正常人关节软骨胶原含量测定的研究
作者：朱庆三 杨有赓 姜鸿志 许则民 周秋丽 常淑芳 白秀起 于景萍
单位：130021长春白求恩医科大学第三临床学院骨科(朱庆三，杨有赓，姜鸿志，许则民)，地方病研究所生化室(周秋丽，常淑芳，白秀起)；长春市妇产医院(于景萍)
关键词：软骨，关节；胶原；羟脯氨酸
中华医学杂志930306 摘要 测定了188名急死者不同部位关节软骨样本的胶原含量，股骨头软骨，胶原含量为496±35mg/g，股骨髁为456±38mg/g，肱骨头为588±42mg/g。从而确立了正常人关节软骨胶原含量的范围，为研究病态软骨胶原代谢提供了正常对照参数；通过比较，非特重关节软骨的胶原含明显高于持重关节；下肢持重关节软骨承受压应力越大者胶原含量越低，即关节软骨中胶原含量与承重大小呈负相关。本实验还改进了软骨胶原含量的测定方法，提高了测定的准确性。
, http://www.100md.com 胶原是人体中含量最多的蛋白质，占人人本蛋白总量的1/4～1/3。胶原纤维遍及全身，是骨、软骨的结构基础〔1，2〕。我们对188名急死正常人关节软骨胶原含量进行了测定，以确立正常人关节软骨胶原含量的正常值范围，并比较了不同部位软骨胶原含量的差异，为研究病态软骨的生化改变奠定了基础。
材料与方法
一、组织取材
健康男性，年龄18～54岁，30岁以下占91%。头部外伤急死后4～6小时取材，样本取下后即刻用生理盐水冲去血迹，取不包括软骨下骨的全层关节软骨成片状，置液氮中保存至应用。共188份样本，股骨头软骨104份，股骨髁62份，肱骨头22份。
二、试剂与仪器
1.试剂：全部为AR以上级试剂(详见实验方法内容)。
, 百拇医药
2.仪器：25μl、250μl加样器，1712MP8型全自动电子分析天平(德国Sartorius Ltd.生产)，722型光栅分光光度计(上海第三分析仪器厂生产)等。
三、实验方法
采用改良的羟脯氨酸(HPR)测定法〔3～6〕。
1.软骨脱脂：将切成薄片的软骨置20ml试管中，加丙酮2次，各6小时弃去，最后用乙醚脱脂1次过夜。将已脱脂软骨剪碎，置50℃恒温箱中干燥4小时。
2.提取胶原：干燥后，每份样品称取50mg，置10ml带盖试管中，加入0.3mol/L三氯醋酸(TCA)溶液3ml，置90℃恒温箱内3小时，冷地后离心(3?500r/min)5分钟，上清置20ml洁净试管中；沉淀中再加入0.3mol/L TCA 2ml，依上法提取1次，合产上清于前一提取液中。将盛有提取液的试管置烘箱中120℃蒸干。
, 百拇医药
3.待测样品设备：蒸干后的试管中加入6mol/L HCl溶液2ml，溶解全部剩余物后，移入5ml洁净安瓶中，封口，120℃水解10小时。取水解液20μl，加蒸馏水6?000μl，振荡后配成待测样品。
4.羟脯氨酸(HPR)测定：取待测样品lml，加入0.05mol/L GuSO4溶液0.5ml及10%NaOH溶液0.5ml，再加入6%H2O2溶液0.5ml，置30℃水浴10分钟。其间振荡3次。加入无水乙醇0.5ml，再放置20分钟，其间振荡3次；加6mol/L HCl lml，再加5%对二甲氨基苯甲醛lml摇匀，于60℃水浴15分钟，自然冷却后，测540nm的吸光值。
5.标准液配制：取2mg标准HPR，溶于50ml容量瓶中，配成储备液50ml。实验时按0、2、4、6、8……16μg/ml稀释成不同浓度，与待测样品同步测定吸光值。
, 百拇医药
6.计算样品HPR浓度及胶原含量：样品HPR浓度＝标准HPR浓度×所测样品吸光值/标准HPR此浓度吸光值；样品中(lml水解物)胶原含量百分比＝样品HPR浓度/组织量×D×100(D为计算常数＝7.46)〔4〕。
结果与讨论
一、正常人关节软骨胶原含量
1.正常人胶原含量：过去人们一直笼统地称胶原占软骨干重50%。Matthews〔7〕报道了7例骨性关节炎软骨的胶原含量变化；Anderson等〔8〕报道了60例下肢关节软骨的胶原含量。此后人们在研究病态软骨胶原含量变化时，较多引用Anderson等的这一结果 为正常对照值。但Anderson这组60份样本中，年龄范围差别较大，从10～89岁，其中10～19岁29份，占33.3%；70～89岁17份，占28.3%，而这两个年龄段恰是胶原相对不稳定阶段。后来Campo(1967年)、Johnson(1980年)等又分别测定了小牛和兔关节软骨胶原含量。综上看出，过去虽有关于人关节软骨胶原含量的报告〔7～9〕，但由于取材方面的限制，样本量不足，或年龄范围差别造成数据离散(象Anderson的结果，正常值范围54%～81%)。
