可提取核抗原多肽抗体谱的测定方法及临床意义*
作者：许以华 顾越英 叶萍 陈顺乐
单位：上海第二医科大学附属仁济医院，上海市免疫学研究所临床免疫研究室
关键词：免疫印迹法；肽类；抗体持异性；红斑狼疮，全身性
中华医学杂志920910.htm 摘要 应用免疫印迹技术(IBT)，以兔胸腺可提取核抗原(ENA)为抗原，建立在一条硝酸纤维薄膜上检测包括抗Sm、抗RNP、抗SSA、抗SSB、抗Scl-70、抗Jo-1及抗核糖体等7种自身抗体的方法。与对流免疫电泳(CIE)相比，可提高系统性红斑狼疮(SLE)的Sm抗体的检测率(P<0.01)，且抗核糖体多肽抗体的检测对SLE的诊断又有高度特异性(P<0.01)，因此有助于提高SLE的诊断水平。在风湿性疾病中IBT可提高SSB抗体检测的敏感性(P<0.05)，但SSA抗体检测的敏感性不及CIE(P<0.01)。IBT检测的Scl-70及Jo-1多肽抗体分别对PSS与PM/DM的诊断有高度特异性(P<0.01)。
, http://www.100md.com
已知自身抗核抗体(ANA)对不同风湿性疾病的诊断与鉴别诊断有重要意义，其中抗Sm，细胞核核糖核蛋白抗体(抗RNP)，干燥综合征相关抗体甲(抗SSA)，干燥综合征相关抗体乙(抗SSB)，抗原分子量为70kD的硬皮病相关抗体(抗Scl-70)，抗Jo-1及抗核糖体等抗体的检测有助于系统性红斑狼疮(SLE)、混合性结缔组织病(MCTD)、干燥综合征(SS)、系统性硬皮病(PSS)及多发性肌炎或皮肌炎(PM/DM)等的诊断与鉴别诊断[1]。为了在对ANA的筛选中能一次同时检测并鉴别上述7种自身抗体，进一步提高ANA检测的敏感性与特异性，我们应用免疫印迹技术(IBT)，以兔胸腺的盐水可提取核抗原(ENA)为抗原，对ENA中不同蛋白多肽的相应抗体谱作检测敏感性与临床意义的研究。
材料与方法
1.对流免疫电泳(CIE)检测ENA抗体：按Kurata等[2]方法。抗原从小牛胸腺丙酮粉中抽提。
, 百拇医药
2.IBT检测ENA多肽抗体谱：按许以华等[3]的改良法。抗原从兔胸腺丙酮粉(美国Sigma公司提供)中抽提[4]，经12.5%SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳分离，再转移印迹至硝酸纤维薄膜(美国BIO-RAD公司产品)上后，用酶联免疫法检测各蛋白多肽的相应抗体。受检血清及辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG抗体(亲和层析提纯，克分子比值1.5)分别用含10%兔血清的洗涤液1:100和1:100稀释，洗涤液改为pH9.18含0.3%Tween-20的0.425mol/L Tris-HCl缓冲液。
3.受检对象：各种风湿性疾病患者358例，均由本院风湿病临床研究中心按国际诊断标准确诊，其中包括SLE124例，MCTD47例，SS34例，PSS54例，PM/DM30例及类风湿关节炎(RA)69例。本院健康职工36名为正常对照组。血清除SLE组外均随机收集，-70℃冻存。为了比较CIE与IBT在抗Sm抗体检测上的敏感性，在病史资料完整的554例SLE患者中随机收集CIE检测抗Sm和(或)抗RNP阳性的病例84例(A组)，抗SSB和(或)抗SSA阳性30例(B组)，及ENA抗体阴性的10例(C组)。
, 百拇医药
4.阳性参考血清：用于ENA多肽抗体谱识别的7种阳性参考血清由美国Scripps基金会自身免疫疾病中心 E M Tan教授提供。
结 果
1.ENA多肽抗体谱的识别：7种阳性参考血清能分别识别兔胸腺ENA中不同分子量的蛋白多肽。其中Sm抗体能识别标记为B'/B(29/28kD)和D(13.5kD)的蛋白多肽[5]，RNP抗体能识别73kD、B'/B和C(17.5kD)蛋白多肽，SSA抗体能识别52kD蛋白多肽，SSB抗体能识别48/47、45kD蛋白多肽，Scl-70抗体能识别86、70kD蛋白多肽，Jo-1抗体能识别55kD蛋白多肽，核糖体抗体能识别38、16.5及15kD蛋白多肽。因此用IBT检测兔胸腺ENA中不同蛋白多肽的相应抗体，可用于筛选并鉴定上述7种自身抗体。
2.ENA多肽抗体谱检测的临床意义：从附表可见，用IBT检测的抗Sm、抗Scl-70及抗Jo-1等抗体分别仅见于SLE，PSS和PM/DM疾病，抗核糖体主要见于SLE，在234例其他风湿病患者中只有2例(0.9%)抗核糖体阳性，因此上述4种自身抗体的检测对有关风湿性疾病的鉴别诊断有高度特异性(P<0.01)。与CIE相比，用IBT可提高SLE组中Sm抗体的检测率(X2检验，P<0.01)，因此有助于提高对SLE的诊断水平；此外还可提高风湿性疾病中的SSB抗体的检测率(P<0.05)，但在SSA抗体检测的敏感性上却显著低于CIE(P<0.01)。
, 百拇医药
讨 论
