逆转录聚合酶链反应快速诊断登革病毒感染及型别鉴定
作者：李 刚 王 飞 郭日波 柯伟民 罗慧容 瘳育煌
单位：510630广州，中山医科大学传染病学教研室(李 刚、王 飞、郭日波及柯伟民)，广州市卫生防疫站(罗慧容、廖育煌)
关键词：登革热病毒；核糖核酸；聚合酶链反应；诊断，鉴别
中华医学杂志931010 摘要 应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增登革病毒4个血清型的E基因部分片段。共设计寡核苷酸引物6个，其中1个为登革Ⅰ、Ⅱ型共有，1个为登革Ⅲ、Ⅳ型共有，其余4个分别为4个血清型特异。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型的扩增产物分别为240bp、150bp、333bp、421bp，经2%琼脂糖电泳即可区分。产物经酶切试验鉴定为预定片段。对一系列稀释的培养液进行检测，证明RT-PCR可测出少至5个半数组织培养感染量(TCID50)的病毒RNA。应用RT-PCR检测60份登革热病人急性期血清，结果显示其敏感性明显高于病毒分离，特异性则与病毒分离及免疫荧光分型的结果一致，这一方法可用于早期快速诊断登革病毒感染及型别鉴定。
, 百拇医药
登革热在热带和亚热带地区已成为重要的公共卫生问题，在我国部分地区也反复流行。登革出血热和登革休克综合征的发病率及死亡率有上升趋势。目前，登革热的实验室诊断依靠抗体或病毒分离。由于黄热病毒中广泛的交叉反应及登革病毒四种血清型的存在，使得用血清学方法作病原学鉴定非常困难。病毒分离及随后的免疫荧光试验可进行血清型别诊断，但因其敏感性不高、工作量大、需时2周以上等而具有局限性[1]。
登革病毒基因组为单股正链RNA，4个血清型多个株的核苷酸疗列已弄清。最近，使病毒核酸有百万倍扩增的聚合酶链反应(PCR)已用来快速诊断病毒性疾病，国内外有学者采用PCR技术研究登革病毒[2～4]。我们在建立将登革病毒RNA逆转录(RT)为cDNA再进行PCR方法的基础上，对登革病毒的4个血清型作了系统的研究。
材料和方法
1.病毒及细胞：登革病毒标准株Ⅰ型(Hawaii)、Ⅱ型(New Guinea)、Ⅲ型(H87)、Ⅳ型(H-241)及乙脑病毒P3株分别感染C6/36细胞单层，细胞病变达～时收集培养液。在C6/36细胞中滴定半数组织培养感染量(TCID50)，-20℃保存。
, 百拇医药
2.血清标本：Ⅱ型血清采自海南省琼山县1988年8月登革热流行的病人，24份中有10份病毒分离阳性。Ⅰ型血清采自广州地区1991年9～10月登革热流行的病人，20份中有11份病毒分离阳性。Ⅳ型血清采自广州地区1990年9～11月登革热流行的病人，16份有6份病毒分离阳性。所有血清在发病5天内采得，-20℃以下保存。
3.试剂：RNasin，AMV逆转录酶，DNA分子量标准，dNTP，HindⅢ等购自华美公司。蛋白酶K由德国Merck公司提供。taqDNA聚合酶购自复旦大学遗传研究所。6个引物由上海细胞生物学研究所合成，引物所在位置及序列见表1。
表1 引物位置及序列 引物
位置
序列(5′→3′)
产物片段(bp)
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HindⅢ位点
D1(+)
1318-1336
TTCAGTGATAGTCACCGTA
240
D1(+)
1537-1557
GGTAGGTCTAGGAACCATTGT
D2(+)
1437-1458
GAGTTCCATCACAGAAGCAGAA
, 百拇医药
150
AAGCTT
D2(-)
1566-1586
GGTAGGTCTAGGAACCATTGT
1547 1552
D3(+)
1139-1158
ACAACCGACTCAAGATGTCC
333
AAGCTT
D3(-)
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1453-1471
GAGGGTTCCATATTCAGGT
1267 1272
D4(+)
1143-1162
ACAACCGACTCAAGATGTCC
421
D4(-)
1545-1563
GCACGAGCCATGTTTTCTT
* D1(-)序列同D2(-).D3(+)序列同D4(+)
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4.病毒RNA的提取[5]：病毒培养液或血清100μl加入十烷基硫酸钠、蛋白酶K在56℃消化1小时。加入二巯基乙醇后常规酚、氯仿抽提3次，上清在无水乙醇及醋酸钠中-20℃沉淀12小时，10000r/min离心20分钟，例去液体后抽干，加20μl双蒸水溶解。
