内毒素休克大鼠心肌β、α1型肾上腺素受体和M型胆碱受体的动态变化
作者：包雅琳 郭恒怡 陶永平 陈华粹 蔡建强
单位：包雅琳 郭恒怡 陶永平 陈华粹(北京，中国协和医科大学病生理教研室 100730)；蔡建强(中国科学院肿瘤医院外科)
关键词：内毒素；休克；受体，肾上腺素能；受体，胆碱能
摘要 用放射性受体结合法研究内毒素休克大鼠心肌β
摘要 用放射性受体结合法研究内毒素休克大鼠心肌β、α1型肾上腺素受体和M型胆碱受体的动态变化。结果表明，注射内毒素后β受体数目逐渐增多，亲和力进行性下降；α1受体数目减少，亲和力不变；M受体亲和力不变，濒死期数目减少。
感染性休克涉及各器官系统的功能变化，其中最明显的是心血管系统。心血管系统主要受交感-肾上腺髓质系统的调节，许多资料表明，感染性休克时患者血浆儿茶酚水平明显变化。有关感染性休克时M型胆碱受体(MAchR)与β、α1型肾上腺素受体(βAR、α1AR)如何变化及相互关系如何尚未见报道。我们对内毒素休克大鼠βAR、α1AR和MAchR的动态变化进行了研究，试图从受体水平揭示感染性休克时心功能障碍的可能机理。
, http://www.100md.com
材料和方法
一、动物模型
体重180～280g的Wistar大鼠，分4组，每组10只，对照组经尾静脉注射生理盐水，3个实验组注射内毒素(16mg/kg，本室自制)分别于注射后0.5小时、3小时和濒死期(以翻正反射消失为指征)将大鼠断头处死，迅速开胸，沿大血管根部离断，取出心脏，用冷生理盐水灌洗，冲去残血，去除脂肪组织、大血管及心房组织，将心室置于-76°C冰箱保存。
另一部分大鼠腹腔注射12%的乌拉坦(10mg/kg)，麻醉后仰卧固定蛙板，颈部正中切口，分离颈外静脉和颈动脉。颈外静脉插管用于注射内毒素(剂量同前)或生理盐水，颈动脉插管经压力传感器连接四导生理记录仪，测量及记录动脉血压。内毒素组每组大鼠23只，对照组10只。
二、细胞膜制备
将心室剪碎，每克组织加于10ml、4°C匀浆缓冲液(Tris-HCl5mmol/L，MgCl2 1mmol/L，)蔗糖0.125mol/L，巯基乙醇 1mmol/L，pH7.5)中，用Polytron匀浆器匀浆，速度为7000r/min，共3次，每次15秒，间歇15秒，随后用4层消毒纱布过滤，于4°C、1000g离心15分钟，将其上清液于4°C、48000g离心30分钟，弃去上清，沉淀悬于βAR孵育缓冲液(Tris-HCl 75mmol/L，MgCl2 25mmol/L，pH7.4)，再次离心，条件同上，沉淀重悬于孵育液，用染料结合法进行蛋白定量[1]。
, 百拇医药
三、受体结合实验
βAR、α1AR和MAchR的结合实验分别按照Lurie等[2～4]方法加以修改。
1. βAR结合实验：4°C，于膜蛋白中加入不同浓度的3H-DHA(0.2～10nmol/L)，并加入心得安(10-4MOL/L)或等量孵育缓冲液，总体积400μl，将此混合物于24°C孵育15分钟，移置冰浴，随后经玻璃纤维滤膜(69#，上海虹光纸厂)真空抽滤，用冷缓冲液冲洗3次，滤膜烘干后置甲苯闪烁液中作放射计数。
2. α1AR和MAchR结合实验：方法基本同上，只是分别以3H-哌唑嗪(0.15～4.8nmol/L)和3H-QNB(0.1～3.2nmol/L)取代3H-DHA，以酚妥拉明(10-4mol/L)和阿托品(10-5mol/L)取代心得安，反应条件分别为25°C、30分钟和37°C、60分钟。孵育缓冲液：α1AR(Tris-HCl5mmol/L，MgCl2 10mmol/L，EGTA 0)5mmol/L，pH7.5)；MAchR(Tris-HCl 10mmol/L，NaCl150mmol/L，pH7.5)；总体积分别为800μl和1000μl。
, 百拇医药
四、数据处理及统计学分析
本实验用放射性配体结合法测定受体的最大结合数目(Bmax)和受体的亲和力。受体的特异结合为缺乏(总结合)和存在相应非标记拮抗剂(非特异结合)时所得的放射计数之差(图1)。根据Scatchard作图，直线的横截距为单位组织受体的Bmax，直线的斜率(-1/kd)反映受体的亲和力，其中kd值为受体的解离常数(图2)。根据Eadie-Hofstee方法进行数据处理[5]，注射内毒素各组与对照组之间的差异作非配对t检验。
游离3H-哌唑嗪浓度(nmol/L)
