性连锁遗传性鱼鳞病基因缺失的研究
作者：李明发 蒋清 高翼之 骆丹 屈冰心 蒋仲元
单位：(南京铁道医学院生物学教研室 210009)李明发 蒋清 高翼之；(南京铁道医学院附属医院皮肤科)骆丹 屈冰心 蒋仲元
关键词：遗传性疾病；鳞癣；聚合酶链反应；基因缺失
中华医学杂志920406
摘要 应用多重聚合酶链反应技术对7个性连锁遗传性鱼鳞病家系中7例患者的类固醇硫酸酯酶基因(STS)的突变性质进行了检测。结果表明，有5例患者表现为STS基因全长丢失，占71.4%。本研究结果为该病的基因诊断提供了一种快速而简便的方法。
性连锁遗传性鱼鳞病是最常见的性连锁隐性遗传病之一。该病的生化缺陷表现为患者体内类固醇硫酸酯酶(steroid sulfatase,STS)活性缺乏[1]。STS基因被定位于Xp22.3，该基因由10个外显子组成，全长为140kb[2]。1987年，Ballabio等人成功地从人胎盘cDNA文库中筛选到STS基因全长的cDNA分子。分子杂交结果发现，大部分遗传性鱼鳞病患者为整个STS基因缺失，小部分病例为该基因的部分缺失[3，4]。我们根据STS基因的结构，合成了位于该基因5'和3'端的两对寡聚核苷酸引物，利用多重聚合酶链反应(multiplex poly-merase chain，MPCR)技术检测遗传性鱼鳞病患者基因组内STS基因缺失情况，力求确立STS基因的突变性质，为该病的基因诊断提供一种快速而简便的方法。
, http://www.100md.com
对象和方法
一、对象
从7个遗传性鱼鳞病家系中各选择1例患者进行了研究。该病诊断依据为典型的临床症状、体征、家族史及病理学检查。7个家系中有5个家系表现出特征性的性连锁隐性遗传病系谱特点(图1)。7个家系中共13例患者均为男性。他们发病的共同特点是出生时即有或出生后不久出现症状，鳞屑较大而且显著，分布全身，以四肢、躯干、颈部为最明显，并累及四肢屈侧和皱折部位。症状不随年龄增长而减轻或加重。对其中5例患者的母亲也同时进行了检测。另选择2例寻常型鱼鳞病患者作为对照。
图1 家系7的系谱图，先证者还患有软骨发育不全性侏儒症和智力低下
二、研究方法
1、外周血DNA标本的制备：取受检者外周血约1ml，按微量法从淋巴细胞中提取高分子量基因组DNA[5]，供PCR扩增用。
, 百拇医药
2、寡聚核苷酸引物的合成：应用ABI380A型DNA合成仪(美国ABI公司)合成2对引物，其核苷酸序列见附表。
3 MPCR扩增及扩增产物的检测：受检个体基因组DNA0.5μg在5U的Taq聚合酶(美国Perkin Elmer Cetus公司)催化下，按下列条件进行PCR反应：93℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸2分钟，周期为30次，末次循环延伸在72℃维持10分钟。反应体积为50μl，反应体系中加入200μmol/L的四种脱氧核苷三磷酸和1μmol/L的每对引物。MPCR反应在美国Perkin Elmer Cetus公司的DNA热循环仪上进行。为排除假阴性结果，每个PCR反应体系中除STS基因2对引物外，还同时加入1对扩增DMD(Duchenne muscular dystrophy)基因的引物，其扩增片段大小为268bp，作为STS基因MPCR的阳性内对照。
扩增后的DNA产物取20μl在2%琼脂糖凝胶上按3.7V/cm电泳约1小时，EB染色后直接在紫外线检测仪下观察扩增结果。
, 百拇医药
附表 STS-PCR寡聚核苷酸引物 寡聚核苷酸引物
扩增区域
扩增大小
5'STS基因
F-5'GGCCTAGAAGAAGGTTGAAGGTCCC
292bp
R-5'AAGAGGTTGGATGAGATGGGCATAC
3'STS基因
F-5'GAAATCCTCAAAGTCATGCAGGAAG
363bp
, 百拇医药 R-5'CCTCCAGTTGAGTAGCTGTTGAGCT
结 果
基因MPCR扩增结果见图2。5例患者的母亲及2例寻常型鱼鳞病患者的DNA标本经扩增后在紫外线检测仪下可见位于STS基因5'端和3'端的两种扩增片段，大小分别是292bp和363bp。7例患者中有5例(例2，3，4，5，7)未见STS基因的2条扩增带，表明其余长的STS基因发生丢失，其他2例(例1，6)可见完整的2条扩增带，提示可能为非缺失型或部分缺失型。图2中例2除阳性内对照扩增带之外，隐约可见292bp的扩增带，同时例3未见阳性内对照扩增带。为明确实验结果，对上述两标本再次扩增，阳性内对照改为DMD基因的另1对引物，大小为547bp，扩增结果表明例2、3均为STS基因全长丢失(图3)。