5.cDNA合成：反应混合物含：RNA5μl(相当于25μl培养液或100μl血清中的RNA量)，0.5mmol/L三磷酸脱氧核苷酸5μl，核糖核酸酶抑制素(RNasin)40单位，AMV逆转录酶10单位，3个负链引物保500ng，缓冲液50μl，加双蒸水至总体积10μl，42℃反应1.5小时。
6.cDNA扩增：反应混合物含：上述混合液10μl(内含cDNA)，0.5mmol/L三磷酸脱氧核苷酸5μl，3个负链引物各100ng，3个正链引物各500ng，5×缓冲液10μl，加双蒸水至总体积50μl。95℃10分钟，加入Taq聚合酶2单位，在55℃1分钟、70℃1分钟、92℃30秒循环30次，最后在72℃反应10分钟。
, 百拇医药
7.酶切：ⅡⅢ型登革病毒的扩增产物经常规酚、氯仿、乙醚抽提后沉淀、溶解。用Hind Ⅲ在37℃消化1小时。
8.产物分析：取10μlPCR产物或酶切后产物在含溴化乙锭的2%琼脂糖中电泳，DNA分子量标准作标志物，在紫外灯下观察、拍照。
结果
1.扩增产物及酶切结果：登革Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型病毒核酸经RT-PCR扩增后出现分子量不同的条带，分别约240bp、150bp、333bp、和421bp，与设计的产物大小相等(图1)。Ⅱ型产物经酶切后仅出现一条带，约111bp，另一片段因碱基对少未显示出来，Ⅲ型产物酶切后出现两个片段，分别约131bp和202bp(图2，3)。酶切结果与设计相符。
图1 扩增产物。RT-PCR扩增登革病毒Ⅰ(1)，Ⅱ(2)，Ⅲ(3)，Ⅳ(4)型核酸，片段长度分别为240bp、150bp、333bp、421bp，M：DNA分子量标准
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图2 产物鉴定。M：DNA分子量标准：1.产物经HindⅢ型切后的片断；2.登革Ⅰ型扩增产物
图3 产物鉴定。M：DNA分子量标准；1.革登Ⅲ型扩增产物；2.产物经HindⅢ酶切后的片断
2.特异性：各型经扩增后仅出现型特异的条带，各型间无交叉扩增现象。同样方法对乙脑病毒培养注、C6/36细胞及正常人血清进行扩增，未出现条带。
3.敏感性：将已滴定TCID50Ⅱ的病毒培养液按10倍系列稀释至10-5，甚至2.5×10-6时仍可出现的特异性条带(图4)。经折算，RT-PCR可测出少至5TCID50的病毒RNA。对各型的敏感性基本相同。
, 百拇医药
图4 RT-PCR检测登革病毒的敏感性。M：DNA分子量标准：登革Ⅱ型病毒培养上清经1倍(1)、10倍(2)、102倍(3)、103倍(4)、104倍(5)、105倍(6)、4×105倍(7)稀释后的扩增产物
4.血清检测：对Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型登革热患者急性期血清60份作RT-PCR，结果显示病毒分离阳性者RT-PCR均阳性。病毒分离阴性的同期血清，有很大一部分RT-PCR阳性(表2)。两种方法经统计学处理差异有显著意义。
表2 与病毒分离检测登革热病人血清标本的敏感性比较(例数 检测方法
阳性血清型
阴性血清型
Ⅰ
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Ⅱ
Ⅲ
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
病毒分离
11/20
10/24
6/16
9/20
14/24
10/16
RT-PCR
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17/20
20/24
12/16
3/20
4/24
4/16
5.重复性：对病毒分离性血清重复一次，所得结果相同。
讨 论
我们按照计算机引物设计程序、输入登革病毒Ⅰ[6]、Ⅱ[7，8]、Ⅲ[9]、Ⅳ[10]型多个株，黄热病毒，乙脑病毒，Murray Valley脑炎病毒，蜱传脑炎病毒及丙型肝炎病毒2个株的核苷酸序列，进行比较分析，选出型特异的、保守的序列作为引物。6个引物均位于E基因区，因为E基因的核苷酸序列研究较多，保守性好，有重要的生物学活性。另外，登革病毒4个血清型的核苷酸序列同源性较大[11]，易于找到序列相同的寡核苷酸。我们设计的Ⅰ、Ⅱ型负链引物相同，Ⅲ、Ⅳ型的正链引物相。4个型的扩增产物分别为240bp、150bp、333bp、421bp，在2%琼脂糖电泳中可明显区分开来。Ⅱ、Ⅲ型产物内各有一酶切点，Ⅱ型酶切后有111bp和39bp两片段，Ⅲ型则为131bp和202bp两个片段，用于鉴定扩增产物是否为预定产物。实验证明，此设计不影响RT-PCR的特异性和敏感性，而在临床应用时则更经济，更方便实用。在早期快速诊断的同时可鉴定型别。
, 百拇医药
