抗膀胱癌单克隆抗体BIU-H6的特点及其免疫病理研究
作者：郭应禄 汪迪 俞莉章 黄雅丽 王向红 徐建新 夏同礼 吴阶平
单位：(北京医科大学泌尿外科研究所)
关键词：膀胱肿瘤；抗体，单克隆；病理学
中华医学杂志920407
摘要 采用特异性较好的抗膀胱癌单克隆抗体BIU-H6，对34例各种膀胱癌及5例正常膀胱的石蜡组织切片用ABC免疫酶法进行了分析。结果BIU-H6与正常膀胱上皮及膀胱腺癌呈阴性反应；与原位癌、鳞癌和不同期/级的移行上皮癌呈阳性反应，但程度不同。结果表明BIU-H6识别的抗原是分化差、浸润性膀胱移行上皮癌有关的肿瘤标志。
抗肿瘤单克隆抗体(McAb)用于肿瘤的早期诊断、组织分型、病程分期、合理治疗方案的选择、导向治疗及预后的判断是近年引人注目的研究课题。抗膀胱癌相关抗原McAb的制备国内外曾有报道[1～5]。我们在制备了特异性较好的抗膀胱癌相关抗原McAb BIU-H6后，用其与这些组织尤其是与移行上皮癌的反应情况，为抗膀胱癌McAb进一步用于临床诊断和治疗奠定基础。
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材料与方法
一、McAb BIU-H6的制备
1、细胞：膀胱移行上皮癌细胞系BIU-87、E-J，肝癌1302，SMMC-7721、BEL-7402，胃癌Kato-III、BGC-823、MGC-803，宫颈癌801，肺癌A-549，乳腺癌MCF-7，直肠癌Lovo，白血病K-562，小鼠骨髓瘤SP2/0。正常人肝细胞、枯否氏细胞、肾小球系膜细胞及成纤维细胞。
2、抗原：参照阮书田等[6]的方法，以正常人淋巴细胞免疫Balb/c鼠后获得鼠抗人淋巴细胞血清，用其封闭免疫原BIU-87细胞后再行免疫小鼠。
3、免疫、融合：用上述1.2×107抗原细胞首次免疫3只小鼠，4周后加强免疫(1.0×107细胞)1次，再4天后取鼠脾细胞与小鼠SP2/0骨髓瘤细胞10：1混合行细胞融合。方法参照文献[7]。
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4、筛选、克隆化培养：采用ABC-ELISA法和间接免疫荧光(IIF)法进行。筛选出与BIU-87细胞反应阳性、同正常膀胱膜抗原及正常淋巴细胞反应阴性的杂交瘤克隆。以有限稀释法克隆化后扩增，留取培养上清，制备腹水。
5、基本特性鉴定：双向免疫扩散法鉴定所得McAb的免疫球蛋白类型。ABC-ELISA法和IIF法测定所得腹水中McAb的效价。
6、McAb特异性的鉴定：将McAb BIU-H6分别与正常人红细胞、白细胞、正常骨髓细胞；前述正常细胞、瘤细胞系；正常胎儿组织、成人组织和肿瘤组织的冰冻切片用ABC-ELISA法和IIF法进行鉴定，确定其特异程度。
7、BIU-H6对应抗原分子量的测定：BIU-87膀胱癌细胞膜蛋白粗提物经SDS-PAGE分离后，以Western-blot法测定McAb BIU-H6所识别抗原的分子量。
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二、McAb BIU-H6对膀胱癌的免疫分析
1、组织切片：34例膀胱癌病人的肿瘤组织石蜡切片(移行上皮癌28例，鳞癌1例，腺癌3例，原位癌2例)均经病理学专家复查确定。其中移行上皮癌按Broder分级为：G1 9例，G215例，G34例；按UICC国际分期为T1以上(Ta，T1)17例，T2以下(T2～T4)11例。
2、方法：采用Vector实验室所产ABC药盒，详细步骤参见试剂说明书。
结 果
一、McAb BIU-H6的产生
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1、融合及筛选：第1次融合失败；第2次融合后6天镜下见杂交瘤细胞集落生长，生长率为152/240。筛选得35个阳性孔，经3次有限稀释克隆化后选出10个不与正常淋巴细胞反应的克隆。BIU-H6是最好的3个克隆之一。
2、腹水中 McAb BIU-H6效价的测定及免疫球蛋白类型的鉴定：BIU-H6腹水稀释至1：12800倍时，仍可见免疫原细胞有明显的荧光反应，最佳稀释度为1：200～400倍(图1)。