, 百拇医药
本实验样本，年龄集中在青壮年，标本新鲜。全部结果经统计学处理认为除肱骨头外皆达到可作为确立正常值应用的例数(表1)。
表1 正常人关节软骨胶原含量范围(95%) 部位
样本数
胶原含量(mg/g)
数据分布鞋
股骨头
104
427～564
正态
股骨髁
62
, 百拇医药
382～530
正态
肱骨头
22
545～630
正态
肱骨头软骨仅22份，不足做为正常值计算的份数，此处以平均数及标准差的范围给出。
2.正常人不同部位关节软骨胶原含量经较：关节软骨的主要功能是维持关节正常活动及持重，并有一定的缓冲应力的作用。有学者指出，体重70kg的人骨盆水平位单腿站立时，作用于股骨头上的关节反力约2.75倍于体重〔10〕；毛宾尧等〔11〕指出，膝关节屈曲15°时，力线恰好通过膝关节中心，此状态下的关节反力约为体重的4.9倍，几乎是髋关节承重的1倍。
, http://www.100md.com
表2 不同部位关节软骨胶原含量(mg/g，
±s) 部 位
胶原含量
P值
(1)肱骨头
588±42
(1):(2)<0.01
(2)股骨头
496±35
(2):(3)<0.01
(3)股骨髁
456±38
, http://www.100md.com
(1):(3)<0.01
从表2可见，非持重关节软骨的胶原含量高于持重软骨，而承受压力越大的关节，其软骨胶原含量越低。即关节软骨的胶原含量与持重的大小呈负相关。
3.不同年龄股骨头关节软骨胶原含量比较：Matthews测定了7份(42～78岁)膝关节软骨的组分，软骨胶原在此年龄段没有规律性变化〔7〕；Anderson等〔8〕报告的60份(10～89岁)下肢关节软骨中，胶原含量呈平抛物线改变，即从10至50岁含量轻度增加，60岁以后呈逐渐降低趋势，但变化缓慢。Mc Devitt〔9〕测定了胚胎时期、出生后10周、25周、3岁及5岁龄猪关节软骨的胶原含量，分别为19.6、38.2、49.0、52.7和54.6%，规律比较明显。
本组104份股骨头年龄范围18～54岁，30岁以上(14份)胶原含量为479±35mg/g，30岁以下(90份)胶原含量为498±35mg/g，结果两组无显著差异(P>0.05)。
, 百拇医药
结合文献与本实验结果分析，哺乳动物软骨从胚胎时期至成年以前处于生长代谢、逐渐趋于成熟的最活跃阶段，随年龄增长胶原含量增多；从成年到发生退变以前处于相对稳定时期，胶原含量变化不明显；老年阶段，由于骨、软骨退变，胶原含量逐渐减少，并有结构上的变化，这就构成了骨、软骨退化的基础。
二、胶原含量与力学及生化构成的关系
软骨是一种多孔的弹性材料，其基质为水、蛋白多糖(PG)及胶原组成。软骨的力学性质随液体的含量而变化。PG的亲水性很强，其分子在液体中能进行可逆的压缩，对维持软骨的粘弹性及对抗压力起着重要作用。胶原最重要的力学性质是其拉伸强度及拉伸刚度，它形成软骨基质的网架，而PG“陷入”在胶原构成的网眼中，胶原为软骨提供了一种纤维状超微结构，因此胶原网和多水的PG一起，抵抗关节的应力和应变。在与关节面平行的平面内，胶原的性质，及其联键密度的变化和(或)胶原-PG之间的相互作用被认为是物质性能的各向异性的根据〔2，10，12〕。
, http://www.100md.com
既往有研究表明，非持重部位软骨的PG含量低于持重部位；且有报道认为胶原/PG比率在持重部位低于非持重部软骨〔7，13，14〕。从本实验结果看(表2)，持重与非持重软骨的生化构成上下单单是PG有差异，胶原的含量也不同。进一步讲是这两种构成成分相互间的关系在影响着软骨的性质，这是一种构效关系。或反过来说是由于软骨所执行的生理功能不同而决定了其生化构成上的差异。但PG与胶原纤维间如何作用，尚未充分了解，有待进一步研究。
三、胶原测定方法的改进
