阿霉素及顺铂耐药瘤株三种癌基因表达的研究
作者：刘岳彪 陈亚军 尹 勇 卢淑娟 吴德政
单位：100039 北京北太平路医院临床药理室
关键词：阿霉素；顺铂；致癌基因
中华医学杂志930913 摘要 应用分子生物学方法对两株耐药瘤株 P388/ADR，L1210/顺铂进行三种癌基因(C-myc，v-erb-B，N-ras)表达的研究表明：P388/ADR的耐药瘤株比敏感株C-myc、v-erb-B、N-ras癌基因扩增分别减少25%、41%、26%(耐44.5倍)和54%、50%、46%(耐23.6倍)。顺铂耐药株比敏感株扩增减少49%、52%及56%，Southern 杂交未见耐药瘤株明显扩增变化。提示多药耐药细胞中耐药性强，肿瘤的潜在增殖和预后均朝不良方向发展。
癌基因是细胞能导致癌变的一类基因，它是从相应的正常结构基因即原癌基因(proto-oncogene)转化而来。研究表明：C-myc、v-erb-B、N-ras 在多种肿瘤中扩增和表达增高〔1，2〕。肿瘤在化疗过程中，细胞被杀灭或抑制，它的癌基因是否也有改变，产生耐药后，由于耐药细胞内一系列的生化改变，癌基因的扩增是否也有改变。国外亦少见报道。本研究应用基因杂交方法对两株抗药株进行了三种癌基因的扩增分析，为临床化疗提供基础材料。
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材料和方法
一、材料
1.试剂：Tris、EDTA、甲酰胺、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、牛奶腺白蛋白(BSA)、聚蔗糖(Ficoll-400)、十二烷基肌氨酸钠(N-lauroyl sarcosine-Na)、二硫苏糖醇(DTT)购自中国科学院百泰公司；硝酸纤维素膜(NC膜)、蛋白酶K(PK)、λ-Hind Ⅲ、鲑鱼精子DNA(ss sDNA)、Hind Ⅲ、RNase购自 Sigma 公司；随机引物标记盒购自 Promega 公司；X线胶片为天津医用材料厂产品。
2.仪器：图像仪 Combridge instruments Quantimet970为本院仪器中心提供。
3.同位素标记化合物：α- 32P-dCTP 为北京福瑞公司产品。
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4.动物及细胞：DBA 小鼠雌雄兼用，体重 20±2g，由本院动物中心提供。P388 小鼠腹水瘤，由本室传代培养，P388/ADR 耐药株由作者诱导培养16个月，抗药 44.5 倍，L1210、L1210/顺铂耐药株，由本室诱导培养，抗药 3.5 倍。
5.药品：阿霉素(ADR)为汕头特区沱滨制药厂产品。顺铂(DDP)为云南个旧生物制药厂(昆明贵重金属研究所研制)产品。
6.探针：C-myc、v-erb-B及N-ras三种癌基因购自 Sigma 公司。β-actin 探针由本院基础所赠送，为细胞骨架蛋白基因，590bp，作为定量内标参照探针。
二、方法
1.DNA制备：按文献[3]方法。
2.探针制备：按随机引物标记盒说明进行。
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3.点杂交：按文献[3]方法。
4.Southern 印迹杂交：按文献[3]方法进行。
5.图像分析：已杂交的X线片置图像仪测各杂交点的积分吸光度(光密度，OD)，将该样品的癌基因杂交相对量与β-actin 杂交的量得一比值，进行比较和分析。
结 果
一、耐药株三种癌基因点杂交及β-actin杂交
用真核 DNA 提取法提取耐药株细胞 DNA，定量，并测吸光度 260/280比值，结果均大于1.8，说明 DNA 符合要求，取各样品10μg，95℃，变性 10min，冰浴 5min 直接点在 NC 膜上，与探针杂交，以同样方法和等量样品与β-actin 探针杂交，结果见图1～3，P388/ADR 耐药株C-myc、v-erb-B、N-ras 三种癌基因扩增分别比敏感株减少25%、41%和26%(耐药 44.4 倍)和54%、50%和46%(耐药 23.6 倍)。顺铂耐药株上述三种癌基因扩增比敏感株减少49%、52%和56%。
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a为样品与N-ras杂交， al～3分别为 A1、F1、F2、a4为 S180 细胞，a5为k562细胞，a6、7为L1，LR；b为各对应样品的β-actin 杂交
图1 样品DNA10μg与N-ras，β-actin 的点杂交
a为样品与 v-erbB 杂交， al～3分别为 A1、F1、F2、a4，5为各L1，LR；
b为各对应样品的β-actin 杂交
图2 样品DNA15μg与 v-erbB，β-actin的点杂交
a为样品与C-myc杂交，al～3分别为为 A1、F1、F2、a4～6为L1，LR；
, 百拇医药
b为各对应样品的β-actin杂交
图3 样品DNA10μg与C-myc，β-actin 的点杂交
二、耐药株三种癌基因的 Southern 杂交
取纯化及吸光度 260/280 比值符合要求的耐药株及敏感株的 NDA，20μg，经 Hind Ⅲ酶切后，在0.8%琼脂糖凝胶电泳，并按 Southern 方法转移至 NC 膜，杂交后放射自显影，结果见图4～6。
1～6，分别为人正常淋巴细胞，L1、LR、A1、F1、F2，7,8为胃正常组织及胃癌
图4 样品 DNA10μg经Hind Ⅲ酶切后与 N-ras 癌基因的 Southern
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杂交可见此例胃癌有N-ras基因扩增；抗药株的 N-ras 基因扩增降低
1,2为L1,LR,3～5为A1、F1、F2,6,7为胃正常组织及胃癌
图5 样品 DNA10μg经HindⅢ酶切后与v-erbB的癌基因 Southern 杂交.