3、BIU-H6特异性鉴定：与5种正常人细胞，93例外周血淋巴细胞，15例各种ABO血型的红细胞及10例正常骨髓细胞经IIF法检测均呈阴性反应。在与非膀胱癌细胞系的检测中，仅同肝癌细胞系有交叉。冰冻组织切片的检测结果显示BIU-H6在所测定的12种非膀胱癌肿瘤组织中只同肝、前列腺及肾盂癌可疑交叉，而与14种正常成人组织切片无交叉反应。BIU-H6亦不同一个5月龄正常胎儿的各种组织起反应。
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4、BIU-H6所识别抗原分子量的测定：膀胱癌BIU-87细胞的粗制膜抗原经SDS-PAGE，电转移至硝酸纤维膜上，Western-blot法测得BIU-H6所识别的抗原分子量为102000(图2)。
5、BIU-H6用于膀胱癌的免疫病理分析：ABC免疫酶法以BIU-H6对各种膀胱癌进行染色分析，结果显示，正常膀胱上皮除个别伞状细胞染色外，其余细胞均呈阴性反应(图3)。原位癌2例染色为(+++)。3例腺癌染色呈阴性。1例鳞癌染色(+++)(图4)。各种级/期的移行上皮癌均有染色，但程度有很大不同：G1膀胱移行上皮癌染色主要在肿瘤上皮表层(图5)，染色程度为(+)～(+++)；G2肿瘤细胞染色较G1者明显增多，染色亦加深，为(++)～(+++)；G3肿瘤几乎所有癌细胞均重度染色(图6)。浸润性移行上皮癌(11例)的染色(+++～++++)较浅表性者(17例)染色(+～+++)重，但后组中有2例染色较重而近于浸润癌组。
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讨 论
McAb BIU-H6是以鼠抗人淋巴细胞血清封闭后的膀胱癌细胞系为抗原免疫小鼠而得到的。国内外尚无此种方法制备抗膀胱癌McAb的文献报道。本法制备的McAb理论上讲是高特异性的。因为免疫原表面的膀胱癌非相关抗原均已被封闭。实际鉴定结果与这一设想基本符合。BIU-H6具有滴度高、特异性高的特点。它所识别的抗原不是ABO(H)血型物质抗原，亦不是胚胎抗原。由BIU-H6对应抗原分子量的测定结果还可知其不是AFP或CEA。因而BIU-H6识别的是膀胱癌相关抗原。
本实验用BIU-H6 McAb以ABC免疫酶法对正常膀胱上皮及不同类型膀胱癌的肿瘤标本石蜡切片进行了检测，发现正常膀胱上皮仅个别伞状细胞染色；原位癌、鳞癌染色为阳性；腺癌染色阴性；28例移行上皮癌有程度不同的染色，其中9例G1肿瘤着色主要在表层瘤细胞，而4例G3肿瘤几乎全部癌细胞均重度着色，15例G2肿瘤染色不均一，但都较G1者深而近于G3肿瘤。提示BIU-H6识别的抗原在分化程度不同的膀胱移行上皮癌中表达不同，分化越差，肿瘤抗原表达越多。表明BIU-H6抗原与肿瘤分级有关。11例浸润性膀胱癌中大部重度染色，说明BIU-H6识别的抗原在浸润性癌细胞上有更多的表达，提示BIU-H6抗原可能与肿瘤的浸润有关。
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Fradet等[8]和Longin等[9]用抗膀胱癌McAb对各级浅表性和浸润性膀胱癌的研究亦表明他们制备的McAb所对应的抗原与肿瘤分级/期有关。在浅表性G1膀胱癌中抗原表达最多(88%，79.5%)，在浸润性G3肿瘤中表达较少(15%，14%)。这和本组的结果有区别，其抗原表达随肿瘤分级/期增高而减 弱，不是增强。Longin等[9]认为，随着细胞恶性程度的变化，其表面抗原亦发生变化，可呈现为原有抗原的缺失，亦可为新抗原的增多。我们的结果支持这一论点。
BIU-H6 McAb对34例膀胱癌的免疫病理分析表明，它识别的抗原在腺癌中不表达；在原位癌和鳞癌中表达；在各级/期移行上皮癌均有表达，但强弱不等，有一定规律。我们认为，BIU-H6抗原可能是与移行上皮癌分化、浸润相关的肿瘤标志。对这一抗原的研究能帮助人们从免疫学角度更全面地认识膀胱癌的生物学特性，有助于对膀胱癌预后的判断。另外，17例浅表性膀胱癌中2例重度染色，除与分级有关外，是否还预示着它们的浸润能力更强，会发展成浸润癌？这有待更多病例的积累和进一步临床观察。如被证实则对浅表性膀胱癌的预后判断有很大意义。因为，虽然病理学统计数字显示G1、G2、G3膀胱癌的浸润性分别为10%、50%、80%，但不能区别何例会发生浸润，而本研究用抗膀胱癌单抗进行免疫病理学分析提供了发现这种病例的可能，从而能对临床治疗起指导作用。
