食管癌标本中人乳头瘤状病毒DNA的研究
作者：陈碧芬 殷 虹
单位：350004福州，福建医学院病理解剖学教研室(陈碧芬)；福建省知院(殷 虹)
关键词：食管肿瘤；乳头状瘤病毒；脱氧核糖核酸；聚合酶链反应
中华医学杂志931110 摘要 应用多聚酶链反应(PCR)技术，检测了福建地区40例食管癌标本中乳头瘤状病毒(HPV)DNA的存在及其类型。结果：HPVDNA阳性者占60%(24/40)，24例阳性标本中HPV6型DNA占50%(12/24)，16型DNA占8%(2/24)，6型和16型DNA同时阳性者占17%(4/24)，未知类型者25%(6/24)。2例淋巴结转移癌中也发现与其原发癌一致的HPVDNA类型。27例癌旁粘膜组织中亦见有HPV感染效应，其中以挖空细胞病变具有显著意义(P<0.05)。结果表明在食管癌高发区HPV有较高检出率，它与食管癌的发生有密切关系。
, 百拇医药
食管乳头瘤或食管癌组织中有乳头瘤状病毒(HPV)DNA及其抗原存在〔1～8〕。为进一步探讨HPV与食管癌变的关系，我们对我国南部食管癌高发区——福建地区的食管癌手术标本，应用多聚酶链反应(PCR)及分子杂交技术，检测癌组织中HPVDNA的存在及其基因类型，并观察了HPV感染的癌旁粘膜形态学变化。
材料与方法
一、材料
食管癌手术标本40例，其中男35例，女5例，年龄21～68岁。标本按常规10%甲醛固定、石蜡包埋、切片、病理组织学观察。大体类型：溃疡型17例，浸润型16例，蕈伞型4例，缩窄型2例及浅表型1例。组织学分型：均为鳞状细胞癌，其中高分化(G1)7例，中等分化(G2)22例，低分化(G3)11例；其中有2例同时检测其局部淋巴结转移癌。40例中有癌旁粘膜供检测HPV感染效应者27例。另取无消化道疾病的尸检食管粘膜8例作正常对照。
, 百拇医药
二、癌旁粘膜组织观察方法
参照Toli等〔9〕HPV感染的子宫颈病变积分系统，观察食管癌旁粘膜上皮细胞的挖空细胞(Koilocytosis)、角化不全、基底细胞增生、上皮细胞不典型增生及湿疣性等病变。
三、基因组DNA提取
按Chen等〔7〕Chelex-100煮沸法略加修正，其程序为：括取石蜡包埋块中组织0.5mg～1mg置Ependoff氏管中，经二甲苯脱蜡、乙醇沉淀，抽真空干燥后加含5%Chelex-100的蒸馏水200μl煮沸30分钟，经1.0ml微型葡聚糖凝胶G-50过柱后收集到基因组DNA样品，用分光光度计吸收光谱260nm测吸光度，置-20℃贮存备用。
四、寡核苷酸引物和HPVDNA探针制备
, 百拇医药 参照Brule等〔8〕HPVDNA开放读码区框架(ORF)中高度保守区的E1基因区的总体引物寡核苷酸序列，经DNA合成仪(391型，Applied Biosystems公司)合成的一对引物正链GP1和负链GP2，经NH4OH脱盐纯化后抽真空浓缩蒸发，最后加100μl蒸馏水，测其浓度，置-20℃贮存。
GP-E1序列：
GP1+5′TGGTACAATGGGCATATGAT 3′
GP2-5 AATGGCTTTTGGAATTTACA 3′
DNA探针制备用常规溶菌酶碱变性法，从宿主菌中抽取质粒pBR322克隆的基因组DNA6、11、16和18型，以限制性内切酶salI切割分离探针，然后用透析袋电泳洗脱法回收HPVSDNA片段，经电泳检测确认回收片段长度、浓度和纯度后，置-20℃保存。
, 百拇医药
五、PCR扩增、Sorthern印迹和杂交
1μg模板DNA在总体积50μl含dNTP引物GP1和GP2及2.5u Taq DNA多聚酶等混合液中进行40循环周期反应。扩增产物10μl经琼脂糖凝胶电泳分析，在紫外光下观察拍照记录结果。
HPV6、11、16、18型4种探针各10ng，用DECA公司的随机引物DNA标记试剂盒，按程度与同位素32P进行标记。Southern印迹转膜后于高严紧型条件下预杂交，最后加入2×108cpm/μg的同位素标记探针进行杂交，48小时后洗膜及放射自显影，显示其杂增多信号。
结 果
一、GP-PCR检测HPV3DNA基因及其类型
, 百拇医药
40例食管癌基因组DNA经用GP引物介导的PCR技术，有24例(60%)在凝胶电泳中于444bp位置上显示出PCR扩增产物的清晰荧光带(图1)。经Southern印迹及转膜与HPVDNA探针6、11、16、18型进行杂交后，24例中显示出HPV6型DNA者12例(50%)，16型DNA者2例(8%)，6型和16型均阳性者4例(17%)，无杂交信号者6例(25%)(图1)。2例淋巴结转移癌标本中亦分别显示出与其原发癌一致的HPV6型和16型DNA阳性信号。杂交阳性信号强弱各例不一，HPV6型者较16型者为强。未发现11型和18型阳性病例。阳性对照组HPV6、11、16、18型DNA均获得扩增，显示出极强的阳性信号，阴性对照8例均未检出HPVDNA，呈阴性结果。