抗药株的基因扩增降低
1～4，分别为K562细胞、A1、F1、F2
图6 样品 DNA10μg经HindⅢ酶切后与C-myc癌基因的 Southern 杂交.
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抗药株的基因扩增降低
讨 论
在正常情况下，一定基因扩增与许多细胞对环境因素应激性有关〔4〕，一些肿瘤细胞中常常存在特定的癌基因扩增，一些化学致癌物能激活癌基因，而一些抗癌药物则能抑制癌基因的表达，Coppola等〔5〕用细胞分化诱导剂DMSO处理小鼠红白血病细胞(mouse erythroleukaemia cell, MELC)时，C-myc RNA 水平在2小时内显著下降，经24小时后又恢复至正常。有人用PKOneo 质粒和包含谷胱甘肽 S-转移酶(glutathione-S-transferase，GSTπ)与β-actin 基因启动子的C-H-ras转导细胞 NIH-3T3，通过 Northern 和 Southern 分析表明：GSTπ转导细胞株与 ADR 耐药有关，能保护细胞免受 ADR 和 ethacrynic 的毒性，但对烷化剂和顺铂敏感〔6〕，fos、jun等癌基因参与 GSTπ 的启动子也得到同样结果〔7〕，其癌基因的变化与 GSTπ 的变化互不相关。我们用基因杂交检测耐药细胞内的癌基因扩增变化，研究表明：P388/ADR耐药株比敏感株细胞三种癌基因扩增均减少，而耐药倍数高比耐药倍数低的抗药株扩增增加，表明耐药倍数越高肿瘤的潜在增殖(C-myc)与预后(ras)朝不良方向发展，这与化疗失败亦有一定关系。耐药细胞比敏感细胞的癌基因扩增减少，其原因：(1)药物对细胞作用后细胞增殖减慢；(2)细胞对药物的应激反应使癌基因的扩增发生改变；(3)药物与相关癌基因的DNA交链影响癌基因的扩增与表达；(4)耐药倍数高比耐药倍数低的抗药株扩增增加，可能是DNA的修复机制增强，药物对细胞的影响减少，从而对癌基因的影响也减少。此外，可能癌细胞在抗药产生的初期阶段癌基因被抑制较多，当耐药性增强，癌基因渐渐摆脱被抑制状态。采用分子生物学方法，研究药物对相关基因的影响对药理研究具有较大意义。
, 百拇医药
参考文献
1 Collins S,Groudine M.Amplification of endogenous mycrelated DNA sequences in a human myeloid leukaemia cell line.Nature,1982,298∶679.
2 Slamon D J,Clark G M,Wong S G,et al.Human brest cancer:correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene.Science,1987,235∶177.
3 戴维斯编著.姚志建，沈倍奋，刘亚霞译.分子生物学研究技术.北京：科学技术出版社，1990∶24-53.
4 Pohjanpelto P,Holtta E,Janne O A,et al.Amplification of ornithine decarboxylase gene in response to polyamine deprivation in Chinese hamster ovary cell. J Biol Chem,1985,260∶8532.
, 百拇医药
5 Coppola J A,Coll M D.Constitutive c-myc oncogene expression blocks mouse erythroleukaemia cell differentiation but not commitment.Nature,1986,320∶760.
6 Nakagawa K,Saijo N,Tsuchida S,et al.Glutathione-S-transferase pi as a determinant of drug resistance in transfectant cell lines.J Biol Chem,1990,265∶4296.
7 Morrow C S,Goldsmith M E,Cowan K H,et al.Regulation of human glutathione S-transferase pi gene transcription:influence of 5′-flanking sequences and trans-ac-tivating factors which recognize AP-1-binding sites.Gene,1990,88∶215.