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由于肿瘤细胞在生长分化过程中生物学特性的不断变化，使肿瘤细胞表面抗原也随之表现出异质性，抗原表达复杂多样。而McAb只识别复杂抗原上的某一决定簇，只能辨认某类肿瘤的某一亚型或肿瘤进程的某一期，因此，需要多个特异性高的McAb才能更全面系统地识别肿瘤各亚型或各期的特性。本文报告的McAb BIU-H3主要同分化差的浸润性肿瘤明显反应，为今后临床诊断、治疗这类肿瘤提供了一个新的手段。
图1 单抗BIU-H6与BIU-87抗原细胞反应结果，可见荧光主要分布于肿瘤细胞膜 IIF法×210
图2 单抗BIU-H6与BIU-87细胞膜抗原 Western-blot 检测结果，BIU-H6抗原为102KD
图3 正常膀胱移行上皮与单抗BIU-H6的反应结果，个别伞状细胞染色，余均呈阴性反应 ABC-ELISA加HE复染 ×80
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图4 单抗BIU-H6与膀胱鳞癌的染色结果，上皮细胞均被染色，呈阳性反应 ABC-ELISA加HE复染 ×80
图5 单抗BIU-H6与膀胱移行上皮癌(G1)的染色结果，染色主要分布于表层肿瘤细胞，呈阳性反应 ABC-ELISA加HE复染 ×100
图6 单抗BIU-H6与膀胱移行上皮癌(G3、T3)的染色结果，全部肿瘤细胞均重度染色，呈阳性反应 ABC-ELISA加HE复染 ×210
参考文献
1 Grossman HB, et al. Hybridoma antibodies reactive with human bladder carcinoma cell surface antigens. J Urol 1983;130:610.
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2 Fradet Y, et al. Cell surface antigens of human bladder cancer defined by mouse monoclonal antibodies. Proc Natl Acad Sci USA 1984;81:224.
3 Takahashi N, et al. Monoclonal antibody to human transitional cell carcinoma of the bladder: production and characterization. J Urol 1987; 138:207.
4 Koho H, et al. Monoclonal antibody to antigens associated with transitional cell carcinoma of the human urinary bladder. Cancer Immunol Immunother 1984;17:156.
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5 俞莉章等，一株抗膀胱癌单克隆抗体的产生和初步鉴定，北京医科大学学报 1989；21：380。
6 阮书田等，抗人肺癌细胞单克隆抗体的制备及特性的研究，中华结构和呼吸疾病杂志 1985；8：65。
7 王文章，细胞杂交瘤技术与单克隆抗体的应用，沈阳：辽宁科学技术出版社，1986；46-58。
8 Fradet Y, et al. Cell surface antigens of bladder tumors:definition of tumor subsets by monoclonal antibodies and correlation with growth characteristics. Cancer Res 1986;46:5183.