1.Neuman和Logan的方法：自从Neuman和Logan(1949年)首次用组织直接水解法测定了组织中HPR含量后，大多数学者都由此方法折算测定组织中胶原含量。此后，虽然许多学者不断对这一方法进行改进、完善，但将所测定组织直接用盐酸水解后测定HPR这一模式始终没有改变〔3，4，5〕。由于组织胶原在分解过程中产生游离的HPR及含有HPR的寡肽；且胶原合成过程中，未经共价交联的原胶原分子易分解而释出游离的HPR，故用组织直接水解所测定的HPR并非都是胶原中所含的HPR，即用组织直接水解测定和计算时，非胶原蛋白中所含的HPR都一并被折算成胶原含量了。
, 百拇医药
2.本实验改良的方法：因存在前述问题，且目前还没有一种好的方法直接测定组织中的胶原含量。为增加实验结果的准确性，我们利用了Fitch的方法，先提取胶原后再水解提取物测定HPR，再折算成胶原含量。
Fitch(1955年)在测定DNA的过程中观察到，用热的三氯醋酸(TCA)进行组织提取，几乎可以完全除去胶原。通过这一过程，狗动脉壁中的弹性蛋白没有被溶解，即此法中没有混入其他组织水解产生的HRP〔6〕。本实验观察到，这种方法对诸如关节软骨及纤维软骨这些极难匀浆的组织有很大优越性，且简单，快速，重复性好，数据离散度小，适用于各种组织胶原含量测定。与直接用盐酸水解组织法比较，两者比率为93.51%。
注：本课题为国家自然科学基金资助项目
参考文献
1 上海第一医学院主编。医用生物化学(下册)。北京：人民卫生出版社，1979∶1278.
, 百拇医药
2 徐学峥，孙岩林，梅懋华，等。生理生化学与医学，第2版，北京：科学技术出版社，1987∶1.
3 Neuman RE.Amino acid composition of gelatins,collagens and elastins from diffenent sources.Arch Biochem,1949,24∶289.
4 Neuman RE,Logan MA.The determination of collagen and elastin in tissue.J Biol Chem,1950,186∶549.
5 郭兆同。羟脯氨酸测定法的改进。生物化学与生物物理学学报，1964，4∶476.
6 Fitch SM,Margaret LR,Harkness RD.Extration of collagen from tissues.Nature,1955,176∶163.
, 百拇医药
7 Matthews BF.Composition of articular cartilage in osteoarthritis:changes in collagen/chondroitin-sulphate ratio.british Med J,1953,2∶660.
8 Anderson CE,Ludowieg J,Harper HA,et al.The compo-sition of the organic component of human articular carti-lage.J Bone Joint Surg,1964,64A:1176.
9 Mc Devitt CA.Biochemistry of articular cartilage.nature of proteoglycans amd collagen of articular cartilage and their in aging and in osteoarthritis.Ann Rheum Dis,1973,32∶364.
, 百拇医药
10 黄庆森，单文文译。骨骼系统基本生物力学。天津科技出版社，1986，164.
11 毛宾尧，张学义，乐兴样，等。膝关节外科。北京：人民卫生出版社，1987∶21.
12 冯元桢。生物力学。北京：科学出版社，1983∶250.
13 Slowman SD,Brandt KD.Composition and glycosaminoglycan metabolism of articular cartilage from habitually loaded and habituallyunloaded sites.Arthritis Rheum,1986,29∶88.
