弓形虫畸胎中分离株的DNA杂交试验及虫株鉴定
作者：杨惠珍 徐克继 姜昌斌 杨鹤萍 钱宗立 夏爱娣 王克敏 陈诗书
单位：200025上海第二医科大学寄生虫学教研室(杨惠珍、徐克继、姜昌斌、杨鹤萍及钱宗立)，生物化学教研室及分子生物学实验室(夏爱娣、王克敏、陈诗书)
关键词：弓形体属；DNA探针；杂交
摘要 对1986年至1989年自畸形死胎中分离到的7株弓形虫速殖子DNA 摘要 对1986年至1989年自畸形死胎中分离到的7株弓形虫速殖子DNA，采用特异DNA克隆片段为探针进行Southern杂交，获得与国际标准RH株DNA相同位点的杂交带，为虫种鉴定提供可靠的科学依据。
近年来，国内外从人体或动物中也分离到不少弓形虫虫株，均为刚地弓形虫(Toxop-lasma gondii)。它们在形态学、生物学特性方面难以区分，毒力上有强毒、弱毒之分，而在分子生物学方面的研究甚少。我们1986～1989年从上海瑞金医院妇产科部分畸形胎儿中分离到的虫株〔1〕，采用特异弓形虫DNA克隆片段为探针，用Southern印迹技术进行杂交试验，对其虫源特性进行分析。
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材料与方法
1.弓形虫虫株：本实验室分离株：SH株(Shanghai Human)：SH1、SH2、SH3、SH4、SH5、SH6、SH8(其中SH7液氮保存不妥丢失)；国际标准株：RH(1986年自天津医学院寄生虫学教研室引入保种)；人源株：ZS2(1982年由广州中山医科大学寄生虫学教研室引入保种)；猪源株：CN(长宁区猪体分离，1980年由上海农科院兽医所转种)。
2.虫体复苏、扩种与纯化：分离获得的弓形虫速殖子分别以液氮保种，经复苏小白鼠传代、扩种，收集小鼠腹腔液，离心沉淀，经纤维素粉(fibrous cellulose powder CF-11)过柱〔2〕，获得纯化无损伤无宿主有核细胞的弓形虫速殖子1×108/ml，纯度为95～99%。
3弓形虫速殖子DNA抽提与制备〔3〕：取上述新鲜弓形虫速殖子沉淀物加含SDS、蛋白酶K的裂解液破虫体细胞膜，用氯仿-异戊醇提取DNA，并测定其DNA含量，分别贮存于4℃冰箱备用。
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4弓形虫DNA酶切与电泳分离：采用限制性内切酶BamHI对各弓形虫(5μg/只)DNA进行酶解(37℃温育过夜)，以1%琼脂糖凝胶进行预电泳。经溴乙锭染色紫外光照观察光带，酶解完全后，进行琼脂糖凝胶电泳分离。
5.Southem印迹转移：按Southern法〔4〕将凝胶转印至硝酸橇维薄膜(德国S&S公司BA85型)，于冷室转印过夜，取膜片经漂洗烘干，保存于真空干燥器内。
6.特异NDA探针的同位素标记：取原协作组自行制备的特异弓形虫DNA克隆片段(1.1kb)〔5〕，采用Amersham公司Nick Translation药盒(缺口平移法)进行32P标记。
7.分子杂交试验〔6〕：杂交反应前先将转印的硝酸纤维滤膜进行预杂交，以减少非特异反应。按每平方厘米滤膜200μl体积配成的预杂交液与滤膜片在塑料袋内置42℃水浴震荡24小时，之后去除预杂交液，加入100μl/cm2杂交液加入经变性的标记DNA探针(1×106min-1/ml)42℃水浴震荡48小时进行杂交反应。
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8.放射自显影：将杂交后的滤膜经低盐溶液中(SSPE)漂洗、吸干，经同位素检测仪初测放射强度后，与X线片夹入增感屏暗盒内(暗室进行)，置-70℃冰箱，分别在第3天、第5天取出X线片冲洗，观察DNA显影图。
结果与讨论