PCR技术应用于检测登革病毒的研究由法国的Deubel等[2]开始。他采用四对引物分别扩增4型登革病毒，扩增产物分子量大小相似，鉴定血清型需进行核酸杂交。随后Henchal等[3]采用NS1区的一对通用引物，扩增的4型产物分子量相同，分型依靠核酸杂交。我们则采用公共与特异引物相结合，扩增的4型产物分子量互不相同，一般琼脂电泳即可鉴别，无需再作核酸杂交分型。
检测中所作血清采用1988～1991年，由于保存良好，至今仍可检出病毒的RNA，故本方法可用于流行病学回顾调查。
RT-PCR不仅具有高度的特异性和敏感性，而且在2天内可出结果，所用血清量少，无需双份，方法简单，可快速分型，为登革热的临床和流行病学诊断提供了一种有效手段。
参考文献
1 Halstead SB. Pathogenesis of dengue:challenges to molecular biology. Science, 1988,239:476.
, http://www.100md.com
2 Deuble V, Laille M, Hugnot JP, et al. Identification of dengue sequences by genomic amplification :raqid diagnosis of dengue virus serotypes in peripheral bolld. J Virol Meth, 1990,30:41.
3 Henchal EA, Polo S, Vorndam V, et al. Sensitivity and specificity of a universal primer set for the rapid diagnosis of dengue virus inrections by polymerase chain reaction and nucleic acid hybridization. Am J Trop Med Hyg, 1991,45:418.
4 秦鄂德，杨佩英，徐品芳，等.登革病毒基因组逆转录及其cDNA扩增的研究.中华微生物学和免疫学杂志，1991，11：324.
, 百拇医药
5 Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J, et al. Molecular cloning. A laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor 1989: 7.3-7.36.
6 Mason PW, Mcada PC, Mason TL, et al.Sequence of the dengue 1 virus genome in the region encoding the three structural proteins and the major nonstructural protein NS1. Virology, 1987, 161:262.
7 Irie K, Mohan PM, Sasaguri Y, et al. Sequence analysis of cloned dengue virus type 2 genome (New Guinen-Cstrain). Gene, 1989, 75:197.
, 百拇医药
8 Deubel V, Kinney RM, Trent DW. Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the structural proteins of dengue type 2 virus, Jamaica genotype. Virology, 1986, 155:365.
9 Osatomi K, Sumiyoshi H. Complete nucleotide sequence of degue type 3 virus genome RNA. Virology, 1990,176:634.
10 Zhao B, Mackow E, Buckler-White A, et al. Cloning full-length degue type 4 viral DNA sequences: analysis of genes coding for structual proteins. Virology, 1986, 165:77.
11 Hahn YS, Galler R, Hunkqpiller T, et al.Nucleotide sequence of dengue 2 RNA and comparison of the encoded proteins with those of other flaviviruses. Virology, 1988, 162:167.
