诊断早早孕的免疫金溶胶斑点法的建立及临床应用
作者：徐肇华 陶义训 王向红 邱留娣 范基农
单位：(上海市临床检验中心，200052)
关键词：妊娠试验，免疫学；促性腺激素，绒毛膜；胶态金，放射性
中华医学杂志920408
摘要 采用两个自制的抗人绒毛膜促性腺激素(hCG)的单克隆抗体，两者分别针对α-hCG和β-hCG上的特异决定簇，以其中一个吸附于硝酸、醋酸混合纤维膜上，另一个结合于直径约为15nm的金溶胶颗粒表面，经过最适条件测试，建立了诊断早早孕的免疫金溶胶斑点法。本法敏感度为50mIU hCG/ml(相当于停经30天左右孕妇尿液中hCG含量)，特异性强，与黄体酮生成素没有交叉反应。对150例停经31～45天妇女尿液进行了检测，结果阳性93例、阴性57例，全部与临床诊断符合。对284例患各种疾病的妇女尿液检查结果，无一例出现假阳性。本法操作简便、快速，试剂稳定性好，是理想的家用化早早孕诊断方法。
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免疫金溶胶斑点法是以硝酸纤维素膜为固相，以金溶胶为标记物的固相免疫学测定法，是近年来发展的一种简便，快速的实验室诊断方法。我们采用两个对人绒毛膜促性腺激素(hCG)有较强亲和性的单克隆抗体(简称单抗)，建立了检测尿液hCG的免疫金溶胶斑点法，经实验及临床试验证实，本方法为一种特异、敏感的早早孕诊断方法，现报道如下。
材料和方法
1、抗hCG单抗的制备及特征：按文献[1]方法制备[1]，获得一系列抗hCG单抗。其中3D5针对β-hCG上的特异决定簇，胶乳凝集效价1：8000，ELISA效价1：1.6×105，与hCG亲和性为6.5×10-10mol/L。B7针对α-hCG，与hCG胶乳无凝集反应，ELISA效价为1：1.6×10-5，亲和性为1×10-8mol/L。两种单抗的免疫球蛋白均为小鼠IgG1。纯化抗体从小鼠腹水中以正辛酸法制备[2]，在聚丙烯酰胺凝胶电泳上显示一条带。
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2、金溶胶抗体结合物[3]：由美国EY实验室制备。B7与3D5均分别制备了金溶胶结合物。溶胶颗粒直径为15nm左右，抗体吸附于颗粒表面。两种结合物均冰冻干燥后保存于密闭的塑料小管，用时以蒸馏水溶解。
3、hCG和黄体生成素(LH)：hCG标准品购自中国药品生物制品检定所，LH为德国Boehringer公司产品。
4、测定装置：分3个部分。(1)小盒：由美国EY实验室提供，为长4cm、宽3cm、高0.6cm的扁盒，分盒底与盒盖二部分，盖上有直径为0.5cm小孔。(2)填料：市售的圆筒手纸。(3)硝酸、醋酸混合纤维素膜(上海市医药工业研究院产品)安装时，把膜放在填料上，置于盒内，盖盒即成。
5、免疫金溶胶斑点法：(1)小盒准备：按上法安装小盒。(2)点样：在硝酸、醋酸混合纤维膜(孔径0.65μm)上加抗体3D5溶液(2mg/ml)1μl，在37℃温箱中干燥15分钟。(3)阻断：在膜上加阻断液100μl(含1%牛血清白蛋白，0.1mol/L NaCl，0.02%NaN3的0.01mol/L，pH7.4Tris-HCl)，该测定盒可立即使用，或在空气中干燥后密封保存。(4)测定：测定时在小孔中加尿液标本150μl，待尿液完全渗入后，加抗体B7金溶胶结合物溶液100μl，液体逐渐渗入后，再加洗涤液100μl(含0.1mol/L NaCl，0.02%NaN3的0.02mol/L pH7.4 Tris-HCl)。(5)结果判定：在白色的纤维素膜背景上呈红色斑点为阳性，没有斑点为阴性。测定全程时间约为1分钟左右。
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6、检测标本：早孕门诊妇女尿液标本由上海市卢湾区妇婴保健院提供。各种疾病妇女尿液标本取自上海各医院的住院病房。
结 果
一、免疫金溶胶斑点法最适条件试验
1、合适的点样量：在纤维素膜上分别加浓度为0.25、0.5、1.0、2.0、3.0及4.0mg/ml的3D5 抗体1μl，使用B7金溶胶测定hCG溶液(含100mIU hCG/ml)。结果表明，抗体浓度从0.25至2.0mg/ml时，斑点色泽随抗体浓度增大而增深，在2.0mg/ml以上，色泽不再增深。因此2.0mg/ml是最适抗体上样浓度，此时每点的抗体总量为2μg。
2、纤维素膜合适的孔径(附表)：从附表可见，综合斑点色泽、清晰程度及背景色泽来看，膜孔径以0.45μm和0.65μm最佳。0.22μm的硝酸纤维素膜与0.22μm的硝酸、醋酸纤维素膜显示相同结果。