14 Joseph ML,Charles W.Review of articular cartilage collagen research.Arthritis Rheum,1975,18∶553.
(收稿：1992-08-05 修回：1992-12-05), 百拇医药
单位：130021长春白求恩医科大学第三临床学院骨科(朱庆三，杨有赓，姜鸿志，许则民)，地方病研究所生化室(周秋丽，常淑芳，白秀起)；长春市妇产医院(于景萍)
关键词：软骨，关节；胶原；羟脯氨酸
中华医学杂志930306 摘要 测定了188名急死者不同部位关节软骨样本的胶原含量，股骨头软骨，胶原含量为496±35mg/g，股骨髁为456±38mg/g，肱骨头为588±42mg/g。从而确立了正常人关节软骨胶原含量的范围，为研究病态软骨胶原代谢提供了正常对照参数；通过比较，非特重关节软骨的胶原含明显高于持重关节；下肢持重关节软骨承受压应力越大者胶原含量越低，即关节软骨中胶原含量与承重大小呈负相关。本实验还改进了软骨胶原含量的测定方法，提高了测定的准确性。
, http://www.100md.com 胶原是人体中含量最多的蛋白质，占人人本蛋白总量的1/4～1/3。胶原纤维遍及全身，是骨、软骨的结构基础〔1，2〕。我们对188名急死正常人关节软骨胶原含量进行了测定，以确立正常人关节软骨胶原含量的正常值范围，并比较了不同部位软骨胶原含量的差异，为研究病态软骨的生化改变奠定了基础。
材料与方法
一、组织取材
健康男性，年龄18～54岁，30岁以下占91%。头部外伤急死后4～6小时取材，样本取下后即刻用生理盐水冲去血迹，取不包括软骨下骨的全层关节软骨成片状，置液氮中保存至应用。共188份样本，股骨头软骨104份，股骨髁62份，肱骨头22份。
二、试剂与仪器
1.试剂：全部为AR以上级试剂(详见实验方法内容)。
, 百拇医药
2.仪器：25μl、250μl加样器，1712MP8型全自动电子分析天平(德国Sartorius Ltd.生产)，722型光栅分光光度计(上海第三分析仪器厂生产)等。
三、实验方法
采用改良的羟脯氨酸(HPR)测定法〔3～6〕。
1.软骨脱脂：将切成薄片的软骨置20ml试管中，加丙酮2次，各6小时弃去，最后用乙醚脱脂1次过夜。将已脱脂软骨剪碎，置50℃恒温箱中干燥4小时。
2.提取胶原：干燥后，每份样品称取50mg，置10ml带盖试管中，加入0.3mol/L三氯醋酸(TCA)溶液3ml，置90℃恒温箱内3小时，冷地后离心(3?500r/min)5分钟，上清置20ml洁净试管中；沉淀中再加入0.3mol/L TCA 2ml，依上法提取1次，合产上清于前一提取液中。将盛有提取液的试管置烘箱中120℃蒸干。
, 百拇医药
3.待测样品设备：蒸干后的试管中加入6mol/L HCl溶液2ml，溶解全部剩余物后，移入5ml洁净安瓶中，封口，120℃水解10小时。取水解液20μl，加蒸馏水6?000μl，振荡后配成待测样品。
4.羟脯氨酸(HPR)测定：取待测样品lml，加入0.05mol/L GuSO4溶液0.5ml及10%NaOH溶液0.5ml，再加入6%H2O2溶液0.5ml，置30℃水浴10分钟。其间振荡3次。加入无水乙醇0.5ml，再放置20分钟，其间振荡3次；加6mol/L HCl lml，再加5%对二甲氨基苯甲醛lml摇匀，于60℃水浴15分钟，自然冷却后，测540nm的吸光值。
5.标准液配制：取2mg标准HPR，溶于50ml容量瓶中，配成储备液50ml。实验时按0、2、4、6、8……16μg/ml稀释成不同浓度，与待测样品同步测定吸光值。
, 百拇医药
6.计算样品HPR浓度及胶原含量：样品HPR浓度＝标准HPR浓度×所测样品吸光值/标准HPR此浓度吸光值；样品中(lml水解物)胶原含量百分比＝样品HPR浓度/组织量×D×100(D为计算常数＝7.46)〔4〕。
结果与讨论
一、正常人关节软骨胶原含量
1.正常人胶原含量：过去人们一直笼统地称胶原占软骨干重50%。Matthews〔7〕报道了7例骨性关节炎软骨的胶原含量变化；Anderson等〔8〕报道了60例下肢关节软骨的胶原含量。此后人们在研究病态软骨胶原含量变化时，较多引用Anderson等的这一结果 为正常对照值。但Anderson这组60份样本中，年龄范围差别较大，从10～89岁，其中10～19岁29份，占33.3%；70～89岁17份，占28.3%，而这两个年龄段恰是胶原相对不稳定阶段。后来Campo(1967年)、Johnson(1980年)等又分别测定了小牛和兔关节软骨胶原含量。综上看出，过去虽有关于人关节软骨胶原含量的报告〔7～9〕，但由于取材方面的限制，样本量不足，或年龄范围差别造成数据离散(象Anderson的结果，正常值范围54%～81%)。