A、C为凝胶电泳，于444bp位置显示HPV16和6型DNA阳性荧光带。B、D为P32标记探针杂交后相应的阳性信号，M为λDNA标记物；V6和V16为PHPVDNA阳性对照；1～12，18为病例号，L为淋巴结转移癌
, http://www.100md.com
图1 GP-PCR检测HPVSDNA基因及类型
二、癌旁粘膜组织学变化
27例有癌旁粘膜组织标本中，16例为HPVDNA阳性，11例阴性。由附表中可见，16例HPVDNA阳性的癌旁粘膜组织中有挖空细胞者占38%(6/16，图2)；湿疣性病变者25%(4/16，图3)；11例HPVDNA阴性的癌旁粘膜组织中未出现挖空细胞，湿疣性病变者占10%(1/11)。经统计学t检验处理，挖空细胞在HPVDNA阳性与阴性标本中的差异有显著意义(P<0.05)，其余各种病变差异无显著意义(P>0.05)。
图2 癌旁粘膜湿疣性病变;基底细胞异型增生,浅层多量挖空细胞(↑),覆盖表面细胞过度化(△) HE×400
, 百拇医药
图3 癌旁粘膜湿疣性病变呈乳头状增生,基底细胞间变 HE×100
附表 27例食管癌癌旁粘膜组织病理变化 病理变化
HPV DNA+(n=16)
HPV DNA-(n=11)
例数
%
例数
%
挖空细胞
6
38
, 百拇医药
0
0
角化过度
12
75
10
91
湿疣性病变
4
25
1
9
炎症反应
14
, 百拇医药
88
11
100
单纯性增生
10
63
7
64
间变
Ⅰ级
11
69
6
55
, 百拇医药
Ⅱ级
4
25
3
27
Ⅲ级
1
6
2
18
*即乳头、扁平及内翻型
讨 论
食管癌病因至今未明，我国食管癌高发区林县流行病学调查报告，食管癌发生与某些营养素缺乏或含霉食物产生的亚硝酸胺致癌有关〔10〕。近年来病毒感染的发病学引起重视，此因素能较合理地解释食管癌发病的地区性分布特点。本研究应用最敏感的HPVORFE1区总体引物PG-E1介导的PCR技术，在食管癌手术切除标本中HPVDNA检出率为60%，这与其他食管癌高发区的食管癌症例中50%以上有HPV感染。
, 百拇医药
本组资料表明，福建地区食管癌组织中以HPV6型DNA为主，16型次之，但未发现HPV11和18型DNA，这与Chang等〔5〕所报道的食管癌组织中所检出的HPV，16和18型占12.7%有别。已知HPV16和18型是高危性致癌病毒DNA，可导致感染细胞的肿瘤性增生转化。HPV6或11型为低危性致癌病毒DNA，多在宫颈、喉乳头瘤等良性病变中检出，但也报道在宫颈癌或喉癌中存在〔11〕，提示HPV6或11型也具有潜在的致癌性或具有地区性分布特点。
食管癌旁粘膜组织病变与宫颈粘膜HPV感染效应一致，所以挖空细胞对食管HPV感染也同样具有诊断价值。有2例标本在原发癌和淋巴结转移癌中同时检出HPVDNA存在，进一步说明HPV感染与食管癌的发生关系密切，也证明整合于癌细胞中的HPV可由原发癌细胞携带进入体液循环而至远隔部位继续存在，提示HPV感染的癌瘤在肿瘤发生发展以及其临床生物学行为与预后等方面与无病毒性癌瘤有所不同，值得临床注意。
, 百拇医药
参考文献
1 Syrjanen KJ,Pyrhonen S,Aukee S,et al.Squamous cellpapilloma of the esophagus:a tumor probably caused by human papillomavirus(HPV).Diag Histopathol,1982,5∶291
2 Windler B,Capo N,Reumaun W,et al.Human papillomavirus infection of the esophagus.Cancer,1985,55∶149
3 Williamson AL,Jaskiesciz K,Gunning A,et al.The de.tection of human papillomavirus in esophageal lesions.Anti Cancer Res,1991,11∶263
, http://www.100md.com
4 Chang F,Shen Q,Zhou J,et al.Detection of human papillomavirus DNA in cytologic specimens derived from esophageal precancer lesions and cancer.Scand J Gastroenterol,1990,25∶383
5 Chang F,Syrjanen S,Shen Q,et al.Human papillomavirus(HPV)DNA in esophageal precancer lesions and squamous cellcarcinomas from China.Int J Cancer,1990,45∶21