标记探针对不同分离株DNA的测定：用32P同位素标记弓形虫克隆片段为探针，经Southern印迹分析、杂交反应、放射自显影结果显示，该探针能与RH株(人源)、CN株(猪源)和ZS2株(人源)杂交，与畸形儿分离株SH1、SH2、SH3、SH4、SH5、SH6、SH8，除CN株杂交带不够显明外，其余均在相等的位置上(2.0kb)见有明显的杂交带。
本文研究采用的7株人源弓形虫速殖子，为本室自1986～1989年从在产前检查(B超)揭示胎儿发育畸形、弓形虫抗体测定阳性的孕妇及其所分娩的畸形儿组织分离虫源所获得，均经光镜测得虫体大小及形态特征，部分病例用透射电镜观察其细胞超微结构、用小白鼠接种观察虫体对动物的敏感性和毒力(各种虫株都具强毒)，基本上符合弓形虫物生学特征〔7〕，而从分子生物学方面尚未深入研究。本实验采用DNA分子杂交技术，对分离的7株虫株(其中1株因液氮保存不妥而丢失)进行检测。
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本实验所用的探针为原课题协作组制备的弓形虫特异DNA克隆片段，该探针具有较高的特异性，对正常人、正常动物(猪、鼠)及同类寄生原虫(孢子虫纲)的肺孢子虫、恶性虐原虫的DNA不杂交，而对人工感染的动物或已证明弓形虫感染的病人及畸形儿的组织能杂交〔3〕。该探针与不同动物源分离虫株的DNA(如ZS2、CN株)也能起特异的杂交反应，而CN株(猪源)DNA序列不尽相同；对各畸形儿分离虫体亦在同一位点上起反应。实验表明上述弓形虫速殖子DNA与探针具有同源性，从而进一步证实所分离的各虫株为孢子虫纲的弓形虫速殖子。至于各虫株在基因位点上是否有差异，尚须采用弓形虫不同克隆片段的探针进行位点测定及进一步研究和探讨。
在探讨DNA分子的生物学特性方面，在其他寄生原虫中见有研究报道〔8〕，而关于弓形虫核酸分子方面的研究，国内外研究不多，仅有少数学者利用DNA探针进行弓形虫病诊断〔3〕。至于弓形虫研究领域中对虫株特征的测定，尚未见有类似的报道。根据生物学对病原体虫株(种)的鉴定要求，除了对其形态特征、大小结构及毒力等考核外，还需采用DNA分子杂交进一步证实其虫株的特异性，本实验的结果可为鉴定虫株提供可靠的科学依据，为从事弓形虫研究的工作者开辟新的研究途径。
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本实验有关DNA杂交试剂由分子生物学实验室张来仪配制，特此致谢
本课题为国家自然科学基金资助项目
参考文献
1 杨惠珍，徐克继，钱宗立，等。自畸形胎儿证示弓形虫感染的探讨。中华医学杂志，1989，11：655.
2 杨惠珍，徐克继。一种分离弓形虫速殖子的快速方法。全国第二次寄生虫学术讨论会论文汇编，1987，4：157.
3 夏爱娣，顾允中，杨惠珍，等。弓形虫基因组文库的建立、特异克隆的筛选和弓形虫病的DNA诊断。中国寄生虫学与寄生虫杂志，1990，8：165.
4 Southern EM.Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis.J Mol Biol,1975,98:503.
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5 夏爱娣，杨惠珍，顾允中，等。特异弓形虫DNA顺序的克隆及用于弓形虫病的检测。上海医学，1989，12：531.
6 Maniatis T,Fritsch EF,Sambrook J.Analysis of Recombinant DNA Clones.Molecular Cloning,1982;365.
7 杨惠珍，徐克继，费 冲等。先天性畸形儿弓形虫感染4例及虫株的分离。上海医学，1988，11：268.
8 Bracha R,et al.Differentiation of clinical isolates of Entamoeba histolytica by using specific DNA probes.J Clin Microbiology Apr,1990,28:680.