图1 休克临死期心肌α1AR饱和实验
, 百拇医药
3H-哌唑嗪特异结合量(fmol/mg蛋白)
图2 各期休克及对照组心肌α1AR的Scarchard作图
结 果
一、平均动脉压(MAP)的变化
生理盐水对照组的MAP为15.0±0.5kPa，注射内毒素5分钟MAP降至7.9±0.9kPa，与对照组相比，MAP明显降低(P〈0.01)，此后MAP逐渐回升，到30分钟达13.2kPa，但仍明显低于对照组(P〈0.05)，自注射内毒素后30分钟至临死前5～15分钟，MAP一直在此水平波动，临死前MAP降至零。
二、注射内毒素后心肌βAR、α1AR及MAchR的变化
, 百拇医药 3H-DHA、3H-哌唑嗪及3H-QNB与大鼠心室肌细胞膜的结合呈饱和性和单-结合位点型。
注射内毒素后，大鼠心肌βAR的Bmax和kd值比对照组明显增高，并随注射后时间的延长逐渐增大(附表)，表明βAR的数目逐渐增多，亲和力进行性下降。注射内毒素组心肌α1AR的Bmax比对照组明显减小，kd值的变化无统计学意义(附表)，表明注射内毒素可使心肌α1AR数目减少，亲和力不变。注射内毒素3小时以前，心肌MAchR的Bmax有减小的倾向，但与对照组相比差异无显著性，濒死期Bmax比对照组明显减低，各期kd值与对照组相比均无明显变化(附表)。可见，注射内毒素后，仅濒死期的MAchR数目明显减少，而亲和力仍不变。
附表 各组βAR、α1AR和MAchR的Bmax和kd值(
±
)
, 百拇医药
分组
βAR
α1AR
MAchR
Bmax
(fmol/mg)
kd
(nmol/L)
Bmax
(fmol/mg)
kd
(nmol/L)
, http://www.100md.com Bmax
(fmol/mg)
kd
(nmol/L)
对照组
36±4
1.2±0.3
54.9±7.6
0.24±0.09
133±7
0.12±0.02
注射内
毒素后0.5h
, http://www.100md.com
69±13*
4.0±1.1
34.1±2.6*
0.27±0.05
126±9
0.08±0.02
注射内
毒素后3h
96±18*
6.9±1.7*
34.6±2.7*
0.25±0.05
, 百拇医药
106±11
0.05±0.02
注射内
毒素后
濒死期
148±21**
9.0±1.6**
30.8±1.7*
0.26±0.04
82±5**
0.10±0.02
注：与对照组比较 *P〈0.05 ** P〈0.01
, http://www.100md.com
讨 论
大鼠注射内毒素5分钟内血压的急剧下降可能是由于内毒素的直接作用所致。由于血压降低，对颈动脉窦、主动脉弓压力感受器的刺激减弱，反射性激活交感-肾上腺髓质系统，使循环血液中儿茶酚胺增多，引起血压回升。
注射内毒素后心肌βAR的增高在早期可能有一定的代偿意义，因为在注射内毒素0.5～3小时，尽管血压仍明显低于对照组，但却也维持相对恒定状态，可能与此时βAR的增数调节所介导的心缺功能增强有关。在濒死期，由于心肌组织中儿茶酚胺的耗竭[6]及βAR亲和力的显著降低，心肌βAR的增数调节失去其代偿作用。
本实验中βAR的增数调节可能与休克过程中心肌组织儿茶酚胺的逐渐减少有关[6]。βAR亲和力的降低可能与内毒素引起的膜流动性降低有关。因为内毒素可引起心肌膜磷脂酶A2的活性增高，心肌膜磷脂甲基化减少[7]，它们均可导致细胞膜粘滞度增大，流动性减小，βAR侧向运动受阻，亲和力降低。
, 百拇医药
注射内毒素后α1AR的减数调节可能是导致心肌对儿茶酚胺反应性降低的原因之一。因为心肌的α1AR也可介导正性变力性作用，它作为一种储备机制，以保证病理状况下心肌对内源性儿茶酚胺的反应能力。α1AR数目的减少则消弱了心肌对儿茶酚胺的反应性。
α1AR数目减少可能与激动剂引起的α1AR磷酸化有关[8]。此外，许多报道证明机体在多种疾病状态下，心肌α1AR可以转化为βAR，调动其储备能力[9]，因而本实验α1AR的减数调节也可能是α1AR转化为βAR的结果。
本实验中仅在濒死期心肌MAchR明显减少。MAchR数目减少似乎对恢复交感-副交感系统的相对平衡有所裨益，但在濒死期由于心肌对儿茶酚胺的反应性已降低，并且心肌组织儿茶酚胺已几乎耗竭，所以MAchR与βAR、α1AR之间失去了相互制约能力，MAchR的减数调节已不足以代偿心肌功能的减退。