6 Politoske EJ.Squamus papilloma of the esophagus asso-ciated with the human papillomavirus.Gastroenterology,1992,102∶668
, 百拇医药
7 Chen ML,Shieh YSC,Shim K-S,et al.Comparative studies on the detection of hepaitis Bvirus DNA in frozen and paraffin sections by the PCR.Mod Pathol,1991,4∶555
8 Adriaan JE,Brule VD,Snyders PJF,et al.General primer-mediated polyperase chain reaction permits the detection of sequenced and still unsequenced human papillomavirus genotypes in cervical scrapes and carcinomas.Imt J Cancer,1990,45∶644
9 Toki T,Yajima A."HPV Score"a scoring system for histological diagnosis of human papillomavirus infection in displasia of the uterine cervix.Acta Pathol Jpn,1987,37∶449
10 Yan CS.Research on esophageal cancer in China.A re-view.Cancer Res,1980,40∶2633
11 Hosshikawa T,Nakajima T,Uhara H,et al.Detection of human papillomavirus DNA in laryngeal squamous cell carcinomas by polymetase chain reaction.Laryngoscope,1990,100∶647
(收稿：1992-09-28 修回：1993-07-28), 百拇医药
单位：350004福州，福建医学院病理解剖学教研室(陈碧芬)；福建省知院(殷 虹)
关键词：食管肿瘤；乳头状瘤病毒；脱氧核糖核酸；聚合酶链反应
中华医学杂志931110 摘要 应用多聚酶链反应(PCR)技术，检测了福建地区40例食管癌标本中乳头瘤状病毒(HPV)DNA的存在及其类型。结果：HPVDNA阳性者占60%(24/40)，24例阳性标本中HPV6型DNA占50%(12/24)，16型DNA占8%(2/24)，6型和16型DNA同时阳性者占17%(4/24)，未知类型者25%(6/24)。2例淋巴结转移癌中也发现与其原发癌一致的HPVDNA类型。27例癌旁粘膜组织中亦见有HPV感染效应，其中以挖空细胞病变具有显著意义(P<0.05)。结果表明在食管癌高发区HPV有较高检出率，它与食管癌的发生有密切关系。
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食管乳头瘤或食管癌组织中有乳头瘤状病毒(HPV)DNA及其抗原存在〔1～8〕。为进一步探讨HPV与食管癌变的关系，我们对我国南部食管癌高发区——福建地区的食管癌手术标本，应用多聚酶链反应(PCR)及分子杂交技术，检测癌组织中HPVDNA的存在及其基因类型，并观察了HPV感染的癌旁粘膜形态学变化。
材料与方法
一、材料
食管癌手术标本40例，其中男35例，女5例，年龄21～68岁。标本按常规10%甲醛固定、石蜡包埋、切片、病理组织学观察。大体类型：溃疡型17例，浸润型16例，蕈伞型4例，缩窄型2例及浅表型1例。组织学分型：均为鳞状细胞癌，其中高分化(G1)7例，中等分化(G2)22例，低分化(G3)11例；其中有2例同时检测其局部淋巴结转移癌。40例中有癌旁粘膜供检测HPV感染效应者27例。另取无消化道疾病的尸检食管粘膜8例作正常对照。
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二、癌旁粘膜组织观察方法
参照Toli等〔9〕HPV感染的子宫颈病变积分系统，观察食管癌旁粘膜上皮细胞的挖空细胞(Koilocytosis)、角化不全、基底细胞增生、上皮细胞不典型增生及湿疣性等病变。
三、基因组DNA提取
按Chen等〔7〕Chelex-100煮沸法略加修正，其程序为：括取石蜡包埋块中组织0.5mg～1mg置Ependoff氏管中，经二甲苯脱蜡、乙醇沉淀，抽真空干燥后加含5%Chelex-100的蒸馏水200μl煮沸30分钟，经1.0ml微型葡聚糖凝胶G-50过柱后收集到基因组DNA样品，用分光光度计吸收光谱260nm测吸光度，置-20℃贮存备用。
