简便易行的β地中海贫血基因诊断新技术
作者：刘敬忠 刘辉贤 王海燕 王立荣 刘英姿 施贻君 李素霞 吴冠芸
单位：100005北京中国医学科学院基础医学研究所(刘敬忠、王海燕、王立荣、施贻君、吴冠芸)；重庆医科大学(刘辉贤)；宁夏医学科学研究所(刘英姿)；北京市儿童医院(李素霞)
关键词：
中华医学杂志930719 β-地中海贫血(β-地贫)绝大多数是由于β-珠蛋白基因的点突变引起的，运用聚合酶链反应(PCR)结合等位基因特异的寡核苷酸探针斑点杂交技术(ASO)能够比较快速、准确地进行基因及产前诊断〔1〕，但在推广应用中仍存在受放射性同位素的使用等限制及操作不够简便等问题。我们综合了MOEA〔2〕4个引物的PCR以及套层PCR(nested PCR)等新进展，设计的引物包括所有已知的引起中国人β-地贫的十几种突变位点，使用6种不同的引物组合进行MOEA及4引物的PCR。在检出突变的同时，还能区分杂合子与纯合子。50μl1.5kb扩增产物足够进行100至万余次检测突变，并利用该项新技术完成了13例个体的基因诊断和1例产前诊断。
, 百拇医药
一、材料与方法
1.引物设计与合成：本研究使用的正常引物与突变引物序列均为自行设计，突变碱基，有的安排在3’末端，有的安排在引物中央。引物由中国科学院微生物研究所ABI合成仪合成，脱盐后使用于PCR。
2.病例选择：本研究中β-地贫基因携带者及患者来源于四川、广西，其中部分样品的基因突变类型已经PCR/ASO技术鉴定〔1〕。
3.从1.5μl末梢血用引物108’，D’直接扩增1.5kb片段的方法见文献〔3〕。
4.MOEA：首次由Efremov等〔2〕报道，检测各种突变的MOEA法，均使用两个正常引物和1个突变引物，根据MOEA基本原理，被测样品如果没有与突变引物一致的基因突变时，可获由两个正常引物引导产生的较长扩增带；如系该突变纯合子，则可获由突变引物与反方向正常引物产生的较短扩增片段；如系杂合子，则为一长一短两条扩增带，反应总体系25μl。MOEA一般是在适当退火温度下保持45s；70℃为lmin；93℃为30s，共进行30次循环，最后一次70℃保持5min。取10μl产物用2%琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色，UV灯下观察或照相记录。
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5.4引物的PCR：针对654T合成一个正常引物，一个突变引物。654位正常的C及突变的A(反意链上)均在引物中部，被测DNA如果没有654T，应显示由P654A’和D-2产生的233bp带；如果为654T纯合子，则显示由P654T’和C’产生的206bp带；如果为其杂合子，则显示206和233bp两条区带。
二、结果
从1.5μl末梢血直接扩增1.5kb片段，图1所示为引物108’和D’以及直接用5个自愿受试者末梢血和一份基因组DNA作模板的PCR结果，用这种PCR产物混合物的适当稀释液作模板进行各种MOEA或4引物PCR。本研究用6种引物组合检测了我国最常见的6种基因突变样品，所观察到的扩增产物图谱均与预期的完全一致，不但可检测突变存在与否，而且可区分杂合子与纯合子。
1～5∶5个自愿供试者；6：以基因组DNA(0.5μg)作模板；M：pBR322 DNA-Bst NI酶解物
, 百拇医药
图1 1.5μl全血直接扩增人β珠蛋白1.5kb片段的1%琼脂糖凝胶电泳图。引物为108’和D
41-42T是在我国发生率最高的一种突变。图2所示为用14mer的P41-42T’及108’、B’进行MOEA的电泳结果。两个41-42T纯合子只显示451bp带，杂合子显示451bp和603bp两条带，已知没有41-42T的样品只有603bp带，显示了很好的特异性。
HO：41-42T钝合子；He:41-42T杂合子；no：无41-42T突变的样品；
M:pBR322D NA-Msp NI酶解物
图2 检测41-42T的MOEA产物电泳分离图。引物用108’/B’
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P41-42T’(14mer)，模板用扩增的1.5kb片段