(收稿：1992-08-31 修回：1993-06-07), 百拇医药
单位：510630广州，中山医科大学传染病学教研室(李 刚、王 飞、郭日波及柯伟民)，广州市卫生防疫站(罗慧容、廖育煌)
关键词：登革热病毒；核糖核酸；聚合酶链反应；诊断，鉴别
中华医学杂志931010 摘要 应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增登革病毒4个血清型的E基因部分片段。共设计寡核苷酸引物6个，其中1个为登革Ⅰ、Ⅱ型共有，1个为登革Ⅲ、Ⅳ型共有，其余4个分别为4个血清型特异。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型的扩增产物分别为240bp、150bp、333bp、421bp，经2%琼脂糖电泳即可区分。产物经酶切试验鉴定为预定片段。对一系列稀释的培养液进行检测，证明RT-PCR可测出少至5个半数组织培养感染量(TCID50)的病毒RNA。应用RT-PCR检测60份登革热病人急性期血清，结果显示其敏感性明显高于病毒分离，特异性则与病毒分离及免疫荧光分型的结果一致，这一方法可用于早期快速诊断登革病毒感染及型别鉴定。
, 百拇医药
登革热在热带和亚热带地区已成为重要的公共卫生问题，在我国部分地区也反复流行。登革出血热和登革休克综合征的发病率及死亡率有上升趋势。目前，登革热的实验室诊断依靠抗体或病毒分离。由于黄热病毒中广泛的交叉反应及登革病毒四种血清型的存在，使得用血清学方法作病原学鉴定非常困难。病毒分离及随后的免疫荧光试验可进行血清型别诊断，但因其敏感性不高、工作量大、需时2周以上等而具有局限性[1]。
登革病毒基因组为单股正链RNA，4个血清型多个株的核苷酸疗列已弄清。最近，使病毒核酸有百万倍扩增的聚合酶链反应(PCR)已用来快速诊断病毒性疾病，国内外有学者采用PCR技术研究登革病毒[2～4]。我们在建立将登革病毒RNA逆转录(RT)为cDNA再进行PCR方法的基础上，对登革病毒的4个血清型作了系统的研究。
材料和方法
1.病毒及细胞：登革病毒标准株Ⅰ型(Hawaii)、Ⅱ型(New Guinea)、Ⅲ型(H87)、Ⅳ型(H-241)及乙脑病毒P3株分别感染C6/36细胞单层，细胞病变达～时收集培养液。在C6/36细胞中滴定半数组织培养感染量(TCID50)，-20℃保存。
, 百拇医药
2.血清标本：Ⅱ型血清采自海南省琼山县1988年8月登革热流行的病人，24份中有10份病毒分离阳性。Ⅰ型血清采自广州地区1991年9～10月登革热流行的病人，20份中有11份病毒分离阳性。Ⅳ型血清采自广州地区1990年9～11月登革热流行的病人，16份有6份病毒分离阳性。所有血清在发病5天内采得，-20℃以下保存。
3.试剂：RNasin，AMV逆转录酶，DNA分子量标准，dNTP，HindⅢ等购自华美公司。蛋白酶K由德国Merck公司提供。taqDNA聚合酶购自复旦大学遗传研究所。6个引物由上海细胞生物学研究所合成，引物所在位置及序列见表1。
表1 引物位置及序列 引物
位置
序列(5′→3′)
产物片段(bp)
, 百拇医药
HindⅢ位点
D1(+)
1318-1336
TTCAGTGATAGTCACCGTA
240
D1(+)
1537-1557
GGTAGGTCTAGGAACCATTGT
D2(+)
1437-1458
GAGTTCCATCACAGAAGCAGAA
, 百拇医药
150
AAGCTT
D2(-)
1566-1586
GGTAGGTCTAGGAACCATTGT
1547 1552
D3(+)
1139-1158
ACAACCGACTCAAGATGTCC
333
AAGCTT
D3(-)
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1453-1471
GAGGGTTCCATATTCAGGT
1267 1272
D4(+)
1143-1162
ACAACCGACTCAAGATGTCC
421
D4(-)
1545-1563
GCACGAGCCATGTTTTCTT
* D1(-)序列同D2(-).D3(+)序列同D4(+)
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4.病毒RNA的提取[5]：病毒培养液或血清100μl加入十烷基硫酸钠、蛋白酶K在56℃消化1小时。加入二巯基乙醇后常规酚、氯仿抽提3次，上清在无水乙醇及醋酸钠中-20℃沉淀12小时，10000r/min离心20分钟，例去液体后抽干，加20μl双蒸水溶解。
5.cDNA合成：反应混合物含：RNA5μl(相当于25μl培养液或100μl血清中的RNA量)，0.5mmol/L三磷酸脱氧核苷酸5μl，核糖核酸酶抑制素(RNasin)40单位，AMV逆转录酶10单位，3个负链引物保500ng，缓冲液50μl，加双蒸水至总体积10μl，42℃反应1.5小时。