四、寡核苷酸引物和HPVDNA探针制备
, 百拇医药 参照Brule等〔8〕HPVDNA开放读码区框架(ORF)中高度保守区的E1基因区的总体引物寡核苷酸序列，经DNA合成仪(391型，Applied Biosystems公司)合成的一对引物正链GP1和负链GP2，经NH4OH脱盐纯化后抽真空浓缩蒸发，最后加100μl蒸馏水，测其浓度，置-20℃贮存。
GP-E1序列：
GP1+5′TGGTACAATGGGCATATGAT 3′
GP2-5 AATGGCTTTTGGAATTTACA 3′
DNA探针制备用常规溶菌酶碱变性法，从宿主菌中抽取质粒pBR322克隆的基因组DNA6、11、16和18型，以限制性内切酶salI切割分离探针，然后用透析袋电泳洗脱法回收HPVSDNA片段，经电泳检测确认回收片段长度、浓度和纯度后，置-20℃保存。
, 百拇医药
五、PCR扩增、Sorthern印迹和杂交
1μg模板DNA在总体积50μl含dNTP引物GP1和GP2及2.5u Taq DNA多聚酶等混合液中进行40循环周期反应。扩增产物10μl经琼脂糖凝胶电泳分析，在紫外光下观察拍照记录结果。
HPV6、11、16、18型4种探针各10ng，用DECA公司的随机引物DNA标记试剂盒，按程度与同位素32P进行标记。Southern印迹转膜后于高严紧型条件下预杂交，最后加入2×108cpm/μg的同位素标记探针进行杂交，48小时后洗膜及放射自显影，显示其杂增多信号。
结 果
一、GP-PCR检测HPV3DNA基因及其类型
, 百拇医药
40例食管癌基因组DNA经用GP引物介导的PCR技术，有24例(60%)在凝胶电泳中于444bp位置上显示出PCR扩增产物的清晰荧光带(图1)。经Southern印迹及转膜与HPVDNA探针6、11、16、18型进行杂交后，24例中显示出HPV6型DNA者12例(50%)，16型DNA者2例(8%)，6型和16型均阳性者4例(17%)，无杂交信号者6例(25%)(图1)。2例淋巴结转移癌标本中亦分别显示出与其原发癌一致的HPV6型和16型DNA阳性信号。杂交阳性信号强弱各例不一，HPV6型者较16型者为强。未发现11型和18型阳性病例。阳性对照组HPV6、11、16、18型DNA均获得扩增，显示出极强的阳性信号，阴性对照8例均未检出HPVDNA，呈阴性结果。
A、C为凝胶电泳，于444bp位置显示HPV16和6型DNA阳性荧光带。B、D为P32标记探针杂交后相应的阳性信号，M为λDNA标记物；V6和V16为PHPVDNA阳性对照；1～12，18为病例号，L为淋巴结转移癌
, http://www.100md.com
图1 GP-PCR检测HPVSDNA基因及类型
二、癌旁粘膜组织学变化
27例有癌旁粘膜组织标本中，16例为HPVDNA阳性，11例阴性。由附表中可见，16例HPVDNA阳性的癌旁粘膜组织中有挖空细胞者占38%(6/16，图2)；湿疣性病变者25%(4/16，图3)；11例HPVDNA阴性的癌旁粘膜组织中未出现挖空细胞，湿疣性病变者占10%(1/11)。经统计学t检验处理，挖空细胞在HPVDNA阳性与阴性标本中的差异有显著意义(P<0.05)，其余各种病变差异无显著意义(P>0.05)。
图2 癌旁粘膜湿疣性病变;基底细胞异型增生,浅层多量挖空细胞(↑),覆盖表面细胞过度化(△) HE×400
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图3 癌旁粘膜湿疣性病变呈乳头状增生,基底细胞间变 HE×100
附表 27例食管癌癌旁粘膜组织病理变化 病理变化
HPV DNA+(n=16)
HPV DNA-(n=11)
例数
%
例数
%
挖空细胞
6
38
, 百拇医药
0
0
角化过度
12
75
10
91
湿疣性病变
4
25
1
9
炎症反应
14
, 百拇医药
88
11
100
单纯性增生
10
63
7
64
间变
Ⅰ级
11
69
6
55
, 百拇医药
Ⅱ级
4
25
3
27
Ⅲ级
1
6
2
18
*即乳头、扁平及内翻型
讨 论
食管癌病因至今未明，我国食管癌高发区林县流行病学调查报告，食管癌发生与某些营养素缺乏或含霉食物产生的亚硝酸胺致癌有关〔10〕。近年来病毒感染的发病学引起重视，此因素能较合理地解释食管癌发病的地区性分布特点。本研究应用最敏感的HPVORFE1区总体引物PG-E1介导的PCR技术，在食管癌手术切除标本中HPVDNA检出率为60%，这与其他食管癌高发区的食管癌症例中50%以上有HPV感染。
, 百拇医药
本组资料表明，福建地区食管癌组织中以HPV6型DNA为主，16型次之，但未发现HPV11和18型DNA，这与Chang等〔5〕所报道的食管癌组织中所检出的HPV，16和18型占12.7%有别。已知HPV16和18型是高危性致癌病毒DNA，可导致感染细胞的肿瘤性增生转化。HPV6或11型为低危性致癌病毒DNA，多在宫颈、喉乳头瘤等良性病变中检出，但也报道在宫颈癌或喉癌中存在〔11〕，提示HPV6或11型也具有潜在的致癌性或具有地区性分布特点。