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附表 适宜于金溶胶斑点法的最佳纤维素膜孔径 试验结果
纤维素膜孔径(μm)
0.15
0.22
0.3
0.45
0.65
0.8
1.2
斑点色泽
++
++
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++
++
+
+
斑点清晰度
边缘光滑
如左
如左
如左
如左
边缘模糊
如左
背景色泽
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淡红
淡红
淡红
白
白
白
白
3、上样液的合适pH：分别以0.01mol/L pH9.0磷酸缓冲液(PB)及pH为8.5、8.0、7.4、7.0、6.5、6.0的Tris-HCl，制备成3D5溶液(2mg/ml)点样，按上法测定hCG溶液(100mIU/ml)。结果显示，斑点色泽不随上样液的pH变化而改变。由于考虑抗体在pH7.4时比较稳定，因此选用pH7.4 的上样液。
4、合适的抗体组合：在膜上分别加3D5(2mg/ml)，B7(2mg/ml)1μl，然后分别采用B7金溶胶与3D5金溶胶测定hCG 溶液(100mIU/ml)。两者结果完全相同。
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二、免疫金溶胶斑点法特性测定
1、敏感度：以不含hCG的阴性尿液配制hCG系列标准液，浓度为50、100、200、400、800、1000mIU/ml，替代标本测定。结果显示，在50mIU/ml时显示尚能鉴别的淡红色斑点，以后随hCG浓度增高而加深，阴性对照没有斑点。
2、特异性：以不含hCG的阴性尿液配制hCG，LH标准溶液，浓度分别为200、100、50、25mIU/ml，代替尿液标本测定。结果，hCG的各浓度均显示红色斑点，而LH的各浓度溶液均不显示斑点。
3、稳定性：测定盒在37℃温箱中置放3个星期，B7金溶胶结合物在室温中放置半年，测定结果均不改变。
三、临床试验
用金溶胶斑点法对150例停经妇女的尿液进行检测，结果显示阳性93例、阴性57例。93例阳性者中停经天数为32～35、36～40、41～45的分别为10例、46例及37例。经二点一步酶免疫法[4]、同位素检查及临床追查，93例阳性者均确诊为妊娠，在35～40天分组中，有3人为宫外孕。57例阴性者均为非妊娠。另用本法检测284例患各种疾病(肾炎、蛋白尿、血尿、糖尿病、尿路感染及肿瘤等)患者的尿液，结果均为阴性。
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讨 论
单抗B7抗α-hCG及单抗3D5抗β-hCG的特异决定簇，与LH没有结合反应。当B7与3D5组合时，在本测定法中，只有完整的hCG分子才能在固相膜上形成3D5-hCG-B7金溶胶的三联结合物。因此该测定方法特异，与LH没有交叉反应。
在本法的测定装置中，所加液体均从膜中渗入，在抗体点的上方液体均从抗体点渗入，使固相抗体与标本中的hCG、然后与抗体金溶胶颗粒充分结合，因此在1分钟左右即能达到高敏感度测定水平。如果以点样后的纤维素膜浸入hCG溶液1分钟，然后再浸入抗体金溶胶溶液1分钟，即使是hCG含量达到100mIU/ml的溶液，也不能显示斑点痕迹。
用于斑点免疫法诊断妊娠的试剂，现报道的均以酶作为标记物，主要为碱性磷酸酶。以金溶胶颗粒作为标记物的优点是金溶胶能自然显色，而碱性磷酸酶需加底物显色。常用的磷酸吲哚底物不稳定，生产要求严格。因此不但本方法省却了加底物的步骤，也避免了试剂不稳定的缺点。
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本方法的特异性和敏感性已在临床试验中得到证实。我们尚未能取得停经32天以前的早孕妇女的尿液标本进行检测，但从敏感度测定结果(50mIU/ml)推测，本方法可作早至停经后28天左右的妊娠诊断，为简便快速的单份试验，适宜于门诊及家庭中应用。
参考文献
1 徐肇华等，抗hCG单克隆抗体的制备和应用，上海医学检验杂志 1986；1：7。
2 徐肇华等，一种简易的纯化单克隆抗体方法，上海免疫学杂志 1989；9：45。
3 Coppe Ph, et al. The use of Colloidal Gold for Screening Monoclonal Antibodies to Cell Surface Antigens. JImmunol Methods 1985;76:211.