注：1～7示7例遗传性鱼鳞病患者，2'、4'、5'、6'、7'分别示例2、4、5、6、7的母亲，a、b示2例寻常型鱼鳞病患者 MW示分子量标准 ψX174/HaeIII
, 百拇医药
图2 14例受检者STS基因MPCR扩增结果
注：1～5分别对应于图2的3、2'、2、4'、4
图3 例2、3标本再次MPCR扩增结果
讨 论
MPCR技术是一种快速、灵敏的检测手段。该方法所需的模板DNA不超过500ng，从开始PCR反应到报告结果仅用5小时，扩增结果经电泳、染色后在紫外线检测仪下可直接观察，因此，特别适用于突变方式为基因缺失的遗传病的快速基因诊断[6]。我们合成了位于STS基因5'和3'端的2对引物用于MPCR扩增。由于STS基因在大部分遗传性鱼鳞病患者体内表现为全长基因丢失[3，4]，所以扩增上述两个特异性区域可达到检测出大部分STS基 因缺失型患者的目的。本研究结果表明，约71.4%(5/7)患者表现为STS基因全长丢失，这和国外学者的报道相吻合[7]。已知STS基因长达140kb，因此，随着检测样本数的增加还有可能检出基因部分缺失型病例。而对于可能发生在基因中部的部分缺失，仅扩增上述两个区域难以检出。本组有2例未见基因缺失，其突变性质有待于深入探究。
, 百拇医药
2例寻常型鱼鳞病患者的DNA标本经MPCR扩增后，未见扩增片段的丢失，提示MPCR可望成为临床上鉴别寻常型和遗传性鱼鳞病的有效手段。目前，对遗传性鱼鳞病缺乏有效的治疗手段，对于症状、体征严重的患病家系，可利用MPCR技术进行产前基因诊断，防止患儿的出生。
最近，国外报道在少数遗传性鱼鳞病患者体内，STS基因的全长丢失可能累及该基因邻近的其它位点，从而导致“邻接基因综合征”(contiguous gene syndrome)[8]。因此，扩大STS基因MPCR扩增范围可筛选和检测出邻接基因综合征患者体内包括STS基因在内的多个相邻基因的缺失。本组例7除遗传性鱼鳞病外，还患有软骨发育不全性侏儒及智力低下，利用上述扩大的MPCR可望确定包括多个邻近基因在内的缺失范围。
第二军医大学附属长海医院皮肤科郑茂荣教授及中国医学科学院皮肤病学研究所夏隆庆教授提供部分病例并给予指教，特此致谢
, http://www.100md.com
参考文献
1 Shapiro LJ. Steroid sulfatase deficiency and X-linked ichthyosis. In:Scriver CR, et al, eds. The metabolic basis of inherited disease. 6th ed. New York: McGraw-Hill. 1989:1945-1964.
2 Yen PH, et al. The human X-linked steroid sulfatase gene and a Y-encoded pseudogene: evidence for and inversion of the Y chromosome during primate evolution, Cell 1989;55:1123.
3 Ballabio A, et al. Isolation and characterization of a steroid sulfataes cDNA clone: genomic deletions in patients with X-linked ichthyosis. Proc Natl Acad Sci 1987;84:4519.
, http://www.100md.com
4 Ballabio A, et al. Molecular heterogeneity of steroid sulfatase deficiency: a multicenter study on 57 unrelated patients, at DNA and protein levels. Genomics 1989;4:36.
5 沈岩等，利用TLS提取染色体DNA，生物化学和生物物理进展 1989；16：221。
6 Chamberlain JS, et al. Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus by multiplex DNA amplification. Nucleic Acids Res 1988;16:11141.
7 Ballabio A, et al. Screening for steroid sulfatase(STS)gene deletions by multiplex DNA amplification. Hum Genet 1990;84:571.