9 Longin A, et al. A monoclonal antibody (Bl2-10D1)reacting with a bladder cancer associated-anti-gen. Int J Cancer 1989;43:183., 百拇医药
单位：(北京医科大学泌尿外科研究所)
关键词：膀胱肿瘤；抗体，单克隆；病理学
中华医学杂志920407
摘要 采用特异性较好的抗膀胱癌单克隆抗体BIU-H6，对34例各种膀胱癌及5例正常膀胱的石蜡组织切片用ABC免疫酶法进行了分析。结果BIU-H6与正常膀胱上皮及膀胱腺癌呈阴性反应；与原位癌、鳞癌和不同期/级的移行上皮癌呈阳性反应，但程度不同。结果表明BIU-H6识别的抗原是分化差、浸润性膀胱移行上皮癌有关的肿瘤标志。
抗肿瘤单克隆抗体(McAb)用于肿瘤的早期诊断、组织分型、病程分期、合理治疗方案的选择、导向治疗及预后的判断是近年引人注目的研究课题。抗膀胱癌相关抗原McAb的制备国内外曾有报道[1～5]。我们在制备了特异性较好的抗膀胱癌相关抗原McAb BIU-H6后，用其与这些组织尤其是与移行上皮癌的反应情况，为抗膀胱癌McAb进一步用于临床诊断和治疗奠定基础。
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材料与方法
一、McAb BIU-H6的制备
1、细胞：膀胱移行上皮癌细胞系BIU-87、E-J，肝癌1302，SMMC-7721、BEL-7402，胃癌Kato-III、BGC-823、MGC-803，宫颈癌801，肺癌A-549，乳腺癌MCF-7，直肠癌Lovo，白血病K-562，小鼠骨髓瘤SP2/0。正常人肝细胞、枯否氏细胞、肾小球系膜细胞及成纤维细胞。
2、抗原：参照阮书田等[6]的方法，以正常人淋巴细胞免疫Balb/c鼠后获得鼠抗人淋巴细胞血清，用其封闭免疫原BIU-87细胞后再行免疫小鼠。
3、免疫、融合：用上述1.2×107抗原细胞首次免疫3只小鼠，4周后加强免疫(1.0×107细胞)1次，再4天后取鼠脾细胞与小鼠SP2/0骨髓瘤细胞10：1混合行细胞融合。方法参照文献[7]。
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4、筛选、克隆化培养：采用ABC-ELISA法和间接免疫荧光(IIF)法进行。筛选出与BIU-87细胞反应阳性、同正常膀胱膜抗原及正常淋巴细胞反应阴性的杂交瘤克隆。以有限稀释法克隆化后扩增，留取培养上清，制备腹水。
5、基本特性鉴定：双向免疫扩散法鉴定所得McAb的免疫球蛋白类型。ABC-ELISA法和IIF法测定所得腹水中McAb的效价。
6、McAb特异性的鉴定：将McAb BIU-H6分别与正常人红细胞、白细胞、正常骨髓细胞；前述正常细胞、瘤细胞系；正常胎儿组织、成人组织和肿瘤组织的冰冻切片用ABC-ELISA法和IIF法进行鉴定，确定其特异程度。
7、BIU-H6对应抗原分子量的测定：BIU-87膀胱癌细胞膜蛋白粗提物经SDS-PAGE分离后，以Western-blot法测定McAb BIU-H6所识别抗原的分子量。
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二、McAb BIU-H6对膀胱癌的免疫分析
1、组织切片：34例膀胱癌病人的肿瘤组织石蜡切片(移行上皮癌28例，鳞癌1例，腺癌3例，原位癌2例)均经病理学专家复查确定。其中移行上皮癌按Broder分级为：G1 9例，G215例，G34例；按UICC国际分期为T1以上(Ta，T1)17例，T2以下(T2～T4)11例。
2、方法：采用Vector实验室所产ABC药盒，详细步骤参见试剂说明书。
结 果
一、McAb BIU-H6的产生
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1、融合及筛选：第1次融合失败；第2次融合后6天镜下见杂交瘤细胞集落生长，生长率为152/240。筛选得35个阳性孔，经3次有限稀释克隆化后选出10个不与正常淋巴细胞反应的克隆。BIU-H6是最好的3个克隆之一。
2、腹水中 McAb BIU-H6效价的测定及免疫球蛋白类型的鉴定：BIU-H6腹水稀释至1：12800倍时，仍可见免疫原细胞有明显的荧光反应，最佳稀释度为1：200～400倍(图1)。
