甲型肝炎病毒H2减毒株的某些遗传特征
作者：柴少爱 张杭春 张淑雅 陈念良 黄海鹰 刘春江 谢汝英 毛江森
单位：310013 杭州市，浙江省医学科学院病毒研究所
关键词：甲型肝炎病毒；疫苗；遗传特征
中华医学杂志930605 摘要 甲型肝炎病毒H2减毒株在KMB17细胞36℃连传5代经猴体试验未发现有毒力回升。H2减毒株制备的活疫苗人体注射后，未发现有水平传播。38名3～9岁儿童1次口服106.5TCID50，8周后血清甲肝抗体无一人阳转，而同年龄组的经皮下途径接种者，100%阳转。人口服途径不感觉是H2减毒株的重要遗传特征，有可能作为区别野毒株与减毒株的标记。
我们利用恒河猴进行了甲型肝炎病毒H2减毒株的毒力试验，在此基础上，用H2减毒株制备的活疫苗H2M20K7对儿童进行了口服和皮下接种，观察H2减毒株的某些遗传特征，现将结果报告如下。
, http://www.100md.com
材料与方法
一、材料
1.H2减毒株H2M20K5(32℃)系用于生产H2疫苗用母毒株〔1〕。H2疫苗系用H2M20K5毒种在KMB17细胞连续培育2代而成。
2.细胞
用于培育甲肝病毒的细胞为人胚肺二倍体细胞KMB17〔2〕，由昆明医学生物学研究所提供。
3.恒河猴：来自中国医学科学院昆明医学生物学研究所。
4.抗HAV抗体检测试剂：用于本实验检测抗甲肝病毒(HAV)抗体的试剂均由本所试剂室生产。
, 百拇医药
二、方法
1.H2M20K5毒种毒力回升试验：生长成单层的KMB17细胞，用HamKs液洗2次，接种H2M20K5(32℃)毒种，每40cm2培养方瓶1.0ml，病毒量为10〔7.0〕TCIK50，37℃吸附2小时后补足2%新生小牛血清维持液，置36℃恒温培育28天。连续传代5次，获得H2M20K10(36℃)毒株，用先前报告制备H2疫苗的方法〔1〕制备每毫升含10〔7.5〕TCID50的疫苗，置4℃备用。
经3次筛选(感染前6周、3周、0周)SGPT、LDH5正常，HAV抗体阴性，体重1.5kg～4.5kg健康恒河猴8只，4只静脉内注射H2M20K10(36℃)毒株，每只0.25×10〔7.5〕TCID50，另4只注射H2M20K5疫苗株，每只0.25×10〔6.5〕TCID50。接种病毒后16周内，每周采静脉血一次，检测血清SGPT，LDH5、抗HAV抗体，并在接种前、接种后第4、8周作肝脏穿刺病理切片检查。
, http://www.100md.com
2.H2M20K7疫苗口服途径与注射途径的比较：(1)接种对象：3～9岁儿童共60名，其中16名3～4岁儿童选自杭州市内5个幼儿园，44名8～9岁儿童选自文三小学3个班级。所有接种者均经家长签名同意。接种前血清SGPT值正常，HAV抗体阴性。H2M20K7疫苗直疫苗接种剂量10〔6.5〕TCID50。(2)口服途径：将接滴于饼干上，冷开水吞服；(3)注射途径：左上臂皮下1次注射。
3.密切接触者使用疫苗水平传播的观察：选自1个小学7个班级SGPT值正常、HAV抗体阴性的小学生，共228名，其中141人左上臂皮下注射H2M20K7疫苗，接种量为10〔6.5〕TCID50。另87人未接种疫苗者作为水平传播的观察对象。接种疫苗后5～11个月抽静脉血检测HAV抗体。
, 百拇医药
结 果
一、接种H2M20K10(36℃)毒株的4只恒河猴，在接种后16周观察期内，每周检查1次SGPT、LDH5，第4、8周作肝穿刺病理检查，结果均未发现异常。H2M20K10(36℃)毒株接种组，HAV抗体出现时间平均为3周，比H2M20K5疫苗组(平均7周)明显我。但两组HAV抗体滴度相似，均在1∶20～1∶40之间(表1)。
表1 H2M20K10(36℃)，H2M20K5疫苗静脉接种恒河猴 毒种
接种剂量TCID50
猴号
, 百拇医药
HAV-抗体(ELISA法)
阳性
时间(周)
H2M20K10
(36℃)
0.25×107.5
9
+
2