8 Ballbio A, et al. Contiguous gene syndromes due to deletions in the distal short arm of the human X chromosome. Proc Natl Acad Sci 1989;86:10001., 百拇医药
单位：(南京铁道医学院生物学教研室 210009)李明发 蒋清 高翼之；(南京铁道医学院附属医院皮肤科)骆丹 屈冰心 蒋仲元
关键词：遗传性疾病；鳞癣；聚合酶链反应；基因缺失
中华医学杂志920406
摘要 应用多重聚合酶链反应技术对7个性连锁遗传性鱼鳞病家系中7例患者的类固醇硫酸酯酶基因(STS)的突变性质进行了检测。结果表明，有5例患者表现为STS基因全长丢失，占71.4%。本研究结果为该病的基因诊断提供了一种快速而简便的方法。
性连锁遗传性鱼鳞病是最常见的性连锁隐性遗传病之一。该病的生化缺陷表现为患者体内类固醇硫酸酯酶(steroid sulfatase,STS)活性缺乏[1]。STS基因被定位于Xp22.3，该基因由10个外显子组成，全长为140kb[2]。1987年，Ballabio等人成功地从人胎盘cDNA文库中筛选到STS基因全长的cDNA分子。分子杂交结果发现，大部分遗传性鱼鳞病患者为整个STS基因缺失，小部分病例为该基因的部分缺失[3，4]。我们根据STS基因的结构，合成了位于该基因5'和3'端的两对寡聚核苷酸引物，利用多重聚合酶链反应(multiplex poly-merase chain，MPCR)技术检测遗传性鱼鳞病患者基因组内STS基因缺失情况，力求确立STS基因的突变性质，为该病的基因诊断提供一种快速而简便的方法。
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对象和方法
一、对象
从7个遗传性鱼鳞病家系中各选择1例患者进行了研究。该病诊断依据为典型的临床症状、体征、家族史及病理学检查。7个家系中有5个家系表现出特征性的性连锁隐性遗传病系谱特点(图1)。7个家系中共13例患者均为男性。他们发病的共同特点是出生时即有或出生后不久出现症状，鳞屑较大而且显著，分布全身，以四肢、躯干、颈部为最明显，并累及四肢屈侧和皱折部位。症状不随年龄增长而减轻或加重。对其中5例患者的母亲也同时进行了检测。另选择2例寻常型鱼鳞病患者作为对照。
图1 家系7的系谱图，先证者还患有软骨发育不全性侏儒症和智力低下
二、研究方法
1、外周血DNA标本的制备：取受检者外周血约1ml，按微量法从淋巴细胞中提取高分子量基因组DNA[5]，供PCR扩增用。
, 百拇医药
2、寡聚核苷酸引物的合成：应用ABI380A型DNA合成仪(美国ABI公司)合成2对引物，其核苷酸序列见附表。
3 MPCR扩增及扩增产物的检测：受检个体基因组DNA0.5μg在5U的Taq聚合酶(美国Perkin Elmer Cetus公司)催化下，按下列条件进行PCR反应：93℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸2分钟，周期为30次，末次循环延伸在72℃维持10分钟。反应体积为50μl，反应体系中加入200μmol/L的四种脱氧核苷三磷酸和1μmol/L的每对引物。MPCR反应在美国Perkin Elmer Cetus公司的DNA热循环仪上进行。为排除假阴性结果，每个PCR反应体系中除STS基因2对引物外，还同时加入1对扩增DMD(Duchenne muscular dystrophy)基因的引物，其扩增片段大小为268bp，作为STS基因MPCR的阳性内对照。
扩增后的DNA产物取20μl在2%琼脂糖凝胶上按3.7V/cm电泳约1小时，EB染色后直接在紫外线检测仪下观察扩增结果。
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附表 STS-PCR寡聚核苷酸引物 寡聚核苷酸引物
扩增区域
扩增大小
5'STS基因
F-5'GGCCTAGAAGAAGGTTGAAGGTCCC
292bp
R-5'AAGAGGTTGGATGAGATGGGCATAC
3'STS基因
F-5'GAAATCCTCAAAGTCATGCAGGAAG
363bp
, 百拇医药 R-5'CCTCCAGTTGAGTAGCTGTTGAGCT
结 果
基因MPCR扩增结果见图2。5例患者的母亲及2例寻常型鱼鳞病患者的DNA标本经扩增后在紫外线检测仪下可见位于STS基因5'端和3'端的两种扩增片段，大小分别是292bp和363bp。7例患者中有5例(例2，3，4，5，7)未见STS基因的2条扩增带，表明其余长的STS基因发生丢失，其他2例(例1，6)可见完整的2条扩增带，提示可能为非缺失型或部分缺失型。图2中例2除阳性内对照扩增带之外，隐约可见292bp的扩增带，同时例3未见阳性内对照扩增带。为明确实验结果，对上述两标本再次扩增，阳性内对照改为DMD基因的另1对引物，大小为547bp，扩增结果表明例2、3均为STS基因全长丢失(图3)。