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本实验样本，年龄集中在青壮年，标本新鲜。全部结果经统计学处理认为除肱骨头外皆达到可作为确立正常值应用的例数(表1)。
表1 正常人关节软骨胶原含量范围(95%) 部位
样本数
胶原含量(mg/g)
数据分布鞋
股骨头
104
427～564
正态
股骨髁
62
, 百拇医药
382～530
正态
肱骨头
22
545～630
正态
肱骨头软骨仅22份，不足做为正常值计算的份数，此处以平均数及标准差的范围给出。
2.正常人不同部位关节软骨胶原含量经较：关节软骨的主要功能是维持关节正常活动及持重，并有一定的缓冲应力的作用。有学者指出，体重70kg的人骨盆水平位单腿站立时，作用于股骨头上的关节反力约2.75倍于体重〔10〕；毛宾尧等〔11〕指出，膝关节屈曲15°时，力线恰好通过膝关节中心，此状态下的关节反力约为体重的4.9倍，几乎是髋关节承重的1倍。
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表2 不同部位关节软骨胶原含量(mg/g，
±s) 部 位胶原含量
P值
(1)肱骨头
588±42
(1):(2)<0.01
(2)股骨头
496±35
(2):(3)<0.01
(3)股骨髁
456±38
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(1):(3)<0.01
从表2可见，非持重关节软骨的胶原含量高于持重软骨，而承受压力越大的关节，其软骨胶原含量越低。即关节软骨的胶原含量与持重的大小呈负相关。
3.不同年龄股骨头关节软骨胶原含量比较：Matthews测定了7份(42～78岁)膝关节软骨的组分，软骨胶原在此年龄段没有规律性变化〔7〕；Anderson等〔8〕报告的60份(10～89岁)下肢关节软骨中，胶原含量呈平抛物线改变，即从10至50岁含量轻度增加，60岁以后呈逐渐降低趋势，但变化缓慢。Mc Devitt〔9〕测定了胚胎时期、出生后10周、25周、3岁及5岁龄猪关节软骨的胶原含量，分别为19.6、38.2、49.0、52.7和54.6%，规律比较明显。
本组104份股骨头年龄范围18～54岁，30岁以上(14份)胶原含量为479±35mg/g，30岁以下(90份)胶原含量为498±35mg/g，结果两组无显著差异(P>0.05)。
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结合文献与本实验结果分析，哺乳动物软骨从胚胎时期至成年以前处于生长代谢、逐渐趋于成熟的最活跃阶段，随年龄增长胶原含量增多；从成年到发生退变以前处于相对稳定时期，胶原含量变化不明显；老年阶段，由于骨、软骨退变，胶原含量逐渐减少，并有结构上的变化，这就构成了骨、软骨退化的基础。
二、胶原含量与力学及生化构成的关系
软骨是一种多孔的弹性材料，其基质为水、蛋白多糖(PG)及胶原组成。软骨的力学性质随液体的含量而变化。PG的亲水性很强，其分子在液体中能进行可逆的压缩，对维持软骨的粘弹性及对抗压力起着重要作用。胶原最重要的力学性质是其拉伸强度及拉伸刚度，它形成软骨基质的网架，而PG“陷入”在胶原构成的网眼中，胶原为软骨提供了一种纤维状超微结构，因此胶原网和多水的PG一起，抵抗关节的应力和应变。在与关节面平行的平面内，胶原的性质，及其联键密度的变化和(或)胶原-PG之间的相互作用被认为是物质性能的各向异性的根据〔2，10，12〕。
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既往有研究表明，非持重部位软骨的PG含量低于持重部位；且有报道认为胶原/PG比率在持重部位低于非持重部软骨〔7，13，14〕。从本实验结果看(表2)，持重与非持重软骨的生化构成上下单单是PG有差异，胶原的含量也不同。进一步讲是这两种构成成分相互间的关系在影响着软骨的性质，这是一种构效关系。或反过来说是由于软骨所执行的生理功能不同而决定了其生化构成上的差异。但PG与胶原纤维间如何作用，尚未充分了解，有待进一步研究。
三、胶原测定方法的改进