6.cDNA扩增：反应混合物含：上述混合液10μl(内含cDNA)，0.5mmol/L三磷酸脱氧核苷酸5μl，3个负链引物各100ng，3个正链引物各500ng，5×缓冲液10μl，加双蒸水至总体积50μl。95℃10分钟，加入Taq聚合酶2单位，在55℃1分钟、70℃1分钟、92℃30秒循环30次，最后在72℃反应10分钟。
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7.酶切：ⅡⅢ型登革病毒的扩增产物经常规酚、氯仿、乙醚抽提后沉淀、溶解。用Hind Ⅲ在37℃消化1小时。
8.产物分析：取10μlPCR产物或酶切后产物在含溴化乙锭的2%琼脂糖中电泳，DNA分子量标准作标志物，在紫外灯下观察、拍照。
结果
1.扩增产物及酶切结果：登革Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型病毒核酸经RT-PCR扩增后出现分子量不同的条带，分别约240bp、150bp、333bp、和421bp，与设计的产物大小相等(图1)。Ⅱ型产物经酶切后仅出现一条带，约111bp，另一片段因碱基对少未显示出来，Ⅲ型产物酶切后出现两个片段，分别约131bp和202bp(图2，3)。酶切结果与设计相符。
图1 扩增产物。RT-PCR扩增登革病毒Ⅰ(1)，Ⅱ(2)，Ⅲ(3)，Ⅳ(4)型核酸，片段长度分别为240bp、150bp、333bp、421bp，M：DNA分子量标准
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图2 产物鉴定。M：DNA分子量标准：1.产物经HindⅢ型切后的片断；2.登革Ⅰ型扩增产物
图3 产物鉴定。M：DNA分子量标准；1.革登Ⅲ型扩增产物；2.产物经HindⅢ酶切后的片断
2.特异性：各型经扩增后仅出现型特异的条带，各型间无交叉扩增现象。同样方法对乙脑病毒培养注、C6/36细胞及正常人血清进行扩增，未出现条带。
3.敏感性：将已滴定TCID50Ⅱ的病毒培养液按10倍系列稀释至10-5，甚至2.5×10-6时仍可出现的特异性条带(图4)。经折算，RT-PCR可测出少至5TCID50的病毒RNA。对各型的敏感性基本相同。
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图4 RT-PCR检测登革病毒的敏感性。M：DNA分子量标准：登革Ⅱ型病毒培养上清经1倍(1)、10倍(2)、102倍(3)、103倍(4)、104倍(5)、105倍(6)、4×105倍(7)稀释后的扩增产物
4.血清检测：对Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型登革热患者急性期血清60份作RT-PCR，结果显示病毒分离阳性者RT-PCR均阳性。病毒分离阴性的同期血清，有很大一部分RT-PCR阳性(表2)。两种方法经统计学处理差异有显著意义。
表2 与病毒分离检测登革热病人血清标本的敏感性比较(例数 检测方法
阳性血清型
阴性血清型
Ⅰ
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Ⅱ
Ⅲ
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
病毒分离
11/20
10/24
6/16
9/20
14/24
10/16
RT-PCR
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17/20
20/24
12/16
3/20
4/24
4/16
5.重复性：对病毒分离性血清重复一次，所得结果相同。
讨 论
我们按照计算机引物设计程序、输入登革病毒Ⅰ[6]、Ⅱ[7，8]、Ⅲ[9]、Ⅳ[10]型多个株，黄热病毒，乙脑病毒，Murray Valley脑炎病毒，蜱传脑炎病毒及丙型肝炎病毒2个株的核苷酸序列，进行比较分析，选出型特异的、保守的序列作为引物。6个引物均位于E基因区，因为E基因的核苷酸序列研究较多，保守性好，有重要的生物学活性。另外，登革病毒4个血清型的核苷酸序列同源性较大[11]，易于找到序列相同的寡核苷酸。我们设计的Ⅰ、Ⅱ型负链引物相同，Ⅲ、Ⅳ型的正链引物相。4个型的扩增产物分别为240bp、150bp、333bp、421bp，在2%琼脂糖电泳中可明显区分开来。Ⅱ、Ⅲ型产物内各有一酶切点，Ⅱ型酶切后有111bp和39bp两片段，Ⅲ型则为131bp和202bp两个片段，用于鉴定扩增产物是否为预定产物。实验证明，此设计不影响RT-PCR的特异性和敏感性，而在临床应用时则更经济，更方便实用。在早期快速诊断的同时可鉴定型别。