食管癌旁粘膜组织病变与宫颈粘膜HPV感染效应一致，所以挖空细胞对食管HPV感染也同样具有诊断价值。有2例标本在原发癌和淋巴结转移癌中同时检出HPVDNA存在，进一步说明HPV感染与食管癌的发生关系密切，也证明整合于癌细胞中的HPV可由原发癌细胞携带进入体液循环而至远隔部位继续存在，提示HPV感染的癌瘤在肿瘤发生发展以及其临床生物学行为与预后等方面与无病毒性癌瘤有所不同，值得临床注意。
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参考文献
1 Syrjanen KJ,Pyrhonen S,Aukee S,et al.Squamous cellpapilloma of the esophagus:a tumor probably caused by human papillomavirus(HPV).Diag Histopathol,1982,5∶291
2 Windler B,Capo N,Reumaun W,et al.Human papillomavirus infection of the esophagus.Cancer,1985,55∶149
3 Williamson AL,Jaskiesciz K,Gunning A,et al.The de.tection of human papillomavirus in esophageal lesions.Anti Cancer Res,1991,11∶263
, http://www.100md.com
4 Chang F,Shen Q,Zhou J,et al.Detection of human papillomavirus DNA in cytologic specimens derived from esophageal precancer lesions and cancer.Scand J Gastroenterol,1990,25∶383
5 Chang F,Syrjanen S,Shen Q,et al.Human papillomavirus(HPV)DNA in esophageal precancer lesions and squamous cellcarcinomas from China.Int J Cancer,1990,45∶21
6 Politoske EJ.Squamus papilloma of the esophagus asso-ciated with the human papillomavirus.Gastroenterology,1992,102∶668
, 百拇医药
7 Chen ML,Shieh YSC,Shim K-S,et al.Comparative studies on the detection of hepaitis Bvirus DNA in frozen and paraffin sections by the PCR.Mod Pathol,1991,4∶555
8 Adriaan JE,Brule VD,Snyders PJF,et al.General primer-mediated polyperase chain reaction permits the detection of sequenced and still unsequenced human papillomavirus genotypes in cervical scrapes and carcinomas.Imt J Cancer,1990,45∶644
9 Toki T,Yajima A."HPV Score"a scoring system for histological diagnosis of human papillomavirus infection in displasia of the uterine cervix.Acta Pathol Jpn,1987,37∶449
10 Yan CS.Research on esophageal cancer in China.A re-view.Cancer Res,1980,40∶2633
11 Hosshikawa T,Nakajima T,Uhara H,et al.Detection of human papillomavirus DNA in laryngeal squamous cell carcinomas by polymetase chain reaction.Laryngoscope,1990,100∶647
(收稿：1992-09-28 修回：1993-07-28), 百拇医药