(收稿：1992-11-20 修回：1993-05.03), 百拇医药
单位：100039 北京北太平路医院临床药理室
关键词：阿霉素；顺铂；致癌基因
中华医学杂志930913 摘要 应用分子生物学方法对两株耐药瘤株 P388/ADR，L1210/顺铂进行三种癌基因(C-myc，v-erb-B，N-ras)表达的研究表明：P388/ADR的耐药瘤株比敏感株C-myc、v-erb-B、N-ras癌基因扩增分别减少25%、41%、26%(耐44.5倍)和54%、50%、46%(耐23.6倍)。顺铂耐药株比敏感株扩增减少49%、52%及56%，Southern 杂交未见耐药瘤株明显扩增变化。提示多药耐药细胞中耐药性强，肿瘤的潜在增殖和预后均朝不良方向发展。
癌基因是细胞能导致癌变的一类基因，它是从相应的正常结构基因即原癌基因(proto-oncogene)转化而来。研究表明：C-myc、v-erb-B、N-ras 在多种肿瘤中扩增和表达增高〔1，2〕。肿瘤在化疗过程中，细胞被杀灭或抑制，它的癌基因是否也有改变，产生耐药后，由于耐药细胞内一系列的生化改变，癌基因的扩增是否也有改变。国外亦少见报道。本研究应用基因杂交方法对两株抗药株进行了三种癌基因的扩增分析，为临床化疗提供基础材料。
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材料和方法
一、材料
1.试剂：Tris、EDTA、甲酰胺、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、牛奶腺白蛋白(BSA)、聚蔗糖(Ficoll-400)、十二烷基肌氨酸钠(N-lauroyl sarcosine-Na)、二硫苏糖醇(DTT)购自中国科学院百泰公司；硝酸纤维素膜(NC膜)、蛋白酶K(PK)、λ-Hind Ⅲ、鲑鱼精子DNA(ss sDNA)、Hind Ⅲ、RNase购自 Sigma 公司；随机引物标记盒购自 Promega 公司；X线胶片为天津医用材料厂产品。
2.仪器：图像仪 Combridge instruments Quantimet970为本院仪器中心提供。
3.同位素标记化合物：α- 32P-dCTP 为北京福瑞公司产品。
, 百拇医药
4.动物及细胞：DBA 小鼠雌雄兼用，体重 20±2g，由本院动物中心提供。P388 小鼠腹水瘤，由本室传代培养，P388/ADR 耐药株由作者诱导培养16个月，抗药 44.5 倍，L1210、L1210/顺铂耐药株，由本室诱导培养，抗药 3.5 倍。
5.药品：阿霉素(ADR)为汕头特区沱滨制药厂产品。顺铂(DDP)为云南个旧生物制药厂(昆明贵重金属研究所研制)产品。
6.探针：C-myc、v-erb-B及N-ras三种癌基因购自 Sigma 公司。β-actin 探针由本院基础所赠送，为细胞骨架蛋白基因，590bp，作为定量内标参照探针。
二、方法
1.DNA制备：按文献[3]方法。
2.探针制备：按随机引物标记盒说明进行。
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3.点杂交：按文献[3]方法。
4.Southern 印迹杂交：按文献[3]方法进行。
5.图像分析：已杂交的X线片置图像仪测各杂交点的积分吸光度(光密度，OD)，将该样品的癌基因杂交相对量与β-actin 杂交的量得一比值，进行比较和分析。
结 果
一、耐药株三种癌基因点杂交及β-actin杂交
用真核 DNA 提取法提取耐药株细胞 DNA，定量，并测吸光度 260/280比值，结果均大于1.8，说明 DNA 符合要求，取各样品10μg，95℃，变性 10min，冰浴 5min 直接点在 NC 膜上，与探针杂交，以同样方法和等量样品与β-actin 探针杂交，结果见图1～3，P388/ADR 耐药株C-myc、v-erb-B、N-ras 三种癌基因扩增分别比敏感株减少25%、41%和26%(耐药 44.4 倍)和54%、50%和46%(耐药 23.6 倍)。顺铂耐药株上述三种癌基因扩增比敏感株减少49%、52%和56%。
, 百拇医药
a为样品与N-ras杂交， al～3分别为 A1、F1、F2、a4为 S180 细胞，a5为k562细胞，a6、7为L1，LR；b为各对应样品的β-actin 杂交
图1 样品DNA10μg与N-ras，β-actin 的点杂交
a为样品与 v-erbB 杂交， al～3分别为 A1、F1、F2、a4，5为各L1，LR；
b为各对应样品的β-actin 杂交
图2 样品DNA15μg与 v-erbB，β-actin的点杂交
a为样品与C-myc杂交，al～3分别为为 A1、F1、F2、a4～6为L1，LR；
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b为各对应样品的β-actin杂交
图3 样品DNA10μg与C-myc，β-actin 的点杂交
二、耐药株三种癌基因的 Southern 杂交
取纯化及吸光度 260/280 比值符合要求的耐药株及敏感株的 NDA，20μg，经 Hind Ⅲ酶切后，在0.8%琼脂糖凝胶电泳，并按 Southern 方法转移至 NC 膜，杂交后放射自显影，结果见图4～6。
1～6，分别为人正常淋巴细胞，L1、LR、A1、F1、F2，7,8为胃正常组织及胃癌
图4 样品 DNA10μg经Hind Ⅲ酶切后与 N-ras 癌基因的 Southern
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杂交可见此例胃癌有N-ras基因扩增；抗药株的 N-ras 基因扩增降低
1,2为L1,LR,3～5为A1、F1、F2,6,7为胃正常组织及胃癌
图5 样品 DNA10μg经HindⅢ酶切后与v-erbB的癌基因 Southern 杂交.