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PCR技术应用于检测登革病毒的研究由法国的Deubel等[2]开始。他采用四对引物分别扩增4型登革病毒，扩增产物分子量大小相似，鉴定血清型需进行核酸杂交。随后Henchal等[3]采用NS1区的一对通用引物，扩增的4型产物分子量相同，分型依靠核酸杂交。我们则采用公共与特异引物相结合，扩增的4型产物分子量互不相同，一般琼脂电泳即可鉴别，无需再作核酸杂交分型。
检测中所作血清采用1988～1991年，由于保存良好，至今仍可检出病毒的RNA，故本方法可用于流行病学回顾调查。
RT-PCR不仅具有高度的特异性和敏感性，而且在2天内可出结果，所用血清量少，无需双份，方法简单，可快速分型，为登革热的临床和流行病学诊断提供了一种有效手段。
参考文献
1 Halstead SB. Pathogenesis of dengue:challenges to molecular biology. Science, 1988,239:476.
, http://www.100md.com
2 Deuble V, Laille M, Hugnot JP, et al. Identification of dengue sequences by genomic amplification :raqid diagnosis of dengue virus serotypes in peripheral bolld. J Virol Meth, 1990,30:41.
3 Henchal EA, Polo S, Vorndam V, et al. Sensitivity and specificity of a universal primer set for the rapid diagnosis of dengue virus inrections by polymerase chain reaction and nucleic acid hybridization. Am J Trop Med Hyg, 1991,45:418.
4 秦鄂德，杨佩英，徐品芳，等.登革病毒基因组逆转录及其cDNA扩增的研究.中华微生物学和免疫学杂志，1991，11：324.
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5 Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J, et al. Molecular cloning. A laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor 1989: 7.3-7.36.
6 Mason PW, Mcada PC, Mason TL, et al.Sequence of the dengue 1 virus genome in the region encoding the three structural proteins and the major nonstructural protein NS1. Virology, 1987, 161:262.
7 Irie K, Mohan PM, Sasaguri Y, et al. Sequence analysis of cloned dengue virus type 2 genome (New Guinen-Cstrain). Gene, 1989, 75:197.
, 百拇医药
8 Deubel V, Kinney RM, Trent DW. Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the structural proteins of dengue type 2 virus, Jamaica genotype. Virology, 1986, 155:365.
9 Osatomi K, Sumiyoshi H. Complete nucleotide sequence of degue type 3 virus genome RNA. Virology, 1990,176:634.
10 Zhao B, Mackow E, Buckler-White A, et al. Cloning full-length degue type 4 viral DNA sequences: analysis of genes coding for structual proteins. Virology, 1986, 165:77.
11 Hahn YS, Galler R, Hunkqpiller T, et al.Nucleotide sequence of dengue 2 RNA and comparison of the encoded proteins with those of other flaviviruses. Virology, 1988, 162:167.
(收稿：1992-08-31 修回：1993-06-07), 百拇医药