, 百拇医药
感染性休克时，迷走-胆碱能系统也可被激活，MAchR的数目减少亦可能与激动剂所致受体磷酸化有关[8]，MAchR磷酸化速度很慢，引起其磷酸化所需激动剂浓度比其产生生理效应所需浓度高得多[10]，这就可以解释MAchR只在濒死期才发生减数调节。
有关受体的异源性调节已引起重视，内毒素可导致糖皮质激素、甲状腺素及雌雄激素的释放增多[11]，这些激素均可引起心肌βAR的增数调节和心肌α1AR向βAR转化。因而本实验结果βAR数目增多、α1AR数目减少，也可能与此有关，但究竟如何调节尚有待进一步研究。
参考文献
1. Read SM, et al. Minimixation of variation in the response to different protein of the coomassie blue G dye-binding assay for protein. Anal Biochem 1981；116：53.
, 百拇医药
2. Lurie KG, et al. Increased beta-receptor density in an experimental model of cardiac transplantation J Thorac Cardiovasc Surg 1983；86：195.
3. Lynch CJ, et al. Simultaneous loss and reappearance of α1-adrenergic responses and (3H)-prazosin binding sites in rat liver after irreversible lbockade by phenoxybenzamine. Biochim Biophys Acta 1983；757：156.
4. Fields JZ,et al. Cardiac muscarinic cholinergic receptors: biochemical identification and charac-terization J Biol Chem 1978；253：3251.
, 百拇医药
5. Zivin JA, et al. How to analyze binding, enzyme and uptake data: the simplest case a single phase Life Sci 1982；30：1407.
6. 许增禄，等.大肠杆菌内毒素引起的大鼠组织中去甲肾上腺素组织荧光的变化.中国医学科学院学报 1984；6：421.
7. Liu MS, et al. Myocardial phospholipid methylation in endotoxin shock. Fed Proc 1984；43：416.
8. Sibley DR, et al. Regulation of transmembrane signaling by receptor phosphorylation. Cell 1987；48：913.
, 百拇医药
9. Kunos G, et al. Adrenergic receptors: possible mechanism of inverse regulation of alpha-and beta-receptors. J Allergy Clin Immunol 1985；76：346.
10. Kwatra MM, et al. Correlation of agonist-induced phosphorylation of chick heart muscarinic receptors with receptor desensitiztion. J Biol Chem 1987；262：16314.
11. Van Oosterhout AJM et al. Endotoxin-induced reduction of beta-adrenergic binding sites on splenic lymphocytes in vivo and vitro:its modulation by anterior hypothalamic lesions. Life Sci 1989；44：57.