IBT能识别抗原的不同表位，能从分子水平识别各种抗体所作用的抗原在蛋白多肽分子量上的差别，因此已成为近年来鉴定各种抗体的一种非常可靠的方法。在风湿性疾病中，文献[6]报道应用IBT在一条印迹抗原蛋白多肽的硝酸纤维薄膜(NC)上可鉴别多至6种不同的自身抗体，且有较高的检测敏感性[7]。我们在已往的工作基础上[3]，通过对兔胸腺ENA抽提方法的改良[4]，将ENA多肽谱的识别增加至7种抗体。本组抗Sm和抗RNP阳性血清识别的蛋白多肽以Lerner等[5]标记的A-G代号表示，其中B'/B(29/28kD)多肽除能被Sm抗体识别外，还能被RNP抗体识别，这与Petersson等[8]观察到的结果一致。究竟B'/B蛋白多肽是否既存在Sm又存在RNP的抗原决定簇，有待进一步实验证实。在Sm抗体检测的敏感性比较中，本组用IBT检测的Sm抗体阳性的血清全都能既与B'/B又与D(13.5kD)多肽反应。由于Sm多肽抗体的检测可提高SLE组中Sm抗体的阳性检测率(P<0.01)，而核糖体多肽抗体的检测又对SLE的诊断有高订特异性(P<0.01)，因此ENA多肽抗体谱的检测有助于提高SLE的诊断水平。此外，仅用1条NC即可检测并鉴定7种自身抗体，且其中多种抗体对不同疾病的诊断又有高度特异性，因此ENA多肽抗体谱的检测还可提高筛选ANA的功效，有助于不同风湿性疾病的诊断与鉴别诊断。
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在ENA抗体检测的方法学比较中，与目前传统的CIE和双向免疫扩散相比，IBT具有以下优点：(1)微量化，检测7种自身抗体仅需10μl血清。(2)快速，若用ENA多肽印迹薄膜试剂盒检测，仅需3小时。(3)筛选多种抗体功效高。(4)易推广，不受阳性参考血清供应不足的限制，同样20μl量的阳性参考血清用于IBT可鉴定80-100份血清标本。IBT主要缺点在于不能作抗体效价测定，仅作定性检测，此外在SSA抗体检测的敏感性上显著低于CIE(P<0.01)，这可能与本组用兔胸腺ENA为抗原相关。
参 考 文 献
1.Tan EM, et al. Antinuclear. antibodies (ANAs): diagostically specific immune markers and cluestoward the understanding of systemic autoimmunity. Clin Immunol Immunopathol 1988; 47 : 121.
, http://www.100md.com
2.Kurata N, Tan EM. Identification of antibodies to nuclear acidic antigens by counterimmunoelectro phoresis. Arthritis Rheum 1976; 19 : 574.
3.许以华等.免疫印迹技术检测Sm,RNP及SSB多肽抗体的临床意义.中华内科杂志.1990;29: 472.
4.许以华等.应用免疫印迹技术检测抗Scl-70和抗Jo-1抗体.上海免疫学杂志.1990;10:292.
5.Lerner MR, et al. Antibodies to small nuclear RNAs complexed with proteins are produced by patients with systemic lupus erythematosus. Proc Natl Acad Sci USA 1979; 76 : 5495.
, 百拇医药
6.de Rooij DJ, et al. The use of immunoblotting to detect antibodies to nuclear and cytoplasmic antigens. Clinical and serological association in rheumatic diseases. Scand J Rheumatol 1988; 17 : 353.
7.Meyer O, et al. Immunoblotting profiles in 55 systemic lupus erythematosus sera lacking precipitating antibodies to extractable nuclear antigens. Ann Rheum Dis 1989; 48 : 594.
8.pettersson I, et al. The structure of mammalian small nuclear ribonucleoproteins. Identification of multipul protein componeots reactive with anti(U1) ribonucleoprotein and anti-Sm autoantibodies. J Biol Chem 1984; 295 : 5907.