17T是广西、四川及贵州等省仅次于41-42T的发生率很高的突变，从图3可见，在图2的实验条件下，用P17T、108及B’进行的MOEA能很好的区分无17T的样品及其杂合子，纯合子。
HO，He,no分别表示17T的纯合子，杂合子，无17T的样品。M:pBR322DNA-MspNI酶解物
图3 检测17T的MOEA产物电泳分离图，引物108’，B’，P17T’，退火温度56℃
654T是中南、东南地区几乎与41-42T一样高发的突变，曾使用引物C’、D’及P654T(19mer)的MOEA检测654T取得成功；但实验的重复性欠佳。又合成了较短的突变引物P654T’(16mer)，仍未取得满意的重复性。设计合成了P654A’，用上述4个引物进行PCR，如图4所示，取得了理想的且重复性很好的结果。
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HO、He、no：654T纯合子、杂合子及无654T的样品；M:pBR322DNA-MspNI酶解物
图4 检测654T的4引物PCR产物电泳分离图，引物C’，D’，P654A’，P654T’，退火温度为45℃
检测-28T、26T及71-72T的MOEA也都取得了满意的结果。此外，我们利用本方法完成了13例个体的基因诊断及1例产前诊断。
三、讨论
MOEA以及4个引物的PCR技术，使用3个或4个引物于一个PCR反应，不但可检出有无与突变引物对应的突变，而且可以同时显示是纯合子还是杂合子。因此用这两种PCR检测基因突变的技术较其他方法都简便易行，适合于推广。本研究通过大量实验，研究了影响MOEA特异性的各种因素，找到了检测每种突变的最佳反应条件。这些因素主要包括：退火温度一般高出突变引物的Tm值2～5℃；同方向正常引物的浓度低于突变引物浓度数倍；突变引物浓度也需要认真选择；模板用量太大时，MOEA将有明显非特异产物；循环数通常控制在30个。观察了二甲基亚砜(DMSO)及二甲基甲酰胺对MOEA特异性的影响，均没有得到增强MOEA检测基因突变特异性的效果。在保证扩增效率的前提下，使用较低浓度的Mg2+，较短的突变引物(14-16mer)显示更好的特异性，又节省；因此本研究中有8个突变引物采用了这种短的设计，突变碱基安排在引物3’末端上或中央，均取得较好效果。71-72T是在编码子71与72之间插入一个A引起框架位移，我们设计了4种不同的突变引物，分别将插入的A安排在倒数第1、2、3、4位，效果仍以安排在倒数第一位最好。此外，TaqDNA聚合每用量不宜过大等。
, 百拇医药
本研究首先从微量末梢血(或基因组DNA)扩增1.5kb片段，然后以后者为MOEA的模板，这样既可省去基因组DNA之抽提，又吸取了套层PCR的优点；并可使用更短的突变引物，提高了MOEA反应的特异性，经简便的操作程序(PCR+微型凝胶电泳)便可成功地进行6种β-地贫突变的检测(这6种突变占我国南方全部β-地贫突变的90-96%)。因此该技术有着重要的推广应用价值。
广西医学院儿科龙桂芳教授及重庆医科大学张 锦教授提供部分DNA样品。特此致谢
参考文献
1 Liu JZ,Gao QS,Jiang Z,et al.Studies of beta-thalassemia mutations in families living in three provinces in southern China.Hemoglobin,1989,13:585.
, 百拇医药
2 Efremov D G,Dimovsdi A J,Jankovic L,et al.Mutant Oligonucleotide extension amplification:a nonlabeling polymerase-chain-reaction-based assay for the detection of point mutations.Acta Haemotol,1991,85:66.
3 刘敬忠，刘英姿，施贻君，等。从微量末梢血直接进行β-珠蛋白mRNA的逆转录，扩增及基因扩增。高技术通讯，1992，10：16.