(收稿：1992-05-18 修回：1992-12-15), http://www.100md.com
单位：200025上海第二医科大学寄生虫学教研室(杨惠珍、徐克继、姜昌斌、杨鹤萍及钱宗立)，生物化学教研室及分子生物学实验室(夏爱娣、王克敏、陈诗书)
关键词：弓形体属；DNA探针；杂交
摘要 对1986年至1989年自畸形死胎中分离到的7株弓形虫速殖子DNA 摘要 对1986年至1989年自畸形死胎中分离到的7株弓形虫速殖子DNA，采用特异DNA克隆片段为探针进行Southern杂交，获得与国际标准RH株DNA相同位点的杂交带，为虫种鉴定提供可靠的科学依据。
近年来，国内外从人体或动物中也分离到不少弓形虫虫株，均为刚地弓形虫(Toxop-lasma gondii)。它们在形态学、生物学特性方面难以区分，毒力上有强毒、弱毒之分，而在分子生物学方面的研究甚少。我们1986～1989年从上海瑞金医院妇产科部分畸形胎儿中分离到的虫株〔1〕，采用特异弓形虫DNA克隆片段为探针，用Southern印迹技术进行杂交试验，对其虫源特性进行分析。
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材料与方法
1.弓形虫虫株：本实验室分离株：SH株(Shanghai Human)：SH1、SH2、SH3、SH4、SH5、SH6、SH8(其中SH7液氮保存不妥丢失)；国际标准株：RH(1986年自天津医学院寄生虫学教研室引入保种)；人源株：ZS2(1982年由广州中山医科大学寄生虫学教研室引入保种)；猪源株：CN(长宁区猪体分离，1980年由上海农科院兽医所转种)。
2.虫体复苏、扩种与纯化：分离获得的弓形虫速殖子分别以液氮保种，经复苏小白鼠传代、扩种，收集小鼠腹腔液，离心沉淀，经纤维素粉(fibrous cellulose powder CF-11)过柱〔2〕，获得纯化无损伤无宿主有核细胞的弓形虫速殖子1×108/ml，纯度为95～99%。
3弓形虫速殖子DNA抽提与制备〔3〕：取上述新鲜弓形虫速殖子沉淀物加含SDS、蛋白酶K的裂解液破虫体细胞膜，用氯仿-异戊醇提取DNA，并测定其DNA含量，分别贮存于4℃冰箱备用。
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4弓形虫DNA酶切与电泳分离：采用限制性内切酶BamHI对各弓形虫(5μg/只)DNA进行酶解(37℃温育过夜)，以1%琼脂糖凝胶进行预电泳。经溴乙锭染色紫外光照观察光带，酶解完全后，进行琼脂糖凝胶电泳分离。
5.Southem印迹转移：按Southern法〔4〕将凝胶转印至硝酸橇维薄膜(德国S&S公司BA85型)，于冷室转印过夜，取膜片经漂洗烘干，保存于真空干燥器内。
6.特异NDA探针的同位素标记：取原协作组自行制备的特异弓形虫DNA克隆片段(1.1kb)〔5〕，采用Amersham公司Nick Translation药盒(缺口平移法)进行32P标记。
7.分子杂交试验〔6〕：杂交反应前先将转印的硝酸纤维滤膜进行预杂交，以减少非特异反应。按每平方厘米滤膜200μl体积配成的预杂交液与滤膜片在塑料袋内置42℃水浴震荡24小时，之后去除预杂交液，加入100μl/cm2杂交液加入经变性的标记DNA探针(1×106min-1/ml)42℃水浴震荡48小时进行杂交反应。
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8.放射自显影：将杂交后的滤膜经低盐溶液中(SSPE)漂洗、吸干，经同位素检测仪初测放射强度后，与X线片夹入增感屏暗盒内(暗室进行)，置-70℃冰箱，分别在第3天、第5天取出X线片冲洗，观察DNA显影图。
结果与讨论