12
+
5
, http://www.100md.com
48
+
2
49
+
3
H2M20K5
0.25×106.5
3
+
9
10
+
, 百拇医药
8
24
+
11
38
+
10
二、经口服途径与皮下注射途径接种H2M20K7疫苗的60名儿童，接种后8周抽血检查HAV抗体。结果表明，22名皮下接种者HAV抗体100%阳转，而38名口服疫苗者HAV抗体全部阴性(表2)。
表2 H2M20K7疫苗口服途径与注射途径的比较 接种途径
, http://www.100md.com 接种剂量(TCID50)
年龄(岁)
接种人数
HAV抗体阳性人数
口服
106.5
3～4
16
0
口服
106.5
8～9
, 百拇医药
22
0
皮下
106.5
8～9
22
22
三、7个班级、228名儿童，在疫苗接种后5、8、11个月抽静脉血检测HAV抗体，结果疫苗接种者141人HAV抗体全部阳性，而水平传播观察组87名未接种疫苗者无一人阳转。
讨 论
本实验从三个方面研究了甲型肝炎病毒活疫苗H2株的遗传特征。已有报道〔1〕，H2疫苗的母毒种H2M20K5(32℃)是从强毒株H2M20在32℃低温培育5代而获得。本实验将减毒后的H2M20K5(32℃)重新回复高温(36℃)，培育并传代5次获得的H2M20K10(36℃)，经恒河猴试验表明，被减去的毒力不再重新出现，免疫原性仍保持不变。即使是10倍病毒量的H2M20K10(36℃)，猴体SGPT、LDH5以及肝穿活检等指标仍未出现异常。
, 百拇医药
10倍病毒量的H2M20K10(36℃)注入恒河猴产生的HAV抗体仍只有1∶20～1∶40，推测10〔6.5〕TCID50病毒量的H2减毒株已能产生坪曲线的甲肝病毒杭体。病毒量的增加，只能缩短坪贡线出现的时间，不会象野毒或灭活疫苗那样产生高滴度的抗体。由H2减毒株免疫产生的低滴度抗体，又能100%地保护机体，免遭自然界甲肝病毒野毒株的感染。
在同一个小学7个班级228名HAV抗体阴性的儿童中，141人注射了H2M20K7疫苗，另87人在长达5、8、11个月与疫苗接种者的密切接触中，均未引起甲肝疫苗病毒的传播产生HAV抗体。
38名口服H2M20K7疫苗者，HAV抗体无一人阳转。特别需要指出的是，实验中16名3岁儿童，口服疫苗后8周HAV抗体无一例阳转。该结果进一步表明，甲肝病毒H2减毒株不能经口感染。张淑雅等报告〔3〕，H2减毒株疫苗接种者粪便中有少量甲肝病毒排出。该粪便排出的甲肝病毒会否再感染，从本研究87名HAV抗体阴性，与疫苗接种者长达5～11个月的密切接触，即无一人HAV抗体出现阳转。这表明，疫苗接种者粪便中排出的甲肝病毒与注射用的甲肝疫苗病毒一样，不能经口感染。Provost等〔4〕的实验结果指示，减毒的甲肝毒减弱了它在体外以及在肝脏的繁殖能力、免疫原性好、体外及肝脏繁殖能力差、遗传特性稳定的减毒株。人口服途径不感染是H2减毒株的另一重要遗传特征。这一特征完全有可能作为区别野毒株与减毒株的标记。
, 百拇医药
参考文献
1 Mao J,S Dong DX,Zhang HY,ea tl.Primarystudy of attenuated live hepatitis.A vaccine (H2 strain) in humans.J Infect Dis,1989,159:621.
2 郭 仁，曹逸云，戴振洲，等.一株入胚肺二倍体细胞株(KMB17)的特性.中国医学科学院学报，1981，32，226.
3 张淑雅，毛江森，黄海鹰，等.甲型肝炎减毒活疫羁(H2减毒株)在人体接种的安全性观察.中华医学杂志，1990，70：682.
4 Provost PJ,Krab DL,Kuter BJ,et al.Futher evaluation of a live hepatitis A vaccine in marmosets.J Med Virol,1991,34:227.