(1989年8月2日收稿 1990年4月22日修回), 百拇医药
单位：包雅琳 郭恒怡 陶永平 陈华粹(北京，中国协和医科大学病生理教研室 100730)；蔡建强(中国科学院肿瘤医院外科)
关键词：内毒素；休克；受体，肾上腺素能；受体，胆碱能
摘要 用放射性受体结合法研究内毒素休克大鼠心肌β
摘要 用放射性受体结合法研究内毒素休克大鼠心肌β、α1型肾上腺素受体和M型胆碱受体的动态变化。结果表明，注射内毒素后β受体数目逐渐增多，亲和力进行性下降；α1受体数目减少，亲和力不变；M受体亲和力不变，濒死期数目减少。
感染性休克涉及各器官系统的功能变化，其中最明显的是心血管系统。心血管系统主要受交感-肾上腺髓质系统的调节，许多资料表明，感染性休克时患者血浆儿茶酚水平明显变化。有关感染性休克时M型胆碱受体(MAchR)与β、α1型肾上腺素受体(βAR、α1AR)如何变化及相互关系如何尚未见报道。我们对内毒素休克大鼠βAR、α1AR和MAchR的动态变化进行了研究，试图从受体水平揭示感染性休克时心功能障碍的可能机理。
, http://www.100md.com
材料和方法
一、动物模型
体重180～280g的Wistar大鼠，分4组，每组10只，对照组经尾静脉注射生理盐水，3个实验组注射内毒素(16mg/kg，本室自制)分别于注射后0.5小时、3小时和濒死期(以翻正反射消失为指征)将大鼠断头处死，迅速开胸，沿大血管根部离断，取出心脏，用冷生理盐水灌洗，冲去残血，去除脂肪组织、大血管及心房组织，将心室置于-76°C冰箱保存。
另一部分大鼠腹腔注射12%的乌拉坦(10mg/kg)，麻醉后仰卧固定蛙板，颈部正中切口，分离颈外静脉和颈动脉。颈外静脉插管用于注射内毒素(剂量同前)或生理盐水，颈动脉插管经压力传感器连接四导生理记录仪，测量及记录动脉血压。内毒素组每组大鼠23只，对照组10只。
二、细胞膜制备
将心室剪碎，每克组织加于10ml、4°C匀浆缓冲液(Tris-HCl5mmol/L，MgCl2 1mmol/L，)蔗糖0.125mol/L，巯基乙醇 1mmol/L，pH7.5)中，用Polytron匀浆器匀浆，速度为7000r/min，共3次，每次15秒，间歇15秒，随后用4层消毒纱布过滤，于4°C、1000g离心15分钟，将其上清液于4°C、48000g离心30分钟，弃去上清，沉淀悬于βAR孵育缓冲液(Tris-HCl 75mmol/L，MgCl2 25mmol/L，pH7.4)，再次离心，条件同上，沉淀重悬于孵育液，用染料结合法进行蛋白定量[1]。
, 百拇医药
三、受体结合实验
βAR、α1AR和MAchR的结合实验分别按照Lurie等[2～4]方法加以修改。
1. βAR结合实验：4°C，于膜蛋白中加入不同浓度的3H-DHA(0.2～10nmol/L)，并加入心得安(10-4MOL/L)或等量孵育缓冲液，总体积400μl，将此混合物于24°C孵育15分钟，移置冰浴，随后经玻璃纤维滤膜(69#，上海虹光纸厂)真空抽滤，用冷缓冲液冲洗3次，滤膜烘干后置甲苯闪烁液中作放射计数。
2. α1AR和MAchR结合实验：方法基本同上，只是分别以3H-哌唑嗪(0.15～4.8nmol/L)和3H-QNB(0.1～3.2nmol/L)取代3H-DHA，以酚妥拉明(10-4mol/L)和阿托品(10-5mol/L)取代心得安，反应条件分别为25°C、30分钟和37°C、60分钟。孵育缓冲液：α1AR(Tris-HCl5mmol/L，MgCl2 10mmol/L，EGTA 0)5mmol/L，pH7.5)；MAchR(Tris-HCl 10mmol/L，NaCl150mmol/L，pH7.5)；总体积分别为800μl和1000μl。
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四、数据处理及统计学分析
本实验用放射性配体结合法测定受体的最大结合数目(Bmax)和受体的亲和力。受体的特异结合为缺乏(总结合)和存在相应非标记拮抗剂(非特异结合)时所得的放射计数之差(图1)。根据Scatchard作图，直线的横截距为单位组织受体的Bmax，直线的斜率(-1/kd)反映受体的亲和力，其中kd值为受体的解离常数(图2)。根据Eadie-Hofstee方法进行数据处理[5]，注射内毒素各组与对照组之间的差异作非配对t检验。
游离3H-哌唑嗪浓度(nmol/L)
图1 休克临死期心肌α1AR饱和实验
, 百拇医药