标记探针对不同分离株DNA的测定：用32P同位素标记弓形虫克隆片段为探针，经Southern印迹分析、杂交反应、放射自显影结果显示，该探针能与RH株(人源)、CN株(猪源)和ZS2株(人源)杂交，与畸形儿分离株SH1、SH2、SH3、SH4、SH5、SH6、SH8，除CN株杂交带不够显明外，其余均在相等的位置上(2.0kb)见有明显的杂交带。
本文研究采用的7株人源弓形虫速殖子，为本室自1986～1989年从在产前检查(B超)揭示胎儿发育畸形、弓形虫抗体测定阳性的孕妇及其所分娩的畸形儿组织分离虫源所获得，均经光镜测得虫体大小及形态特征，部分病例用透射电镜观察其细胞超微结构、用小白鼠接种观察虫体对动物的敏感性和毒力(各种虫株都具强毒)，基本上符合弓形虫物生学特征〔7〕，而从分子生物学方面尚未深入研究。本实验采用DNA分子杂交技术，对分离的7株虫株(其中1株因液氮保存不妥而丢失)进行检测。
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本实验所用的探针为原课题协作组制备的弓形虫特异DNA克隆片段，该探针具有较高的特异性，对正常人、正常动物(猪、鼠)及同类寄生原虫(孢子虫纲)的肺孢子虫、恶性虐原虫的DNA不杂交，而对人工感染的动物或已证明弓形虫感染的病人及畸形儿的组织能杂交〔3〕。该探针与不同动物源分离虫株的DNA(如ZS2、CN株)也能起特异的杂交反应，而CN株(猪源)DNA序列不尽相同；对各畸形儿分离虫体亦在同一位点上起反应。实验表明上述弓形虫速殖子DNA与探针具有同源性，从而进一步证实所分离的各虫株为孢子虫纲的弓形虫速殖子。至于各虫株在基因位点上是否有差异，尚须采用弓形虫不同克隆片段的探针进行位点测定及进一步研究和探讨。
在探讨DNA分子的生物学特性方面，在其他寄生原虫中见有研究报道〔8〕，而关于弓形虫核酸分子方面的研究，国内外研究不多，仅有少数学者利用DNA探针进行弓形虫病诊断〔3〕。至于弓形虫研究领域中对虫株特征的测定，尚未见有类似的报道。根据生物学对病原体虫株(种)的鉴定要求，除了对其形态特征、大小结构及毒力等考核外，还需采用DNA分子杂交进一步证实其虫株的特异性，本实验的结果可为鉴定虫株提供可靠的科学依据，为从事弓形虫研究的工作者开辟新的研究途径。
, 百拇医药
本实验有关DNA杂交试剂由分子生物学实验室张来仪配制，特此致谢
本课题为国家自然科学基金资助项目
参考文献
1 杨惠珍，徐克继，钱宗立，等。自畸形胎儿证示弓形虫感染的探讨。中华医学杂志，1989，11：655.
2 杨惠珍，徐克继。一种分离弓形虫速殖子的快速方法。全国第二次寄生虫学术讨论会论文汇编，1987，4：157.
3 夏爱娣，顾允中，杨惠珍，等。弓形虫基因组文库的建立、特异克隆的筛选和弓形虫病的DNA诊断。中国寄生虫学与寄生虫杂志，1990，8：165.
4 Southern EM.Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis.J Mol Biol,1975,98:503.
, http://www.100md.com
5 夏爱娣，杨惠珍，顾允中，等。特异弓形虫DNA顺序的克隆及用于弓形虫病的检测。上海医学，1989，12：531.
6 Maniatis T,Fritsch EF,Sambrook J.Analysis of Recombinant DNA Clones.Molecular Cloning,1982;365.
7 杨惠珍，徐克继，费 冲等。先天性畸形儿弓形虫感染4例及虫株的分离。上海医学，1988，11：268.
8 Bracha R,et al.Differentiation of clinical isolates of Entamoeba histolytica by using specific DNA probes.J Clin Microbiology Apr,1990,28:680.
(收稿：1992-05-18 修回：1992-12-15), http://www.100md.com