1.Neuman和Logan的方法：自从Neuman和Logan(1949年)首次用组织直接水解法测定了组织中HPR含量后，大多数学者都由此方法折算测定组织中胶原含量。此后，虽然许多学者不断对这一方法进行改进、完善，但将所测定组织直接用盐酸水解后测定HPR这一模式始终没有改变〔3，4，5〕。由于组织胶原在分解过程中产生游离的HPR及含有HPR的寡肽；且胶原合成过程中，未经共价交联的原胶原分子易分解而释出游离的HPR，故用组织直接水解所测定的HPR并非都是胶原中所含的HPR，即用组织直接水解测定和计算时，非胶原蛋白中所含的HPR都一并被折算成胶原含量了。
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2.本实验改良的方法：因存在前述问题，且目前还没有一种好的方法直接测定组织中的胶原含量。为增加实验结果的准确性，我们利用了Fitch的方法，先提取胶原后再水解提取物测定HPR，再折算成胶原含量。
Fitch(1955年)在测定DNA的过程中观察到，用热的三氯醋酸(TCA)进行组织提取，几乎可以完全除去胶原。通过这一过程，狗动脉壁中的弹性蛋白没有被溶解，即此法中没有混入其他组织水解产生的HRP〔6〕。本实验观察到，这种方法对诸如关节软骨及纤维软骨这些极难匀浆的组织有很大优越性，且简单，快速，重复性好，数据离散度小，适用于各种组织胶原含量测定。与直接用盐酸水解组织法比较，两者比率为93.51%。
注：本课题为国家自然科学基金资助项目
参考文献
1 上海第一医学院主编。医用生物化学(下册)。北京：人民卫生出版社，1979∶1278.
, 百拇医药
2 徐学峥，孙岩林，梅懋华，等。生理生化学与医学，第2版，北京：科学技术出版社，1987∶1.
3 Neuman RE.Amino acid composition of gelatins,collagens and elastins from diffenent sources.Arch Biochem,1949,24∶289.
4 Neuman RE,Logan MA.The determination of collagen and elastin in tissue.J Biol Chem,1950,186∶549.
5 郭兆同。羟脯氨酸测定法的改进。生物化学与生物物理学学报，1964，4∶476.
6 Fitch SM,Margaret LR,Harkness RD.Extration of collagen from tissues.Nature,1955,176∶163.
, 百拇医药
7 Matthews BF.Composition of articular cartilage in osteoarthritis:changes in collagen/chondroitin-sulphate ratio.british Med J,1953,2∶660.
8 Anderson CE,Ludowieg J,Harper HA,et al.The compo-sition of the organic component of human articular carti-lage.J Bone Joint Surg,1964,64A:1176.
9 Mc Devitt CA.Biochemistry of articular cartilage.nature of proteoglycans amd collagen of articular cartilage and their in aging and in osteoarthritis.Ann Rheum Dis,1973,32∶364.
, 百拇医药
10 黄庆森，单文文译。骨骼系统基本生物力学。天津科技出版社，1986，164.
11 毛宾尧，张学义，乐兴样，等。膝关节外科。北京：人民卫生出版社，1987∶21.
12 冯元桢。生物力学。北京：科学出版社，1983∶250.
13 Slowman SD,Brandt KD.Composition and glycosaminoglycan metabolism of articular cartilage from habitually loaded and habituallyunloaded sites.Arthritis Rheum,1986,29∶88.
14 Joseph ML,Charles W.Review of articular cartilage collagen research.Arthritis Rheum,1975,18∶553.
(收稿：1992-08-05 修回：1992-12-05), 百拇医药