注：1～7示7例遗传性鱼鳞病患者，2'、4'、5'、6'、7'分别示例2、4、5、6、7的母亲，a、b示2例寻常型鱼鳞病患者 MW示分子量标准 ψX174/HaeIII
, 百拇医药
图2 14例受检者STS基因MPCR扩增结果
注：1～5分别对应于图2的3、2'、2、4'、4
图3 例2、3标本再次MPCR扩增结果
讨 论
MPCR技术是一种快速、灵敏的检测手段。该方法所需的模板DNA不超过500ng，从开始PCR反应到报告结果仅用5小时，扩增结果经电泳、染色后在紫外线检测仪下可直接观察，因此，特别适用于突变方式为基因缺失的遗传病的快速基因诊断[6]。我们合成了位于STS基因5'和3'端的2对引物用于MPCR扩增。由于STS基因在大部分遗传性鱼鳞病患者体内表现为全长基因丢失[3，4]，所以扩增上述两个特异性区域可达到检测出大部分STS基 因缺失型患者的目的。本研究结果表明，约71.4%(5/7)患者表现为STS基因全长丢失，这和国外学者的报道相吻合[7]。已知STS基因长达140kb，因此，随着检测样本数的增加还有可能检出基因部分缺失型病例。而对于可能发生在基因中部的部分缺失，仅扩增上述两个区域难以检出。本组有2例未见基因缺失，其突变性质有待于深入探究。
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2例寻常型鱼鳞病患者的DNA标本经MPCR扩增后，未见扩增片段的丢失，提示MPCR可望成为临床上鉴别寻常型和遗传性鱼鳞病的有效手段。目前，对遗传性鱼鳞病缺乏有效的治疗手段，对于症状、体征严重的患病家系，可利用MPCR技术进行产前基因诊断，防止患儿的出生。
最近，国外报道在少数遗传性鱼鳞病患者体内，STS基因的全长丢失可能累及该基因邻近的其它位点，从而导致“邻接基因综合征”(contiguous gene syndrome)[8]。因此，扩大STS基因MPCR扩增范围可筛选和检测出邻接基因综合征患者体内包括STS基因在内的多个相邻基因的缺失。本组例7除遗传性鱼鳞病外，还患有软骨发育不全性侏儒及智力低下，利用上述扩大的MPCR可望确定包括多个邻近基因在内的缺失范围。
第二军医大学附属长海医院皮肤科郑茂荣教授及中国医学科学院皮肤病学研究所夏隆庆教授提供部分病例并给予指教，特此致谢
, http://www.100md.com
参考文献
1 Shapiro LJ. Steroid sulfatase deficiency and X-linked ichthyosis. In:Scriver CR, et al, eds. The metabolic basis of inherited disease. 6th ed. New York: McGraw-Hill. 1989:1945-1964.
2 Yen PH, et al. The human X-linked steroid sulfatase gene and a Y-encoded pseudogene: evidence for and inversion of the Y chromosome during primate evolution, Cell 1989;55:1123.
3 Ballabio A, et al. Isolation and characterization of a steroid sulfataes cDNA clone: genomic deletions in patients with X-linked ichthyosis. Proc Natl Acad Sci 1987;84:4519.
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4 Ballabio A, et al. Molecular heterogeneity of steroid sulfatase deficiency: a multicenter study on 57 unrelated patients, at DNA and protein levels. Genomics 1989;4:36.
5 沈岩等，利用TLS提取染色体DNA，生物化学和生物物理进展 1989；16：221。
6 Chamberlain JS, et al. Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus by multiplex DNA amplification. Nucleic Acids Res 1988;16:11141.
7 Ballabio A, et al. Screening for steroid sulfatase(STS)gene deletions by multiplex DNA amplification. Hum Genet 1990;84:571.
8 Ballbio A, et al. Contiguous gene syndromes due to deletions in the distal short arm of the human X chromosome. Proc Natl Acad Sci 1989;86:10001., 百拇医药