3、BIU-H6特异性鉴定：与5种正常人细胞，93例外周血淋巴细胞，15例各种ABO血型的红细胞及10例正常骨髓细胞经IIF法检测均呈阴性反应。在与非膀胱癌细胞系的检测中，仅同肝癌细胞系有交叉。冰冻组织切片的检测结果显示BIU-H6在所测定的12种非膀胱癌肿瘤组织中只同肝、前列腺及肾盂癌可疑交叉，而与14种正常成人组织切片无交叉反应。BIU-H6亦不同一个5月龄正常胎儿的各种组织起反应。
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4、BIU-H6所识别抗原分子量的测定：膀胱癌BIU-87细胞的粗制膜抗原经SDS-PAGE，电转移至硝酸纤维膜上，Western-blot法测得BIU-H6所识别的抗原分子量为102000(图2)。
5、BIU-H6用于膀胱癌的免疫病理分析：ABC免疫酶法以BIU-H6对各种膀胱癌进行染色分析，结果显示，正常膀胱上皮除个别伞状细胞染色外，其余细胞均呈阴性反应(图3)。原位癌2例染色为(+++)。3例腺癌染色呈阴性。1例鳞癌染色(+++)(图4)。各种级/期的移行上皮癌均有染色，但程度有很大不同：G1膀胱移行上皮癌染色主要在肿瘤上皮表层(图5)，染色程度为(+)～(+++)；G2肿瘤细胞染色较G1者明显增多，染色亦加深，为(++)～(+++)；G3肿瘤几乎所有癌细胞均重度染色(图6)。浸润性移行上皮癌(11例)的染色(+++～++++)较浅表性者(17例)染色(+～+++)重，但后组中有2例染色较重而近于浸润癌组。
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讨 论
McAb BIU-H6是以鼠抗人淋巴细胞血清封闭后的膀胱癌细胞系为抗原免疫小鼠而得到的。国内外尚无此种方法制备抗膀胱癌McAb的文献报道。本法制备的McAb理论上讲是高特异性的。因为免疫原表面的膀胱癌非相关抗原均已被封闭。实际鉴定结果与这一设想基本符合。BIU-H6具有滴度高、特异性高的特点。它所识别的抗原不是ABO(H)血型物质抗原，亦不是胚胎抗原。由BIU-H6对应抗原分子量的测定结果还可知其不是AFP或CEA。因而BIU-H6识别的是膀胱癌相关抗原。
本实验用BIU-H6 McAb以ABC免疫酶法对正常膀胱上皮及不同类型膀胱癌的肿瘤标本石蜡切片进行了检测，发现正常膀胱上皮仅个别伞状细胞染色；原位癌、鳞癌染色为阳性；腺癌染色阴性；28例移行上皮癌有程度不同的染色，其中9例G1肿瘤着色主要在表层瘤细胞，而4例G3肿瘤几乎全部癌细胞均重度着色，15例G2肿瘤染色不均一，但都较G1者深而近于G3肿瘤。提示BIU-H6识别的抗原在分化程度不同的膀胱移行上皮癌中表达不同，分化越差，肿瘤抗原表达越多。表明BIU-H6抗原与肿瘤分级有关。11例浸润性膀胱癌中大部重度染色，说明BIU-H6识别的抗原在浸润性癌细胞上有更多的表达，提示BIU-H6抗原可能与肿瘤的浸润有关。
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Fradet等[8]和Longin等[9]用抗膀胱癌McAb对各级浅表性和浸润性膀胱癌的研究亦表明他们制备的McAb所对应的抗原与肿瘤分级/期有关。在浅表性G1膀胱癌中抗原表达最多(88%，79.5%)，在浸润性G3肿瘤中表达较少(15%，14%)。这和本组的结果有区别，其抗原表达随肿瘤分级/期增高而减 弱，不是增强。Longin等[9]认为，随着细胞恶性程度的变化，其表面抗原亦发生变化，可呈现为原有抗原的缺失，亦可为新抗原的增多。我们的结果支持这一论点。
BIU-H6 McAb对34例膀胱癌的免疫病理分析表明，它识别的抗原在腺癌中不表达；在原位癌和鳞癌中表达；在各级/期移行上皮癌均有表达，但强弱不等，有一定规律。我们认为，BIU-H6抗原可能是与移行上皮癌分化、浸润相关的肿瘤标志。对这一抗原的研究能帮助人们从免疫学角度更全面地认识膀胱癌的生物学特性，有助于对膀胱癌预后的判断。另外，17例浅表性膀胱癌中2例重度染色，除与分级有关外，是否还预示着它们的浸润能力更强，会发展成浸润癌？这有待更多病例的积累和进一步临床观察。如被证实则对浅表性膀胱癌的预后判断有很大意义。因为，虽然病理学统计数字显示G1、G2、G3膀胱癌的浸润性分别为10%、50%、80%，但不能区别何例会发生浸润，而本研究用抗膀胱癌单抗进行免疫病理学分析提供了发现这种病例的可能，从而能对临床治疗起指导作用。