3H-哌唑嗪特异结合量(fmol/mg蛋白)
图2 各期休克及对照组心肌α1AR的Scarchard作图
结 果
一、平均动脉压(MAP)的变化
生理盐水对照组的MAP为15.0±0.5kPa，注射内毒素5分钟MAP降至7.9±0.9kPa，与对照组相比，MAP明显降低(P〈0.01)，此后MAP逐渐回升，到30分钟达13.2kPa，但仍明显低于对照组(P〈0.05)，自注射内毒素后30分钟至临死前5～15分钟，MAP一直在此水平波动，临死前MAP降至零。
二、注射内毒素后心肌βAR、α1AR及MAchR的变化
, 百拇医药 3H-DHA、3H-哌唑嗪及3H-QNB与大鼠心室肌细胞膜的结合呈饱和性和单-结合位点型。
注射内毒素后，大鼠心肌βAR的Bmax和kd值比对照组明显增高，并随注射后时间的延长逐渐增大(附表)，表明βAR的数目逐渐增多，亲和力进行性下降。注射内毒素组心肌α1AR的Bmax比对照组明显减小，kd值的变化无统计学意义(附表)，表明注射内毒素可使心肌α1AR数目减少，亲和力不变。注射内毒素3小时以前，心肌MAchR的Bmax有减小的倾向，但与对照组相比差异无显著性，濒死期Bmax比对照组明显减低，各期kd值与对照组相比均无明显变化(附表)。可见，注射内毒素后，仅濒死期的MAchR数目明显减少，而亲和力仍不变。
附表 各组βAR、α1AR和MAchR的Bmax和kd值(
±), 百拇医药
分组
βAR
α1AR
MAchR
Bmax
(fmol/mg)
kd
(nmol/L)
Bmax
(fmol/mg)
kd
(nmol/L)
, http://www.100md.com Bmax
(fmol/mg)
kd
(nmol/L)
对照组
36±4
1.2±0.3
54.9±7.6
0.24±0.09
133±7
0.12±0.02
注射内
毒素后0.5h
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69±13*
4.0±1.1
34.1±2.6*
0.27±0.05
126±9
0.08±0.02
注射内
毒素后3h
96±18*
6.9±1.7*
34.6±2.7*
0.25±0.05
, 百拇医药
106±11
0.05±0.02
注射内
毒素后
濒死期
148±21**
9.0±1.6**
30.8±1.7*
0.26±0.04
82±5**
0.10±0.02
注：与对照组比较 *P〈0.05 ** P〈0.01
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讨 论
大鼠注射内毒素5分钟内血压的急剧下降可能是由于内毒素的直接作用所致。由于血压降低，对颈动脉窦、主动脉弓压力感受器的刺激减弱，反射性激活交感-肾上腺髓质系统，使循环血液中儿茶酚胺增多，引起血压回升。
注射内毒素后心肌βAR的增高在早期可能有一定的代偿意义，因为在注射内毒素0.5～3小时，尽管血压仍明显低于对照组，但却也维持相对恒定状态，可能与此时βAR的增数调节所介导的心缺功能增强有关。在濒死期，由于心肌组织中儿茶酚胺的耗竭[6]及βAR亲和力的显著降低，心肌βAR的增数调节失去其代偿作用。
本实验中βAR的增数调节可能与休克过程中心肌组织儿茶酚胺的逐渐减少有关[6]。βAR亲和力的降低可能与内毒素引起的膜流动性降低有关。因为内毒素可引起心肌膜磷脂酶A2的活性增高，心肌膜磷脂甲基化减少[7]，它们均可导致细胞膜粘滞度增大，流动性减小，βAR侧向运动受阻，亲和力降低。
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注射内毒素后α1AR的减数调节可能是导致心肌对儿茶酚胺反应性降低的原因之一。因为心肌的α1AR也可介导正性变力性作用，它作为一种储备机制，以保证病理状况下心肌对内源性儿茶酚胺的反应能力。α1AR数目的减少则消弱了心肌对儿茶酚胺的反应性。
α1AR数目减少可能与激动剂引起的α1AR磷酸化有关[8]。此外，许多报道证明机体在多种疾病状态下，心肌α1AR可以转化为βAR，调动其储备能力[9]，因而本实验α1AR的减数调节也可能是α1AR转化为βAR的结果。
本实验中仅在濒死期心肌MAchR明显减少。MAchR数目减少似乎对恢复交感-副交感系统的相对平衡有所裨益，但在濒死期由于心肌对儿茶酚胺的反应性已降低，并且心肌组织儿茶酚胺已几乎耗竭，所以MAchR与βAR、α1AR之间失去了相互制约能力，MAchR的减数调节已不足以代偿心肌功能的减退。
