺序多态型两种ASO探针杂交，而父亲和胎儿的扩增DNA只能与正常的ASO探针杂交，而不能与顺序多态型ASO探针杂交，通过连锁分析可知，患儿PAH基因中的这个顺序多态位点与其一个致病基因相连锁，它来自母方，而胎儿未从其母亲处遗传到这个携带顺序多态位点的基因，故可排除胎儿患有PKU。
三、讨论
在本文分析的家系中，已出生过一名PKU患儿，家庭成员的EFLP分析未能为下次妊娠提供确切的产前诊断信息，因为父、母、患儿和胎儿的EcoRI酶切片段均为17/11(kb)，而其它多态位点也不具备杂合性，因此表型为EcoRI17/11kb的胎儿有二种可能性，或为正常，或为PKU胎儿。可喜的是在对这一家庭的进一步分析中发现了399密码子顺序多态性，这使我们设想把这一顺序多态作为一新的遗传标记，通过连锁分析对胎儿作产前诊断。在技术方法上我们采用了PCR/ASO探针技术来快速准确地检测家庭成员PAH基因中的多态位点，结果表明该家系中的一个致病基因与该顺序多态性相连锁，并来自母亲，而不与该顺序多态连锁的致病基因来自父方。由于胎儿的PAH基因不存在这一顺序多态，故他至少已从母亲处遗传到一个正常的PAH基因，据此可排除患有PKU，结合EcoRI位点的RFLP分析资料，可产前诊断胎儿正常。胎儿出生后以随访证实了产前诊断结果。
本文所介绍的应用顺序多态性连锁分析方法对PKU进行产前诊断的算途径丰富了遗传病基因的方法技术学。把这种方法与RFLP连锁分析，寡核苷酸分子杂交和PCR技术组合配合应用，可大大提高产前诊断的可诊断率。这不仅对于PKU，而且对其它遗传病的产前诊断也具有重要的指导和实际应用意义。
(1989年6月14日收稿 同年11月6日修回), http://www.100md.com
单位：(上海市儿童医院医学遗传研究室 200040)
关键词：
中华医学杂志900320
苯丙酮尿症(PKU)是一种严重的遗传性代谢病。通过产前诊断，杜绝PKU患儿的出生是有效的优生措施。目前对本病常用的产前诊断方法是限制性片段长度多态性(RFLP)连锁分析。但在一些高危家庭中，由于缺乏RFLP信息而失去产前诊断的机会。最近，作者对PKU患者的PAH基因进行分析时，鉴定出一种新的中性突变，即位于第11外显子的第399密码子由GTA(Val)变为GTT(Val)，这一碱基替代并不更改目前已知的任何限制酶的识别顺序，故为一简单的顺序多态性特点。把它作为遗传标记，应用PCR(聚合酶链反应Polymerase Chain Reaction)/ASO(等位基因特异寡核苷酸，Allele Specific Oligonucleotide)探针技术，我们对1例原先用RFLP连锁分析法不能完全诊断的高危胎儿成功地进行了产前诊断。现简报如下。
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一、材料和方法
1. 家系调查：一个江苏籍PKU家庭，已有1例4岁男孩患有经型PKU，父、母和患儿的PAH基因的RFLP分析除EcoRI位点(17/11kb)外，其它多态位点均无杂合性。母亲已怀孕8周，要求对胎儿作产前诊断。
2. 方法：取父、母、患儿和绒毛DNA各0.5μg在Tap聚合酶催化下进行PCR扩增，PCR的一对寡核苷酸引物为5'CTGATCCTGATTTAACAGTG-3'的5'-AGTCCACTCTCCTGGAACCA-3'，用以引导合成PAH基因第11位外显子3'端和第11内含子5'端部分共266bp的核苷酸顺序，其中包括了第399密码子顺序。DNA双链于95°C变性7分钟，然后进入PCR循环：55°C退火30秒，65°C延伸1分钟，90°C变性30秒，共30个周期，DNA拉增终止于65°C。取2.5μl扩增产物与10μl的0.4mol/L NaOH/25mmol/L EDTA液混匀后直接点加于Zeta Probe尼龙膜上，然后与一对(γ-82P)ATP标记的ASO探针作分子杂交，洗膜后于-20°C下作放射性自显影。根据家庭成员的PAH基因中该顺序多态性存在与否进行连锁分析，对胎儿作出产前诊断。
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二、结果
用相应的一对ASO探针检测扩增的PAH基因片段，发现患儿和母亲的扩增DNA能同时与正常和顺序多态型两种ASO探针杂交，而父亲和胎儿的扩增DNA只能与正常的ASO探针杂交，而不能与顺序多态型ASO探针杂交，通过连锁分析可知，患儿PAH基因中的这个顺序多态位点与其一个致病基因相连锁，它来自母方，而胎儿未从其母亲处遗传到这个携带顺序多态位点的基因，故可排除胎儿患有PKU。
三、讨论
在本文分析的家系中，已出生过一名PKU患儿，家庭成员的EFLP分析未能为下次妊娠提供确切的产前诊断信息，因为父、母、患儿和胎儿的EcoRI酶切片段均为17/11(kb)，而其它多态位点也不具备杂合性，因此表型为EcoRI17/11kb的胎儿有二种可能性，或为正常，或为PKU胎儿。可喜的是在对这一家庭的进一步分析中发现了399密码子顺序多态性，这使我们设想把这一顺序多态作为一新的遗传标记，通过连锁分析对胎儿作产前诊断。在技术方法上我们采用了PCR/ASO探针技术来快速准确地检测家庭成员PAH基因中的多态位点，结果表明该家系中的一个致病基因与该顺序多态性相连锁，并来自母亲，而不与该顺序多态连锁的致病基因来自父方。由于胎儿的PAH基因不存在这一顺序多态，故他至少已从母亲处遗传到一个正常的PAH基因，据此可排除患有PKU，结合EcoRI位点的RFLP分析资料，可产前诊断胎儿正常。胎儿出生后以随访证实了产前诊断结果。
本文所介绍的应用顺序多态性连锁分析方法对PKU进行产前诊断的算途径丰富了遗传病基因的方法技术学。把这种方法与RFLP连锁分析，寡核苷酸分子杂交和PCR技术组合配合应用，可大大提高产前诊断的可诊断率。这不仅对于PKU，而且对其它遗传病的产前诊断也具有重要的指导和实际应用意义。
(1989年6月14日收稿 同年11月6日修回), http://www.100md.com