(1991年9月12日收稿 1992年6月3日修回), http://www.100md.com
单位：上海第二医科大学附属仁济医院，上海市免疫学研究所临床免疫研究室
关键词：免疫印迹法；肽类；抗体持异性；红斑狼疮，全身性
中华医学杂志920910.htm 摘要 应用免疫印迹技术(IBT)，以兔胸腺可提取核抗原(ENA)为抗原，建立在一条硝酸纤维薄膜上检测包括抗Sm、抗RNP、抗SSA、抗SSB、抗Scl-70、抗Jo-1及抗核糖体等7种自身抗体的方法。与对流免疫电泳(CIE)相比，可提高系统性红斑狼疮(SLE)的Sm抗体的检测率(P<0.01)，且抗核糖体多肽抗体的检测对SLE的诊断又有高度特异性(P<0.01)，因此有助于提高SLE的诊断水平。在风湿性疾病中IBT可提高SSB抗体检测的敏感性(P<0.05)，但SSA抗体检测的敏感性不及CIE(P<0.01)。IBT检测的Scl-70及Jo-1多肽抗体分别对PSS与PM/DM的诊断有高度特异性(P<0.01)。
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已知自身抗核抗体(ANA)对不同风湿性疾病的诊断与鉴别诊断有重要意义，其中抗Sm，细胞核核糖核蛋白抗体(抗RNP)，干燥综合征相关抗体甲(抗SSA)，干燥综合征相关抗体乙(抗SSB)，抗原分子量为70kD的硬皮病相关抗体(抗Scl-70)，抗Jo-1及抗核糖体等抗体的检测有助于系统性红斑狼疮(SLE)、混合性结缔组织病(MCTD)、干燥综合征(SS)、系统性硬皮病(PSS)及多发性肌炎或皮肌炎(PM/DM)等的诊断与鉴别诊断[1]。为了在对ANA的筛选中能一次同时检测并鉴别上述7种自身抗体，进一步提高ANA检测的敏感性与特异性，我们应用免疫印迹技术(IBT)，以兔胸腺的盐水可提取核抗原(ENA)为抗原，对ENA中不同蛋白多肽的相应抗体谱作检测敏感性与临床意义的研究。
材料与方法
1.对流免疫电泳(CIE)检测ENA抗体：按Kurata等[2]方法。抗原从小牛胸腺丙酮粉中抽提。
, 百拇医药
2.IBT检测ENA多肽抗体谱：按许以华等[3]的改良法。抗原从兔胸腺丙酮粉(美国Sigma公司提供)中抽提[4]，经12.5%SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳分离，再转移印迹至硝酸纤维薄膜(美国BIO-RAD公司产品)上后，用酶联免疫法检测各蛋白多肽的相应抗体。受检血清及辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG抗体(亲和层析提纯，克分子比值1.5)分别用含10%兔血清的洗涤液1:100和1:100稀释，洗涤液改为pH9.18含0.3%Tween-20的0.425mol/L Tris-HCl缓冲液。
3.受检对象：各种风湿性疾病患者358例，均由本院风湿病临床研究中心按国际诊断标准确诊，其中包括SLE124例，MCTD47例，SS34例，PSS54例，PM/DM30例及类风湿关节炎(RA)69例。本院健康职工36名为正常对照组。血清除SLE组外均随机收集，-70℃冻存。为了比较CIE与IBT在抗Sm抗体检测上的敏感性，在病史资料完整的554例SLE患者中随机收集CIE检测抗Sm和(或)抗RNP阳性的病例84例(A组)，抗SSB和(或)抗SSA阳性30例(B组)，及ENA抗体阴性的10例(C组)。
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4.阳性参考血清：用于ENA多肽抗体谱识别的7种阳性参考血清由美国Scripps基金会自身免疫疾病中心 E M Tan教授提供。
结 果
1.ENA多肽抗体谱的识别：7种阳性参考血清能分别识别兔胸腺ENA中不同分子量的蛋白多肽。其中Sm抗体能识别标记为B'/B(29/28kD)和D(13.5kD)的蛋白多肽[5]，RNP抗体能识别73kD、B'/B和C(17.5kD)蛋白多肽，SSA抗体能识别52kD蛋白多肽，SSB抗体能识别48/47、45kD蛋白多肽，Scl-70抗体能识别86、70kD蛋白多肽，Jo-1抗体能识别55kD蛋白多肽，核糖体抗体能识别38、16.5及15kD蛋白多肽。因此用IBT检测兔胸腺ENA中不同蛋白多肽的相应抗体，可用于筛选并鉴定上述7种自身抗体。
2.ENA多肽抗体谱检测的临床意义：从附表可见，用IBT检测的抗Sm、抗Scl-70及抗Jo-1等抗体分别仅见于SLE，PSS和PM/DM疾病，抗核糖体主要见于SLE，在234例其他风湿病患者中只有2例(0.9%)抗核糖体阳性，因此上述4种自身抗体的检测对有关风湿性疾病的鉴别诊断有高度特异性(P<0.01)。与CIE相比，用IBT可提高SLE组中Sm抗体的检测率(X2检验，P<0.01)，因此有助于提高对SLE的诊断水平；此外还可提高风湿性疾病中的SSB抗体的检测率(P<0.05)，但在SSA抗体检测的敏感性上却显著低于CIE(P<0.01)。
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讨 论
