淋巴因子激活的杀伤细胞在单克隆抗体介导下的抗胃癌实验研究
作者：毕 锋 张学庸 牟震先 吴觉平 樊代明 吴开春
单位：710032西安，第四军医大学西京医院消化病研究室
关键词：
淋巴因子激活的杀伤细胞 淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK细胞)在肿瘤过继性免疫治疗中虽已取得较好的效果，但也存在不少问题。因此，寻找提高LAK细胞疗效的方法是目前肿瘤生物治疗面临的一大课题。联合应用抗肿瘤单克隆抗体(简称单抗)和LAK细胞，使其产生抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)即是其中很有希望的方法之一。本文观察了单克隆抗体MGb2对LAK细胞抗胃癌作用的影响。
一、材料和方法
1.靶细胞：KATOⅢ系胃戒细胞癌细胞。
2.主要试剂：(1)白细胞介素(Ⅱ(IL-2)：美国Becton Dickinsen公司惠赠，为重IL-2。(2)鼠抗人胃癌单抗MGb2：由本室制备[1]。(3)3G1/3F8系抗流行性出血热病毒单抗，由本校流行病教研室提供，作为对照体。
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3.LAK细胞制备：分离健康献血者外周血单个核细胞(PBMC)，以2×106/ml的浓度加IL-2200U/ml诱导，收获第3～4天后的细胞作为效应细胞。
4.体外细胞毒作用的检测：采用4小时51Cr释放法，杀伤率由以下公式得出：
二、结果
1.不同效应细胞/靶细胞比例下LAK活性和ADCC效应比较：选6位健康献血者的静脉血分离制备的LAD细胞在四种效应细胞/靶细胞比例下进行杀伤试验。检测ADCC效应时加入单抗MGb2μg/ml。结果见附表。由险表可知在四种效应细胞/靶细胞比例下，单抗MGb2均能增加LAK细胞的杀伤作用，经配对t检验，二者差异有非常显著意义(P<0.01)，对照抗体3G1/3F8无此作用。
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2.单抗MGb2的浓度与ADCC效应的关系：分别用IL-2浓度为200U/ml。2000U/ml诱导3天后的两种LAK细胞及新鲜PBMC(实验当天取自不同献血者)在同一天均以20：1的效应细胞/靶细胞比例检测其ADCC效应，单抗MGb2的浓度从0.001μg/ml开始逐渐加大至100μg/ml。我们发现单抗MGb2介导的ADCC作用在抗体浓度为0.01μg/ml时即出现，至抗体浓度为2μg/ml时作用达到高峰，以后加大抗体浓度ADCC作用又开始下降，并且这种ADCC作用所需的抗体浓度不受IL-2浓度的影响。
3.IL-2浓度和ADCC效应的关系：将同一献血者的PBMC分为7份，分别用IL-2浓度为0、10、100、200、500、1000及2000U/ml诱导的LAK细胞检测其MGb2活性和加入单抗ADCC后的ADCC效应。结果显示了随着IL-2浓度的增加及LAK活性的增高，单抗MGb2引起的ADCC效应也相应增高，两者基本上呈平行关系。
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附表 不同效应细胞/靶细胞比例下LAK活性和ADCC作用比较
组别
效应细胞/靶细胞
10：1
20：1
40：1
80：1
LAK*
14.2±2.3
21.1±1.7
29.1±1.7
39.9±1.2
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LAK+MGb2*
24.9±3.4
34.9±2.7
42.2±2.2
53.6±1.5
LAK+3G1/3F8
14.1±2.3
19.5±1.9
28.1±2.1
38.0±1.8
注：1、* n=6 P<0.01 2、表中数值为对靶细胞KATO Ⅲ杀伤率(%)的均值±标准差
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三、讨论
1987年，Shiloni[2]发现LAK细胞在抗淋巴瘤单抗介导下，其对淋巴瘤细胞的杀伤作用可提高100倍(以溶解单位计算)，有人将这种加入了单抗的LAK细胞称为单抗“武装”LAK的细胞或单抗“导向”的LAK细胞，具有重要的临床意义。近些年来，人们相继制备出多种单抗，应用其中具有ADCC作用的单抗，有可能在肿瘤的继承性免疫治疗中发挥重要作用。在此，我们应用本室制备的单抗MGb2进行试验，发现它能显著提高LAK细胞的抗胃癌作用，就其杀伤率而言，可提高100%。这一结果进一步证明了应用抗肿瘤单抗介导的ADCC作用，能显著地增强LAK细胞的抗肿瘤作用。