(收稿：1992-11-17 修回：1993-04-05), 百拇医药
单位：100005北京中国医学科学院基础医学研究所(刘敬忠、王海燕、王立荣、施贻君、吴冠芸)；重庆医科大学(刘辉贤)；宁夏医学科学研究所(刘英姿)；北京市儿童医院(李素霞)
关键词：
中华医学杂志930719 β-地中海贫血(β-地贫)绝大多数是由于β-珠蛋白基因的点突变引起的，运用聚合酶链反应(PCR)结合等位基因特异的寡核苷酸探针斑点杂交技术(ASO)能够比较快速、准确地进行基因及产前诊断〔1〕，但在推广应用中仍存在受放射性同位素的使用等限制及操作不够简便等问题。我们综合了MOEA〔2〕4个引物的PCR以及套层PCR(nested PCR)等新进展，设计的引物包括所有已知的引起中国人β-地贫的十几种突变位点，使用6种不同的引物组合进行MOEA及4引物的PCR。在检出突变的同时，还能区分杂合子与纯合子。50μl1.5kb扩增产物足够进行100至万余次检测突变，并利用该项新技术完成了13例个体的基因诊断和1例产前诊断。
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一、材料与方法
1.引物设计与合成：本研究使用的正常引物与突变引物序列均为自行设计，突变碱基，有的安排在3’末端，有的安排在引物中央。引物由中国科学院微生物研究所ABI合成仪合成，脱盐后使用于PCR。
2.病例选择：本研究中β-地贫基因携带者及患者来源于四川、广西，其中部分样品的基因突变类型已经PCR/ASO技术鉴定〔1〕。
3.从1.5μl末梢血用引物108’，D’直接扩增1.5kb片段的方法见文献〔3〕。
4.MOEA：首次由Efremov等〔2〕报道，检测各种突变的MOEA法，均使用两个正常引物和1个突变引物，根据MOEA基本原理，被测样品如果没有与突变引物一致的基因突变时，可获由两个正常引物引导产生的较长扩增带；如系该突变纯合子，则可获由突变引物与反方向正常引物产生的较短扩增片段；如系杂合子，则为一长一短两条扩增带，反应总体系25μl。MOEA一般是在适当退火温度下保持45s；70℃为lmin；93℃为30s，共进行30次循环，最后一次70℃保持5min。取10μl产物用2%琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色，UV灯下观察或照相记录。
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5.4引物的PCR：针对654T合成一个正常引物，一个突变引物。654位正常的C及突变的A(反意链上)均在引物中部，被测DNA如果没有654T，应显示由P654A’和D-2产生的233bp带；如果为654T纯合子，则显示由P654T’和C’产生的206bp带；如果为其杂合子，则显示206和233bp两条区带。
二、结果
从1.5μl末梢血直接扩增1.5kb片段，图1所示为引物108’和D’以及直接用5个自愿受试者末梢血和一份基因组DNA作模板的PCR结果，用这种PCR产物混合物的适当稀释液作模板进行各种MOEA或4引物PCR。本研究用6种引物组合检测了我国最常见的6种基因突变样品，所观察到的扩增产物图谱均与预期的完全一致，不但可检测突变存在与否，而且可区分杂合子与纯合子。
1～5∶5个自愿供试者；6：以基因组DNA(0.5μg)作模板；M：pBR322 DNA-Bst NI酶解物
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图1 1.5μl全血直接扩增人β珠蛋白1.5kb片段的1%琼脂糖凝胶电泳图。引物为108’和D
41-42T是在我国发生率最高的一种突变。图2所示为用14mer的P41-42T’及108’、B’进行MOEA的电泳结果。两个41-42T纯合子只显示451bp带，杂合子显示451bp和603bp两条带，已知没有41-42T的样品只有603bp带，显示了很好的特异性。
HO：41-42T钝合子；He:41-42T杂合子；no：无41-42T突变的样品；
M:pBR322D NA-Msp NI酶解物
图2 检测41-42T的MOEA产物电泳分离图。引物用108’/B’