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由于肿瘤细胞在生长分化过程中生物学特性的不断变化，使肿瘤细胞表面抗原也随之表现出异质性，抗原表达复杂多样。而McAb只识别复杂抗原上的某一决定簇，只能辨认某类肿瘤的某一亚型或肿瘤进程的某一期，因此，需要多个特异性高的McAb才能更全面系统地识别肿瘤各亚型或各期的特性。本文报告的McAb BIU-H3主要同分化差的浸润性肿瘤明显反应，为今后临床诊断、治疗这类肿瘤提供了一个新的手段。
图1 单抗BIU-H6与BIU-87抗原细胞反应结果，可见荧光主要分布于肿瘤细胞膜 IIF法×210
图2 单抗BIU-H6与BIU-87细胞膜抗原 Western-blot 检测结果，BIU-H6抗原为102KD
图3 正常膀胱移行上皮与单抗BIU-H6的反应结果，个别伞状细胞染色，余均呈阴性反应 ABC-ELISA加HE复染 ×80
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图4 单抗BIU-H6与膀胱鳞癌的染色结果，上皮细胞均被染色，呈阳性反应 ABC-ELISA加HE复染 ×80
图5 单抗BIU-H6与膀胱移行上皮癌(G1)的染色结果，染色主要分布于表层肿瘤细胞，呈阳性反应 ABC-ELISA加HE复染 ×100
图6 单抗BIU-H6与膀胱移行上皮癌(G3、T3)的染色结果，全部肿瘤细胞均重度染色，呈阳性反应 ABC-ELISA加HE复染 ×210
参考文献
1 Grossman HB, et al. Hybridoma antibodies reactive with human bladder carcinoma cell surface antigens. J Urol 1983;130:610.
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2 Fradet Y, et al. Cell surface antigens of human bladder cancer defined by mouse monoclonal antibodies. Proc Natl Acad Sci USA 1984;81:224.
3 Takahashi N, et al. Monoclonal antibody to human transitional cell carcinoma of the bladder: production and characterization. J Urol 1987; 138:207.
4 Koho H, et al. Monoclonal antibody to antigens associated with transitional cell carcinoma of the human urinary bladder. Cancer Immunol Immunother 1984;17:156.
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5 俞莉章等，一株抗膀胱癌单克隆抗体的产生和初步鉴定，北京医科大学学报 1989；21：380。
6 阮书田等，抗人肺癌细胞单克隆抗体的制备及特性的研究，中华结构和呼吸疾病杂志 1985；8：65。
7 王文章，细胞杂交瘤技术与单克隆抗体的应用，沈阳：辽宁科学技术出版社，1986；46-58。
8 Fradet Y, et al. Cell surface antigens of bladder tumors:definition of tumor subsets by monoclonal antibodies and correlation with growth characteristics. Cancer Res 1986;46:5183.
9 Longin A, et al. A monoclonal antibody (Bl2-10D1)reacting with a bladder cancer associated-anti-gen. Int J Cancer 1989;43:183., 百拇医药