, 百拇医药
感染性休克时，迷走-胆碱能系统也可被激活，MAchR的数目减少亦可能与激动剂所致受体磷酸化有关[8]，MAchR磷酸化速度很慢，引起其磷酸化所需激动剂浓度比其产生生理效应所需浓度高得多[10]，这就可以解释MAchR只在濒死期才发生减数调节。
有关受体的异源性调节已引起重视，内毒素可导致糖皮质激素、甲状腺素及雌雄激素的释放增多[11]，这些激素均可引起心肌βAR的增数调节和心肌α1AR向βAR转化。因而本实验结果βAR数目增多、α1AR数目减少，也可能与此有关，但究竟如何调节尚有待进一步研究。
参考文献
1. Read SM, et al. Minimixation of variation in the response to different protein of the coomassie blue G dye-binding assay for protein. Anal Biochem 1981；116：53.
, 百拇医药
2. Lurie KG, et al. Increased beta-receptor density in an experimental model of cardiac transplantation J Thorac Cardiovasc Surg 1983；86：195.
3. Lynch CJ, et al. Simultaneous loss and reappearance of α1-adrenergic responses and (3H)-prazosin binding sites in rat liver after irreversible lbockade by phenoxybenzamine. Biochim Biophys Acta 1983；757：156.
4. Fields JZ,et al. Cardiac muscarinic cholinergic receptors: biochemical identification and charac-terization J Biol Chem 1978；253：3251.
, 百拇医药
5. Zivin JA, et al. How to analyze binding, enzyme and uptake data: the simplest case a single phase Life Sci 1982；30：1407.
6. 许增禄，等.大肠杆菌内毒素引起的大鼠组织中去甲肾上腺素组织荧光的变化.中国医学科学院学报 1984；6：421.
7. Liu MS, et al. Myocardial phospholipid methylation in endotoxin shock. Fed Proc 1984；43：416.
8. Sibley DR, et al. Regulation of transmembrane signaling by receptor phosphorylation. Cell 1987；48：913.
, 百拇医药
9. Kunos G, et al. Adrenergic receptors: possible mechanism of inverse regulation of alpha-and beta-receptors. J Allergy Clin Immunol 1985；76：346.
10. Kwatra MM, et al. Correlation of agonist-induced phosphorylation of chick heart muscarinic receptors with receptor desensitiztion. J Biol Chem 1987；262：16314.
11. Van Oosterhout AJM et al. Endotoxin-induced reduction of beta-adrenergic binding sites on splenic lymphocytes in vivo and vitro:its modulation by anterior hypothalamic lesions. Life Sci 1989；44：57.
(1989年8月2日收稿 1990年4月22日修回), 百拇医药