4 徐肇华等，早期妊娠诊断的单克隆抗体二点一步酶免疫法，中华医学杂志 1986；66：459。, http://www.100md.com
单位：(上海市临床检验中心，200052)
关键词：妊娠试验，免疫学；促性腺激素，绒毛膜；胶态金，放射性
中华医学杂志920408
摘要 采用两个自制的抗人绒毛膜促性腺激素(hCG)的单克隆抗体，两者分别针对α-hCG和β-hCG上的特异决定簇，以其中一个吸附于硝酸、醋酸混合纤维膜上，另一个结合于直径约为15nm的金溶胶颗粒表面，经过最适条件测试，建立了诊断早早孕的免疫金溶胶斑点法。本法敏感度为50mIU hCG/ml(相当于停经30天左右孕妇尿液中hCG含量)，特异性强，与黄体酮生成素没有交叉反应。对150例停经31～45天妇女尿液进行了检测，结果阳性93例、阴性57例，全部与临床诊断符合。对284例患各种疾病的妇女尿液检查结果，无一例出现假阳性。本法操作简便、快速，试剂稳定性好，是理想的家用化早早孕诊断方法。
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免疫金溶胶斑点法是以硝酸纤维素膜为固相，以金溶胶为标记物的固相免疫学测定法，是近年来发展的一种简便，快速的实验室诊断方法。我们采用两个对人绒毛膜促性腺激素(hCG)有较强亲和性的单克隆抗体(简称单抗)，建立了检测尿液hCG的免疫金溶胶斑点法，经实验及临床试验证实，本方法为一种特异、敏感的早早孕诊断方法，现报道如下。
材料和方法
1、抗hCG单抗的制备及特征：按文献[1]方法制备[1]，获得一系列抗hCG单抗。其中3D5针对β-hCG上的特异决定簇，胶乳凝集效价1：8000，ELISA效价1：1.6×105，与hCG亲和性为6.5×10-10mol/L。B7针对α-hCG，与hCG胶乳无凝集反应，ELISA效价为1：1.6×10-5，亲和性为1×10-8mol/L。两种单抗的免疫球蛋白均为小鼠IgG1。纯化抗体从小鼠腹水中以正辛酸法制备[2]，在聚丙烯酰胺凝胶电泳上显示一条带。
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2、金溶胶抗体结合物[3]：由美国EY实验室制备。B7与3D5均分别制备了金溶胶结合物。溶胶颗粒直径为15nm左右，抗体吸附于颗粒表面。两种结合物均冰冻干燥后保存于密闭的塑料小管，用时以蒸馏水溶解。
3、hCG和黄体生成素(LH)：hCG标准品购自中国药品生物制品检定所，LH为德国Boehringer公司产品。
4、测定装置：分3个部分。(1)小盒：由美国EY实验室提供，为长4cm、宽3cm、高0.6cm的扁盒，分盒底与盒盖二部分，盖上有直径为0.5cm小孔。(2)填料：市售的圆筒手纸。(3)硝酸、醋酸混合纤维素膜(上海市医药工业研究院产品)安装时，把膜放在填料上，置于盒内，盖盒即成。
5、免疫金溶胶斑点法：(1)小盒准备：按上法安装小盒。(2)点样：在硝酸、醋酸混合纤维膜(孔径0.65μm)上加抗体3D5溶液(2mg/ml)1μl，在37℃温箱中干燥15分钟。(3)阻断：在膜上加阻断液100μl(含1%牛血清白蛋白，0.1mol/L NaCl，0.02%NaN3的0.01mol/L，pH7.4Tris-HCl)，该测定盒可立即使用，或在空气中干燥后密封保存。(4)测定：测定时在小孔中加尿液标本150μl，待尿液完全渗入后，加抗体B7金溶胶结合物溶液100μl，液体逐渐渗入后，再加洗涤液100μl(含0.1mol/L NaCl，0.02%NaN3的0.02mol/L pH7.4 Tris-HCl)。(5)结果判定：在白色的纤维素膜背景上呈红色斑点为阳性，没有斑点为阴性。测定全程时间约为1分钟左右。
, http://www.100md.com
6、检测标本：早孕门诊妇女尿液标本由上海市卢湾区妇婴保健院提供。各种疾病妇女尿液标本取自上海各医院的住院病房。
结 果
一、免疫金溶胶斑点法最适条件试验
1、合适的点样量：在纤维素膜上分别加浓度为0.25、0.5、1.0、2.0、3.0及4.0mg/ml的3D5 抗体1μl，使用B7金溶胶测定hCG溶液(含100mIU hCG/ml)。结果表明，抗体浓度从0.25至2.0mg/ml时，斑点色泽随抗体浓度增大而增深，在2.0mg/ml以上，色泽不再增深。因此2.0mg/ml是最适抗体上样浓度，此时每点的抗体总量为2μg。
2、纤维素膜合适的孔径(附表)：从附表可见，综合斑点色泽、清晰程度及背景色泽来看，膜孔径以0.45μm和0.65μm最佳。0.22μm的硝酸纤维素膜与0.22μm的硝酸、醋酸纤维素膜显示相同结果。