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P41-42T’(14mer)，模板用扩增的1.5kb片段
17T是广西、四川及贵州等省仅次于41-42T的发生率很高的突变，从图3可见，在图2的实验条件下，用P17T、108及B’进行的MOEA能很好的区分无17T的样品及其杂合子，纯合子。
HO，He,no分别表示17T的纯合子，杂合子，无17T的样品。M:pBR322DNA-MspNI酶解物
图3 检测17T的MOEA产物电泳分离图，引物108’，B’，P17T’，退火温度56℃
654T是中南、东南地区几乎与41-42T一样高发的突变，曾使用引物C’、D’及P654T(19mer)的MOEA检测654T取得成功；但实验的重复性欠佳。又合成了较短的突变引物P654T’(16mer)，仍未取得满意的重复性。设计合成了P654A’，用上述4个引物进行PCR，如图4所示，取得了理想的且重复性很好的结果。
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HO、He、no：654T纯合子、杂合子及无654T的样品；M:pBR322DNA-MspNI酶解物
图4 检测654T的4引物PCR产物电泳分离图，引物C’，D’，P654A’，P654T’，退火温度为45℃
检测-28T、26T及71-72T的MOEA也都取得了满意的结果。此外，我们利用本方法完成了13例个体的基因诊断及1例产前诊断。
三、讨论
MOEA以及4个引物的PCR技术，使用3个或4个引物于一个PCR反应，不但可检出有无与突变引物对应的突变，而且可以同时显示是纯合子还是杂合子。因此用这两种PCR检测基因突变的技术较其他方法都简便易行，适合于推广。本研究通过大量实验，研究了影响MOEA特异性的各种因素，找到了检测每种突变的最佳反应条件。这些因素主要包括：退火温度一般高出突变引物的Tm值2～5℃；同方向正常引物的浓度低于突变引物浓度数倍；突变引物浓度也需要认真选择；模板用量太大时，MOEA将有明显非特异产物；循环数通常控制在30个。观察了二甲基亚砜(DMSO)及二甲基甲酰胺对MOEA特异性的影响，均没有得到增强MOEA检测基因突变特异性的效果。在保证扩增效率的前提下，使用较低浓度的Mg2+，较短的突变引物(14-16mer)显示更好的特异性，又节省；因此本研究中有8个突变引物采用了这种短的设计，突变碱基安排在引物3’末端上或中央，均取得较好效果。71-72T是在编码子71与72之间插入一个A引起框架位移，我们设计了4种不同的突变引物，分别将插入的A安排在倒数第1、2、3、4位，效果仍以安排在倒数第一位最好。此外，TaqDNA聚合每用量不宜过大等。
, 百拇医药
本研究首先从微量末梢血(或基因组DNA)扩增1.5kb片段，然后以后者为MOEA的模板，这样既可省去基因组DNA之抽提，又吸取了套层PCR的优点；并可使用更短的突变引物，提高了MOEA反应的特异性，经简便的操作程序(PCR+微型凝胶电泳)便可成功地进行6种β-地贫突变的检测(这6种突变占我国南方全部β-地贫突变的90-96%)。因此该技术有着重要的推广应用价值。
广西医学院儿科龙桂芳教授及重庆医科大学张 锦教授提供部分DNA样品。特此致谢
参考文献
1 Liu JZ,Gao QS,Jiang Z,et al.Studies of beta-thalassemia mutations in families living in three provinces in southern China.Hemoglobin,1989,13:585.
, 百拇医药
2 Efremov D G,Dimovsdi A J,Jankovic L,et al.Mutant Oligonucleotide extension amplification:a nonlabeling polymerase-chain-reaction-based assay for the detection of point mutations.Acta Haemotol,1991,85:66.
3 刘敬忠，刘英姿，施贻君，等。从微量末梢血直接进行β-珠蛋白mRNA的逆转录，扩增及基因扩增。高技术通讯，1992，10：16.
(收稿：1992-11-17 修回：1993-04-05), 百拇医药