(收稿：1992-09-21 修回：1993-04-22), http://www.100md.com
单位：310013 杭州市，浙江省医学科学院病毒研究所
关键词：甲型肝炎病毒；疫苗；遗传特征
中华医学杂志930605 摘要 甲型肝炎病毒H2减毒株在KMB17细胞36℃连传5代经猴体试验未发现有毒力回升。H2减毒株制备的活疫苗人体注射后，未发现有水平传播。38名3～9岁儿童1次口服106.5TCID50，8周后血清甲肝抗体无一人阳转，而同年龄组的经皮下途径接种者，100%阳转。人口服途径不感觉是H2减毒株的重要遗传特征，有可能作为区别野毒株与减毒株的标记。
我们利用恒河猴进行了甲型肝炎病毒H2减毒株的毒力试验，在此基础上，用H2减毒株制备的活疫苗H2M20K7对儿童进行了口服和皮下接种，观察H2减毒株的某些遗传特征，现将结果报告如下。
, http://www.100md.com
材料与方法
一、材料
1.H2减毒株H2M20K5(32℃)系用于生产H2疫苗用母毒株〔1〕。H2疫苗系用H2M20K5毒种在KMB17细胞连续培育2代而成。
2.细胞
用于培育甲肝病毒的细胞为人胚肺二倍体细胞KMB17〔2〕，由昆明医学生物学研究所提供。
3.恒河猴：来自中国医学科学院昆明医学生物学研究所。
4.抗HAV抗体检测试剂：用于本实验检测抗甲肝病毒(HAV)抗体的试剂均由本所试剂室生产。
, 百拇医药
二、方法
1.H2M20K5毒种毒力回升试验：生长成单层的KMB17细胞，用HamKs液洗2次，接种H2M20K5(32℃)毒种，每40cm2培养方瓶1.0ml，病毒量为10〔7.0〕TCIK50，37℃吸附2小时后补足2%新生小牛血清维持液，置36℃恒温培育28天。连续传代5次，获得H2M20K10(36℃)毒株，用先前报告制备H2疫苗的方法〔1〕制备每毫升含10〔7.5〕TCID50的疫苗，置4℃备用。
经3次筛选(感染前6周、3周、0周)SGPT、LDH5正常，HAV抗体阴性，体重1.5kg～4.5kg健康恒河猴8只，4只静脉内注射H2M20K10(36℃)毒株，每只0.25×10〔7.5〕TCID50，另4只注射H2M20K5疫苗株，每只0.25×10〔6.5〕TCID50。接种病毒后16周内，每周采静脉血一次，检测血清SGPT，LDH5、抗HAV抗体，并在接种前、接种后第4、8周作肝脏穿刺病理切片检查。
, http://www.100md.com
2.H2M20K7疫苗口服途径与注射途径的比较：(1)接种对象：3～9岁儿童共60名，其中16名3～4岁儿童选自杭州市内5个幼儿园，44名8～9岁儿童选自文三小学3个班级。所有接种者均经家长签名同意。接种前血清SGPT值正常，HAV抗体阴性。H2M20K7疫苗直疫苗接种剂量10〔6.5〕TCID50。(2)口服途径：将接滴于饼干上，冷开水吞服；(3)注射途径：左上臂皮下1次注射。
3.密切接触者使用疫苗水平传播的观察：选自1个小学7个班级SGPT值正常、HAV抗体阴性的小学生，共228名，其中141人左上臂皮下注射H2M20K7疫苗，接种量为10〔6.5〕TCID50。另87人未接种疫苗者作为水平传播的观察对象。接种疫苗后5～11个月抽静脉血检测HAV抗体。
, 百拇医药
结 果
一、接种H2M20K10(36℃)毒株的4只恒河猴，在接种后16周观察期内，每周检查1次SGPT、LDH5，第4、8周作肝穿刺病理检查，结果均未发现异常。H2M20K10(36℃)毒株接种组，HAV抗体出现时间平均为3周，比H2M20K5疫苗组(平均7周)明显我。但两组HAV抗体滴度相似，均在1∶20～1∶40之间(表1)。
表1 H2M20K10(36℃)，H2M20K5疫苗静脉接种恒河猴 毒种
接种剂量TCID50
猴号
, 百拇医药
HAV-抗体(ELISA法)
阳性
时间(周)
H2M20K10
(36℃)
0.25×107.5
9
+
2
12
+
5
, http://www.100md.com