抗药株的基因扩增降低
1～4，分别为K562细胞、A1、F1、F2
图6 样品 DNA10μg经HindⅢ酶切后与C-myc癌基因的 Southern 杂交.
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抗药株的基因扩增降低
讨 论
在正常情况下，一定基因扩增与许多细胞对环境因素应激性有关〔4〕，一些肿瘤细胞中常常存在特定的癌基因扩增，一些化学致癌物能激活癌基因，而一些抗癌药物则能抑制癌基因的表达，Coppola等〔5〕用细胞分化诱导剂DMSO处理小鼠红白血病细胞(mouse erythroleukaemia cell, MELC)时，C-myc RNA 水平在2小时内显著下降，经24小时后又恢复至正常。有人用PKOneo 质粒和包含谷胱甘肽 S-转移酶(glutathione-S-transferase，GSTπ)与β-actin 基因启动子的C-H-ras转导细胞 NIH-3T3，通过 Northern 和 Southern 分析表明：GSTπ转导细胞株与 ADR 耐药有关，能保护细胞免受 ADR 和 ethacrynic 的毒性，但对烷化剂和顺铂敏感〔6〕，fos、jun等癌基因参与 GSTπ 的启动子也得到同样结果〔7〕，其癌基因的变化与 GSTπ 的变化互不相关。我们用基因杂交检测耐药细胞内的癌基因扩增变化，研究表明：P388/ADR耐药株比敏感株细胞三种癌基因扩增均减少，而耐药倍数高比耐药倍数低的抗药株扩增增加，表明耐药倍数越高肿瘤的潜在增殖(C-myc)与预后(ras)朝不良方向发展，这与化疗失败亦有一定关系。耐药细胞比敏感细胞的癌基因扩增减少，其原因：(1)药物对细胞作用后细胞增殖减慢；(2)细胞对药物的应激反应使癌基因的扩增发生改变；(3)药物与相关癌基因的DNA交链影响癌基因的扩增与表达；(4)耐药倍数高比耐药倍数低的抗药株扩增增加，可能是DNA的修复机制增强，药物对细胞的影响减少，从而对癌基因的影响也减少。此外，可能癌细胞在抗药产生的初期阶段癌基因被抑制较多，当耐药性增强，癌基因渐渐摆脱被抑制状态。采用分子生物学方法，研究药物对相关基因的影响对药理研究具有较大意义。
, 百拇医药
参考文献
1 Collins S,Groudine M.Amplification of endogenous mycrelated DNA sequences in a human myeloid leukaemia cell line.Nature,1982,298∶679.
2 Slamon D J,Clark G M,Wong S G,et al.Human brest cancer:correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene.Science,1987,235∶177.
3 戴维斯编著.姚志建，沈倍奋，刘亚霞译.分子生物学研究技术.北京：科学技术出版社，1990∶24-53.
4 Pohjanpelto P,Holtta E,Janne O A,et al.Amplification of ornithine decarboxylase gene in response to polyamine deprivation in Chinese hamster ovary cell. J Biol Chem,1985,260∶8532.
, 百拇医药
5 Coppola J A,Coll M D.Constitutive c-myc oncogene expression blocks mouse erythroleukaemia cell differentiation but not commitment.Nature,1986,320∶760.
6 Nakagawa K,Saijo N,Tsuchida S,et al.Glutathione-S-transferase pi as a determinant of drug resistance in transfectant cell lines.J Biol Chem,1990,265∶4296.
7 Morrow C S,Goldsmith M E,Cowan K H,et al.Regulation of human glutathione S-transferase pi gene transcription:influence of 5′-flanking sequences and trans-ac-tivating factors which recognize AP-1-binding sites.Gene,1990,88∶215.
(收稿：1992-11-20 修回：1993-05.03), 百拇医药