IBT能识别抗原的不同表位，能从分子水平识别各种抗体所作用的抗原在蛋白多肽分子量上的差别，因此已成为近年来鉴定各种抗体的一种非常可靠的方法。在风湿性疾病中，文献[6]报道应用IBT在一条印迹抗原蛋白多肽的硝酸纤维薄膜(NC)上可鉴别多至6种不同的自身抗体，且有较高的检测敏感性[7]。我们在已往的工作基础上[3]，通过对兔胸腺ENA抽提方法的改良[4]，将ENA多肽谱的识别增加至7种抗体。本组抗Sm和抗RNP阳性血清识别的蛋白多肽以Lerner等[5]标记的A-G代号表示，其中B'/B(29/28kD)多肽除能被Sm抗体识别外，还能被RNP抗体识别，这与Petersson等[8]观察到的结果一致。究竟B'/B蛋白多肽是否既存在Sm又存在RNP的抗原决定簇，有待进一步实验证实。在Sm抗体检测的敏感性比较中，本组用IBT检测的Sm抗体阳性的血清全都能既与B'/B又与D(13.5kD)多肽反应。由于Sm多肽抗体的检测可提高SLE组中Sm抗体的阳性检测率(P<0.01)，而核糖体多肽抗体的检测又对SLE的诊断有高订特异性(P<0.01)，因此ENA多肽抗体谱的检测有助于提高SLE的诊断水平。此外，仅用1条NC即可检测并鉴定7种自身抗体，且其中多种抗体对不同疾病的诊断又有高度特异性，因此ENA多肽抗体谱的检测还可提高筛选ANA的功效，有助于不同风湿性疾病的诊断与鉴别诊断。
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在ENA抗体检测的方法学比较中，与目前传统的CIE和双向免疫扩散相比，IBT具有以下优点：(1)微量化，检测7种自身抗体仅需10μl血清。(2)快速，若用ENA多肽印迹薄膜试剂盒检测，仅需3小时。(3)筛选多种抗体功效高。(4)易推广，不受阳性参考血清供应不足的限制，同样20μl量的阳性参考血清用于IBT可鉴定80-100份血清标本。IBT主要缺点在于不能作抗体效价测定，仅作定性检测，此外在SSA抗体检测的敏感性上显著低于CIE(P<0.01)，这可能与本组用兔胸腺ENA为抗原相关。
参 考 文 献
1.Tan EM, et al. Antinuclear. antibodies (ANAs): diagostically specific immune markers and cluestoward the understanding of systemic autoimmunity. Clin Immunol Immunopathol 1988; 47 : 121.
, http://www.100md.com
2.Kurata N, Tan EM. Identification of antibodies to nuclear acidic antigens by counterimmunoelectro phoresis. Arthritis Rheum 1976; 19 : 574.
3.许以华等.免疫印迹技术检测Sm,RNP及SSB多肽抗体的临床意义.中华内科杂志.1990;29: 472.
4.许以华等.应用免疫印迹技术检测抗Scl-70和抗Jo-1抗体.上海免疫学杂志.1990;10:292.
5.Lerner MR, et al. Antibodies to small nuclear RNAs complexed with proteins are produced by patients with systemic lupus erythematosus. Proc Natl Acad Sci USA 1979; 76 : 5495.
, 百拇医药
6.de Rooij DJ, et al. The use of immunoblotting to detect antibodies to nuclear and cytoplasmic antigens. Clinical and serological association in rheumatic diseases. Scand J Rheumatol 1988; 17 : 353.
7.Meyer O, et al. Immunoblotting profiles in 55 systemic lupus erythematosus sera lacking precipitating antibodies to extractable nuclear antigens. Ann Rheum Dis 1989; 48 : 594.
8.pettersson I, et al. The structure of mammalian small nuclear ribonucleoproteins. Identification of multipul protein componeots reactive with anti(U1) ribonucleoprotein and anti-Sm autoantibodies. J Biol Chem 1984; 295 : 5907.
(1991年9月12日收稿 1992年6月3日修回), http://www.100md.com