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附表 适宜于金溶胶斑点法的最佳纤维素膜孔径 试验结果
纤维素膜孔径(μm)
0.15
0.22
0.3
0.45
0.65
0.8
1.2
斑点色泽
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边缘光滑
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3、上样液的合适pH：分别以0.01mol/L pH9.0磷酸缓冲液(PB)及pH为8.5、8.0、7.4、7.0、6.5、6.0的Tris-HCl，制备成3D5溶液(2mg/ml)点样，按上法测定hCG溶液(100mIU/ml)。结果显示，斑点色泽不随上样液的pH变化而改变。由于考虑抗体在pH7.4时比较稳定，因此选用pH7.4 的上样液。
4、合适的抗体组合：在膜上分别加3D5(2mg/ml)，B7(2mg/ml)1μl，然后分别采用B7金溶胶与3D5金溶胶测定hCG 溶液(100mIU/ml)。两者结果完全相同。
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二、免疫金溶胶斑点法特性测定
1、敏感度：以不含hCG的阴性尿液配制hCG系列标准液，浓度为50、100、200、400、800、1000mIU/ml，替代标本测定。结果显示，在50mIU/ml时显示尚能鉴别的淡红色斑点，以后随hCG浓度增高而加深，阴性对照没有斑点。
2、特异性：以不含hCG的阴性尿液配制hCG，LH标准溶液，浓度分别为200、100、50、25mIU/ml，代替尿液标本测定。结果，hCG的各浓度均显示红色斑点，而LH的各浓度溶液均不显示斑点。
3、稳定性：测定盒在37℃温箱中置放3个星期，B7金溶胶结合物在室温中放置半年，测定结果均不改变。
三、临床试验
用金溶胶斑点法对150例停经妇女的尿液进行检测，结果显示阳性93例、阴性57例。93例阳性者中停经天数为32～35、36～40、41～45的分别为10例、46例及37例。经二点一步酶免疫法[4]、同位素检查及临床追查，93例阳性者均确诊为妊娠，在35～40天分组中，有3人为宫外孕。57例阴性者均为非妊娠。另用本法检测284例患各种疾病(肾炎、蛋白尿、血尿、糖尿病、尿路感染及肿瘤等)患者的尿液，结果均为阴性。
, http://www.100md.com
讨 论
单抗B7抗α-hCG及单抗3D5抗β-hCG的特异决定簇，与LH没有结合反应。当B7与3D5组合时，在本测定法中，只有完整的hCG分子才能在固相膜上形成3D5-hCG-B7金溶胶的三联结合物。因此该测定方法特异，与LH没有交叉反应。
在本法的测定装置中，所加液体均从膜中渗入，在抗体点的上方液体均从抗体点渗入，使固相抗体与标本中的hCG、然后与抗体金溶胶颗粒充分结合，因此在1分钟左右即能达到高敏感度测定水平。如果以点样后的纤维素膜浸入hCG溶液1分钟，然后再浸入抗体金溶胶溶液1分钟，即使是hCG含量达到100mIU/ml的溶液，也不能显示斑点痕迹。
用于斑点免疫法诊断妊娠的试剂，现报道的均以酶作为标记物，主要为碱性磷酸酶。以金溶胶颗粒作为标记物的优点是金溶胶能自然显色，而碱性磷酸酶需加底物显色。常用的磷酸吲哚底物不稳定，生产要求严格。因此不但本方法省却了加底物的步骤，也避免了试剂不稳定的缺点。
, 百拇医药
本方法的特异性和敏感性已在临床试验中得到证实。我们尚未能取得停经32天以前的早孕妇女的尿液标本进行检测，但从敏感度测定结果(50mIU/ml)推测，本方法可作早至停经后28天左右的妊娠诊断，为简便快速的单份试验，适宜于门诊及家庭中应用。
参考文献
1 徐肇华等，抗hCG单克隆抗体的制备和应用，上海医学检验杂志 1986；1：7。
2 徐肇华等，一种简易的纯化单克隆抗体方法，上海免疫学杂志 1989；9：45。
3 Coppe Ph, et al. The use of Colloidal Gold for Screening Monoclonal Antibodies to Cell Surface Antigens. JImmunol Methods 1985;76:211.
4 徐肇华等，早期妊娠诊断的单克隆抗体二点一步酶免疫法，中华医学杂志 1986；66：459。, http://www.100md.com