48
+
2
49
+
3
H2M20K5
0.25×106.5
3
+
9
10
+
, 百拇医药
8
24
+
11
38
+
10
二、经口服途径与皮下注射途径接种H2M20K7疫苗的60名儿童，接种后8周抽血检查HAV抗体。结果表明，22名皮下接种者HAV抗体100%阳转，而38名口服疫苗者HAV抗体全部阴性(表2)。
表2 H2M20K7疫苗口服途径与注射途径的比较 接种途径
, http://www.100md.com 接种剂量(TCID50)
年龄(岁)
接种人数
HAV抗体阳性人数
口服
106.5
3～4
16
0
口服
106.5
8～9
, 百拇医药
22
0
皮下
106.5
8～9
22
22
三、7个班级、228名儿童，在疫苗接种后5、8、11个月抽静脉血检测HAV抗体，结果疫苗接种者141人HAV抗体全部阳性，而水平传播观察组87名未接种疫苗者无一人阳转。
讨 论
本实验从三个方面研究了甲型肝炎病毒活疫苗H2株的遗传特征。已有报道〔1〕，H2疫苗的母毒种H2M20K5(32℃)是从强毒株H2M20在32℃低温培育5代而获得。本实验将减毒后的H2M20K5(32℃)重新回复高温(36℃)，培育并传代5次获得的H2M20K10(36℃)，经恒河猴试验表明，被减去的毒力不再重新出现，免疫原性仍保持不变。即使是10倍病毒量的H2M20K10(36℃)，猴体SGPT、LDH5以及肝穿活检等指标仍未出现异常。
, 百拇医药
10倍病毒量的H2M20K10(36℃)注入恒河猴产生的HAV抗体仍只有1∶20～1∶40，推测10〔6.5〕TCID50病毒量的H2减毒株已能产生坪曲线的甲肝病毒杭体。病毒量的增加，只能缩短坪贡线出现的时间，不会象野毒或灭活疫苗那样产生高滴度的抗体。由H2减毒株免疫产生的低滴度抗体，又能100%地保护机体，免遭自然界甲肝病毒野毒株的感染。
在同一个小学7个班级228名HAV抗体阴性的儿童中，141人注射了H2M20K7疫苗，另87人在长达5、8、11个月与疫苗接种者的密切接触中，均未引起甲肝疫苗病毒的传播产生HAV抗体。
38名口服H2M20K7疫苗者，HAV抗体无一人阳转。特别需要指出的是，实验中16名3岁儿童，口服疫苗后8周HAV抗体无一例阳转。该结果进一步表明，甲肝病毒H2减毒株不能经口感染。张淑雅等报告〔3〕，H2减毒株疫苗接种者粪便中有少量甲肝病毒排出。该粪便排出的甲肝病毒会否再感染，从本研究87名HAV抗体阴性，与疫苗接种者长达5～11个月的密切接触，即无一人HAV抗体出现阳转。这表明，疫苗接种者粪便中排出的甲肝病毒与注射用的甲肝疫苗病毒一样，不能经口感染。Provost等〔4〕的实验结果指示，减毒的甲肝毒减弱了它在体外以及在肝脏的繁殖能力、免疫原性好、体外及肝脏繁殖能力差、遗传特性稳定的减毒株。人口服途径不感染是H2减毒株的另一重要遗传特征。这一特征完全有可能作为区别野毒株与减毒株的标记。
, 百拇医药
参考文献
1 Mao J,S Dong DX,Zhang HY,ea tl.Primarystudy of attenuated live hepatitis.A vaccine (H2 strain) in humans.J Infect Dis,1989,159:621.
2 郭 仁，曹逸云，戴振洲，等.一株入胚肺二倍体细胞株(KMB17)的特性.中国医学科学院学报，1981，32，226.
3 张淑雅，毛江森，黄海鹰，等.甲型肝炎减毒活疫羁(H2减毒株)在人体接种的安全性观察.中华医学杂志，1990，70：682.
4 Provost PJ,Krab DL,Kuter BJ,et al.Futher evaluation of a live hepatitis A vaccine in marmosets.J Med Virol,1991,34:227.
(收稿：1992-09-21 修回：1993-04-22), http://www.100md.com