单抗的浓度直接影响着这种ADCC效应。在理论上ADCC作用要求有过剩的抗体，但并非抗体浓度越高越好。我们的实验结果证实了这种ADCC作用有其最适抗体浓度(2μg/ml)，过高过低均影响其效应的发挥，这与Munn等[3]的结论基本相同，但亦有不同报道[4]。
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制备LAK细胞时IL-2的浓度，不仅影响着LAK活性，也影响ADCC效应。在我们所用的0～2000U/ml的IL-2浓度范围内，随着IL-2浓度和LAK活性的增高，ADCC作用亦随之上升，两者基本上呈平行关系，这一现象似乎提示IL-2是通过影响效应细胞的活性而影响ADCC效应的。制备高活性的LAK细胞是提高ADCC效应的基础，具有重要意义。
我们的研究结果表明，应用单抗MGb2能够显著增增强LAK细胞的抗胃癌作用，这样就为以后的临床应用提供了依据，从而有可能为胃癌的治疗提供一个新的方法。
参考文献
1 Shiloni E,Eisenthal A,Rosenberg SA,et al.Antibody-dependent cellular cytotoxicity mediated by murine lymphocytes activated in recom binant interleukin 2.J Immunol,1987,138:1992.
, 百拇医药
2 Munn DH,Cheung NKV,Interleukin-2 enhancment of monoclonal antibody mediated cellular cytotoxicity against human melanoma,Cancer Res,1987,47:6600.
3 樊代明，张学庸，陈希陶等，抗胃印戒细胞癌株KATOⅢ单克隆抗体MGb1和MGb2的建立及其免疫组化初步鉴定。中华消华杂志，1988，8：35。
4 Masucci G,Wersau P,Nielsen J,et al,Lymphokine activated killer (LAK)cells in antibody dependent cellular cytotoxicity(ADCC)using MAb 17-1A:a comtination of potential usefulness in tumor therapy Hybridoma,1989,8:507
(收稿：1992-01-27 修回：1992-10-10), http://www.100md.com
单位：710032西安，第四军医大学西京医院消化病研究室
关键词：
淋巴因子激活的杀伤细胞 淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK细胞)在肿瘤过继性免疫治疗中虽已取得较好的效果，但也存在不少问题。因此，寻找提高LAK细胞疗效的方法是目前肿瘤生物治疗面临的一大课题。联合应用抗肿瘤单克隆抗体(简称单抗)和LAK细胞，使其产生抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)即是其中很有希望的方法之一。本文观察了单克隆抗体MGb2对LAK细胞抗胃癌作用的影响。
一、材料和方法
1.靶细胞：KATOⅢ系胃戒细胞癌细胞。
2.主要试剂：(1)白细胞介素(Ⅱ(IL-2)：美国Becton Dickinsen公司惠赠，为重IL-2。(2)鼠抗人胃癌单抗MGb2：由本室制备[1]。(3)3G1/3F8系抗流行性出血热病毒单抗，由本校流行病教研室提供，作为对照体。
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3.LAK细胞制备：分离健康献血者外周血单个核细胞(PBMC)，以2×106/ml的浓度加IL-2200U/ml诱导，收获第3～4天后的细胞作为效应细胞。
4.体外细胞毒作用的检测：采用4小时51Cr释放法，杀伤率由以下公式得出：
二、结果
1.不同效应细胞/靶细胞比例下LAK活性和ADCC效应比较：选6位健康献血者的静脉血分离制备的LAD细胞在四种效应细胞/靶细胞比例下进行杀伤试验。检测ADCC效应时加入单抗MGb2μg/ml。结果见附表。由险表可知在四种效应细胞/靶细胞比例下，单抗MGb2均能增加LAK细胞的杀伤作用，经配对t检验，二者差异有非常显著意义(P<0.01)，对照抗体3G1/3F8无此作用。
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2.单抗MGb2的浓度与ADCC效应的关系：分别用IL-2浓度为200U/ml。2000U/ml诱导3天后的两种LAK细胞及新鲜PBMC(实验当天取自不同献血者)在同一天均以20：1的效应细胞/靶细胞比例检测其ADCC效应，单抗MGb2的浓度从0.001μg/ml开始逐渐加大至100μg/ml。我们发现单抗MGb2介导的ADCC作用在抗体浓度为0.01μg/ml时即出现，至抗体浓度为2μg/ml时作用达到高峰，以后加大抗体浓度ADCC作用又开始下降，并且这种ADCC作用所需的抗体浓度不受IL-2浓度的影响。
3.IL-2浓度和ADCC效应的关系：将同一献血者的PBMC分为7份，分别用IL-2浓度为0、10、100、200、500、1000及2000U/ml诱导的LAK细胞检测其MGb2活性和加入单抗ADCC后的ADCC效应。结果显示了随着IL-2浓度的增加及LAK活性的增高，单抗MGb2引起的ADCC效应也相应增高，两者基本上呈平行关系。
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附表 不同效应细胞/靶细胞比例下LAK活性和ADCC作用比较
组别
效应细胞/靶细胞
10：1
20：1
40：1
80：1
LAK*
14.2±2.3
21.1±1.7
29.1±1.7
39.9±1.2
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LAK+MGb2*
24.9±3.4
34.9±2.7
42.2±2.2
53.6±1.5
LAK+3G1/3F8
14.1±2.3
19.5±1.9
28.1±2.1
38.0±1.8
注：1、* n=6 P<0.01 2、表中数值为对靶细胞KATO Ⅲ杀伤率(%)的均值±标准差
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三、讨论
1987年，Shiloni[2]发现LAK细胞在抗淋巴瘤单抗介导下，其对淋巴瘤细胞的杀伤作用可提高100倍(以溶解单位计算)，有人将这种加入了单抗的LAK细胞称为单抗“武装”LAK的细胞或单抗“导向”的LAK细胞，具有重要的临床意义。近些年来，人们相继制备出多种单抗，应用其中具有ADCC作用的单抗，有可能在肿瘤的继承性免疫治疗中发挥重要作用。在此，我们应用本室制备的单抗MGb2进行试验，发现它能显著提高LAK细胞的抗胃癌作用，就其杀伤率而言，可提高100%。这一结果进一步证明了应用抗肿瘤单抗介导的ADCC作用，能显著地增强LAK细胞的抗肿瘤作用。
单抗的浓度直接影响着这种ADCC效应。在理论上ADCC作用要求有过剩的抗体，但并非抗体浓度越高越好。我们的实验结果证实了这种ADCC作用有其最适抗体浓度(2μg/ml)，过高过低均影响其效应的发挥，这与Munn等[3]的结论基本相同，但亦有不同报道[4]。
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制备LAK细胞时IL-2的浓度，不仅影响着LAK活性，也影响ADCC效应。在我们所用的0～2000U/ml的IL-2浓度范围内，随着IL-2浓度和LAK活性的增高，ADCC作用亦随之上升，两者基本上呈平行关系，这一现象似乎提示IL-2是通过影响效应细胞的活性而影响ADCC效应的。制备高活性的LAK细胞是提高ADCC效应的基础，具有重要意义。
我们的研究结果表明，应用单抗MGb2能够显著增增强LAK细胞的抗胃癌作用，这样就为以后的临床应用提供了依据，从而有可能为胃癌的治疗提供一个新的方法。
参考文献
1 Shiloni E,Eisenthal A,Rosenberg SA,et al.Antibody-dependent cellular cytotoxicity mediated by murine lymphocytes activated in recom binant interleukin 2.J Immunol,1987,138:1992.
, 百拇医药
2 Munn DH,Cheung NKV,Interleukin-2 enhancment of monoclonal antibody mediated cellular cytotoxicity against human melanoma,Cancer Res,1987,47:6600.
3 樊代明，张学庸，陈希陶等，抗胃印戒细胞癌株KATOⅢ单克隆抗体MGb1和MGb2的建立及其免疫组化初步鉴定。中华消华杂志，1988，8：35。
4 Masucci G,Wersau P,Nielsen J,et al,Lymphokine activated killer (LAK)cells in antibody dependent cellular cytotoxicity(ADCC)using MAb 17-1A:a comtination of potential usefulness in tumor therapy Hybridoma,1989,8:507
(收稿：1992-01-27 修回：1992-10-10), http://www.100md.com